Name: 筛选癌细胞中的离子通道 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: 了解离子通道在癌细胞中的功能及其调控机制，探索GABAA受体激活剂对肿瘤生长的抑制作用。本方法为开发新型癌症治疗策略提供重要实验依据。

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作者感谢Thomas E. &amp;#38; Pamela M. Mischell家族基金会对S.S.的支持，以及Harold C. Schott基金会对S.S.在UC医学院设立的Harold C. Schott讲席教授职位的资助。

Pharmacological Targeting of Ion Channels to Treat Solid Tumors

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D.A.P.K. 是 Amlal Pharmaceuticals Inc. 的联合创始人、总裁兼首席执行官。S.S. 是 Amlal Pharmaceuticals Inc. 的联合创始人，并担任 Bexion Pharmaceuticals, Inc. 药物安全监测委员会成员。

离子通道功能的改变会影响细胞内信号级联反应，从而影响细胞的整体功能。在过去十年中，人们越来越清楚地认识到，离子通道在癌细胞的生长和转移过程中具有重要作用。重要的是，许多离子通道是已获批治疗多种疾病的药物的主要靶点24。研究人员已开始探索离子通道是否可作为抗癌治疗的靶点，初步结果令人鼓舞2,16,25。目前，该领域才刚刚开始探究离子通道在癌症发生发展及作为治疗靶点方面的作用，而这两个方向的前景均十分广阔。
本文提供了分析癌细胞中离子通道并确定该通道是否为治疗靶点的详细步骤。这些实验方法可作为研究癌细胞中离子通道的指导。文中描述了多种方法，包括癌细胞中离子通道的可视化、离子通道调控对癌细胞极化状态影响的测定、利用电生理学分析离子通道功能的不同策略，以及癌细胞存活能力的检测。
免疫荧光染色可用于检测离...

膜转运蛋白对于细胞间的通讯以及维持细胞稳态至关重要。在各类膜转运蛋白中，离子通道能够驱动细胞的生长与发育，并帮助细胞在复杂多变的环境中维持其正常状态。已有研究报道，离子通道在系统性肿瘤以及中枢神经系统（CNS）肿瘤的发生和发展过程中也发挥着推动和支持作用1,2。例如，KCa3.1通道参与调控膜电位和细胞体积，这在细胞周期调控中具有重要意义。研究表明，功能异常的KCa3.1通道可导致肿瘤细胞异常增殖3。此外，离子通道还可能促进癌症的转移扩散。以瞬时受体电位（TRP）通道为例，其介导Ca2+和Mg2+的内流，这种离子内流可激活多种激酶和热休克蛋白，进而调控肿瘤周围细胞外基质的结构与功能，从而在启动癌症转移过程中发挥重要作用4。
由于离子通道可能参与癌症的发生发展，因此它们也可能成为抗癌药物治疗的靶点。例如，对包括化疗和新型免疫治疗在内的治疗方式产生耐药性，与离子通道功能失调有关5,6,7。此外，离子通道正逐渐成为抑制癌症生长和发展的关键药物靶点，目前已有研究在评估已获批的小分子药物（FDA批准）的再利用，以及包括单克隆抗体在内的生物大分子药物1,2,8,9。尽管在此领域已取得诸多进展，但针对离子通道的抗癌药物研发仍处于相对初级阶段。部分原因在于研究癌细胞中离子通道所面临的独特挑战。例如，在建立电生理检测方法时，对于作用较慢的化合物，以及通道激活与药物作用之间的时间差异，存在技术上的局限性。此外，化合物的溶解度也可能阻碍研究进展，因为目前常用的大多数自动化电生理系统使用疏水性基质，可能导致化合物吸附而产生假象。进一步地，天然产物、多肽和单克隆抗体等大分子生物有机治疗药物，使用传统电生理检测方法进行筛选在技术上也具有挑战性10。最后，癌细胞的生物电特性仍远未被充分理解11。
同时，离子通道的免疫荧光染色通常具有挑战性。部分原因在于离子通道结构的复杂性及其在膜中的存在环境，这些因素会影响用于显微镜研究的抗体的制备和使用。尤其重要的是，用于染色离子通道的抗体必须经过特异性、亲和力和可重复性的验证。针对离子通道的商业抗体应根据其验证策略和已发表文献记录进行评估。实验中应包含阴性对照，以通过靶蛋白的敲低或敲除来证明不存在非特异性结合。或者，也可使用基于mRNA或蛋白质检测结果确定不含或极少表达靶蛋白的细胞系作为阴性对照。例如，本研究展示了γ-氨基丁酸（GABA）受体&#160;亚基Gabra5在髓母细胞瘤细胞系（D283）中的定位。对D283细胞进行siRNA敲低处理，并使用另一种小脑髓母细胞瘤细胞系Daoy&#160;细胞进行Gabra5染色，均未观察到明显染色信号（数据未显示）。
本文介绍了分析离子通道功能以及离子通道调节剂对癌细胞作用的方法。所提供的实验方案包括：（1）对细胞中的离子通道进行染色，（2）检测线粒体的极化状态，（3）利用电生理学技术鉴定离子通道功能，以及（4） 体外 药物验证。这些方案强调对A型γ-氨基丁酸（GABA）的研究A受体2,12,13,14,15,16一种氯离子通道和主要的抑制性神经递质受体。然而，本文所述方法同样适用于研究其他多种癌细胞和离子通道。

