Name: mtHyPer7（一种用于线粒体过氧化物的比例生物传感器）在活酵母细胞中的成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T12:55:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: 了解使用mtHyPer7生物传感器在活酵母细胞中进行线粒体过氧化氢成像的方法。该技术利用荧光显微镜定量检测Saccharomyces cerevisiae中的活性氧水平，为研究线粒体质量控制与细胞衰老机制提供可靠工具。

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作者感谢 Katherine Filpo Lopez 提供的专业技术协助。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）授予 LP 的资助项目（GM122589 和 AG051047）支持。
这些研究使用了哥伦比亚大学赫伯特·欧文综合癌症中心的共聚焦和特种显微镜共享资源，部分资金来自美国国立卫生研究院/国家癌症研究所癌症中心支持基金 P30CA013696。

Imaging of Mitochondrial Peroxide in Living Yeast Cells Using mtHyper7

作者声明不存在利益冲突。

本方案描述了一种利用mtHyPer7作为生物传感器，在活体&#160;出芽酵母细胞中检测线粒体H2O2的方法。该生物传感器采用基于CRISPR的方法构建，并插入酵母基因组中一个保守的无基因区域，无需使用可筛选标记。与质粒携带的生物传感器相比，整合型传感器在所有细胞中表达且表达水平一致，可提供更可靠的定量结果。在构建表达mtHyPer7的细胞时未使用可筛选标记，因此可适用于更广泛的菌株背景，并便于对表达生物传感器的细胞进行遗传改造。mtHyPer7蛋白可被准确靶向至线粒体，且对线粒体形态、功能、分布或细胞生长速率无明显影响。mtHyPer7对外源添加的H2O2表现出剂量依赖性响应。此外，mtHyPer7能够在亚细胞分辨率水平上报导线粒体质量的异质性。最后，与宽场显微镜相比，使用转盘共聚焦显微镜对靶向线粒体的生物传感器进行成像，可减少荧光团的光漂白，并生成高分辨率图像，用于分析亚细胞结构的差异。
局限性与替代方法 
该方法不适用于超过 10 分钟的细胞成像，因为细胞在盖