<table><tbody><tr><td>ABS SpectraMax 酶标仪</td><td>Molecular Devices</td><td>ABS</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Invitrogen</td><td>00-4555-56</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A32723</td><td>山羊抗兔</td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌剂</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>100倍</td></tr><tr><td>B27 添加剂</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td>不含维生素A</td></tr><tr><td>生物安全柜</td><td>LABCONCO</td><td>302381101</td><td>II级，A2型</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1606-100</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-998-211</td><td>Heracell VIOS 160i</td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Fisher Scientific</td><td>C7902</td><td>二水合物</td></tr><tr><td>细胞培养皿，150 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-600-004</td><td>细胞培养处理</td></tr><tr><td>细胞培养瓶，75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>430641U</td><td>细胞培养处理</td></tr><tr><td>细胞培养板，6孔</td><td>Fisher Scientific</td><td>353046</td><td>细胞培养处理</td></tr><tr><td>细胞培养板，96孔</td><td>Fisher Scientific</td><td>353072</td><td>细胞培养处理</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>EP-5804R</td><td>带制冷功能</td></tr><tr><td>Corning CoolCell</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-210-0006</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片，22 × 22 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-553-450</td><td>Corning品牌</td></tr><tr><td>D283 Med</td><td>ATCC</td><td>HTB-185</td><td></td></tr><tr><td>DABCO 封片剂</td><td>EMS</td><td>17989-97</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>D9434</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td>细胞培养级</td></tr><tr><td>DMEM/F12 基础培养基</td><td>Fisher Scientific</td><td>11330-032</td><td>含酚红</td></tr><tr><td>DMEM/F12，无酚红</td><td>Fisher Scientific</td><td>21041-025</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>表皮生长因子</td><td>STEMCELL</td><td>78006.1</td><td></td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Abcam</td><td>AB120081</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清，经鉴定</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>碱性成纤维细胞生长因子</td><td>Millipore</td><td>GF003</td><td></td></tr><tr><td>GARBA5 抗体</td><td>Aviva</td><td>ARP30687_P050</td><td>兔多克隆抗体</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>甘油封片剂</td><td>EMS</td><td>17989-60</td><td>含DAPI和DABCO</td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Millipore Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>STEMCELL</td><td>7980</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>HyClone</td><td>SH3023701</td><td>溶液</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td>固体</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>开放平台</td><td></td><td>含Fiji插件</td></tr><tr><td>Immuno Mount DAPI</td><td>EMS</td><td>17989-97</td><td></td></tr><tr><td>KRM-II-08</td><td></td><td></td><td>实验化合物，无法从商业渠道获得</td></tr><tr><td>Leica Application Suite X</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>白血病抑制因子</td><td>Novus</td><td>N276314100U</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9272</td><td>六水合物</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Leica</td><td>SP8</td><td></td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>VWR</td><td>76382-982</td><td>DMiL 倒置显微镜</td></tr><tr><td>MTS - Promega 一步法试剂</td><td>Promega</td><td>G3581</td><td></td></tr><tr><td>多通道移液器，0.5–10 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>Z683914</td><td></td></tr><tr><td>多通道移液器，10–100 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>Z683930</td><td></td></tr><tr><td>多通道移液器，30–300 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>Z683957</td><td></td></tr><tr><td>Nest-O-Patch</td><td>Heka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal-A 培养基</td><td>Gibco</td><td>10888022</td><td>不含维生素A</td></tr><tr><td>Neurobasal-A 培养基</td><td>Gibco</td><td>12348-017</td><td>无酚红</td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>NOR-QH-II-66</td><td></td><td></td><td>实验化合物，无法从商业渠道获得</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-998-944</td><td>4英寸宽</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>EMS</td><td>RT-15710</td><td></td></tr><tr><td>PATHCHMASTER</td><td>Heka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>灌流系统</td><td>Nanion</td><td>4000120</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>EMS</td><td>RT-15710</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ75889K2</td><td>试剂级</td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>A3890401</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Port-a-Patch</td><td>Nanion</td><td>21000072</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>一抗</td><td>Invitrogen</td><td>MA5-34653</td><td>兔单克隆抗体</td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>丙泊酚</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0758676</td><td>1 mL 安瓿</td></tr><tr><td>QH-II-66</td><td></td><td></td><td>实验化合物，无法从商业渠道获得</td></tr><tr><td>试剂储液槽</td><td>VWR</td><td>89094-664</td><td>无菌</td></tr><tr><td>载玻片，75 × 25 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-7</td><td>单面磨砂</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Corning</td><td>25-035-Cl</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Synth-a-Freeze 冷冻保存培养基</td><td>Gibco</td><td>R00550</td><td>用于冷冻保存</td></tr><tr><td>TMRE</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-196-4741</td><td>试剂</td></tr><tr><td>TMRE 试剂盒</td><td>Abcam</td><td>AB113852</td><td>试剂盒</td></tr><tr><td>吐温X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>NC0704309</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Gibco</td><td>15-250-061</td><td>溶液，0.4%</td></tr><tr><td>胰蛋白酶/EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td>溶液，0.25%</td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>VWR</td><td>97043-562</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 滤纸</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-927-841</td><td></td></tr></tbody></table>

癌症细胞中离子通道的筛选

Screening Ion Channels in Cancer Cells

离子通道对于细胞发育和维持细胞稳态至关重要。离子通道功能的紊乱可导致多种疾病或通道病的发生。癌细胞利用离子通道促进自身的发育，增强肿瘤的形成能力，并适应包含多种非癌细胞的微环境。此外，肿瘤微环境中生长因子和激素水平的升高可导致离子通道表达增加，从而促进癌细胞的增殖与存活。因此，药理学上靶向离子通道可能是一种治疗实体恶性肿瘤（包括原发性和转移性脑癌）的有前景的策略。本文描述了用于表征癌细胞中离子通道功能的实验方案，以及分析离子通道调节剂对其癌细胞存活力影响的方法。这些方法包括对细胞进行离子通道染色、检测线粒体的极化状态、利用电生理技术确定离子通道功能，以及开展细胞活力检测以评估药物效力。

上述为可用于表征癌细胞中离子通道的部分实验步骤。第一个方案重点介绍了离子通道的染色方法。如文中所述，在对位于细胞外膜的离子通道或任何其他蛋白质进行染色时，存在诸多技术挑战。图中所示为 图1 是五聚体 GABA 受体亚基的染色A 受体。第二个方案重点展示了对癌细胞中线粒体极化状态的检测结果。线粒体在细胞存活与增殖以及细胞死亡过程中发挥着关键作用。在哺乳动物细胞中，当细胞受到应激刺激时，线粒体通过释放位于内膜与外膜之间的Bcl-2家族蛋白来激活凋亡过程。这些Bcl-2家族蛋白在细胞质中进一步激活caspase蛋白酶，从而介导程序性细胞死亡。细胞膜离子通道功能的改变可导致细胞内离子稳态失衡，包括线粒体内离子水平的变化，进而引起膜电位的丧失，最终触发细胞凋亡。14. Ca水平2+，K+，Na+，和 H+ 是信号传导事件中的重要决定因素，可触发线粒体启动的细胞死亡。如图所示 图2</stro...

靶向离子通道的药物干预是治疗实体瘤的一种有前景的策略。本文提供了详细的操作方案，用于表征癌细胞中离子通道的功能，并检测离子通道调节剂对癌细胞存活力的影响。

离子通道对于细胞发育和维持细胞稳态至关重要。离子通道功能的紊乱与多种疾病的发生发展相关……

离子通道的功能在细胞生物学中至关重要，并显著影响癌症的生长。我们的团队致力于以离子通道为靶点，以辅助癌症治疗。近年来，该领域对肿瘤微环境以及癌细胞如何在健康组织中定植有了更深入的理解，凸显了离子通道在癌症中的重要性。目前实验面临的最大挑战之一是缺乏可用的免疫活性动物模型，以有效测试治疗方法。我们已证实GABAA受体是多种癌症的治疗靶点脆弱环节，并鉴定出一类新型GABAA受体激活剂，可有效抑制癌细胞。离子通道在调控癌细胞行为中发挥关键作用，作为癌症治疗的靶点具有巨大潜力。我们的研究强调了如何有效利用一类已确立的药物来治疗癌症。首先，将细胞培养于75平方厘米的培养瓶中。吸除培养基，用不含钙和镁的PBS缓冲液冲洗细胞。接下来，加入2毫升0.25%胰蛋白酶-EDTA以分离贴壁细胞。室温孵育5分钟，然后将细胞重悬于10毫升培养基中。随后，将细胞从培养瓶中收集至15毫升离心管，于室温下以480×g离心5分钟，并吸除上清培养基。根据原培养物的汇合度，将细胞重悬于5至10毫升培养基中。取100微升细胞悬液，加入含有100微升0.4%台盼蓝的1.5毫升离心管中。将细胞加入血细胞计数板，在显微镜下观察，并使用手动计数器进行计数。将细胞用不含酚红的培养基稀释至每毫升3 × 10⁴个细胞。按照生产商说明，将2.5毫升细胞悬液加入预先用多聚-D-赖氨酸包被盖玻片的6孔板中每个孔内。在37°C、5% CO₂的湿润培养箱中培养过夜，以使细胞贴附于盖玻片上。第二天，在倒置显微镜下使用20倍物镜观察细胞贴壁情况。配制所需浓度的处理用储备液，并设置仅含培养基的对照组、与受试化合物浓度相匹配的溶剂对照组，以及含有离子载体FCCP和受试化合物的对照组。每次处理一个盖玻片，向细胞中加入1.8毫升对应实验条件的培养基。将经对照化合物或待测化合物处理的细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳的湿润环境中，孵育所需时间。处理结束后，向细胞中加入200微升10倍浓度的TMRE。在37摄氏度、5%二氧化碳的湿润环境中继续孵育15至30分钟。轻轻吸去培养基，并用 PBS 清洗细胞两次，以尽量减少背景干扰。然后将盖玻片倒置在已标记处理条件的显微镜载玻片上。在 549 纳米激发光和 575 纳米发射光下对活细胞进行成像。使用共聚焦显微镜在细胞完整性丧失之前快速采集多个Z轴层扫图像。保存图像文件以供后续分析。具有活性线粒体的细胞保留了TMRE染色，并显示出强荧光。去极化或失活的线粒体膜电位降低，无法保留TMRE，且荧光信号较弱。首先，将细胞接种于不含抗生素且不含HEPES缓冲液的培养基中，每孔75微升，用于测定IC50。第二天，通过高浓度储备液的系列稀释，制备对照溶液和待测溶液。将对照溶液和待测溶液加入细胞后，在37摄氏度、5%二氧化碳的湿润环境中孵育细胞48小时。在实验第三天开始细胞增殖检测，首先将MTS试剂涡旋振荡，以充分溶解任何已沉淀的试剂，再进行后续使用。将解冻后的MTS试剂转移至无菌的25毫升试剂储液槽中。向含有样品和100微升培养基的96孔板的每个孔中加入20微升MTS试剂。在37°C、5% CO₂的湿润环境中孵育1至4小时。随后在室温下离心，以去除可能干扰吸光度读数的气泡。使用酶标仪或分光光度计在490纳米处测定吸光度。图示为采用MTS法检测不同药物浓度下的比色结果的96孔板。剂量反应曲线显示，该受试药物以剂量依赖性方式抑制癌细胞的活力。

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癌症研究

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一种可量化且低成本的无细胞荧光方法，用于验证新型化合物的铁螯合能力

了解离子通道在癌细胞中的功能及其调控机制，探索GABAA受体激活剂对肿瘤生长的抑制作用。本方法为开发新型癌症治疗策略提供重要实验依据。

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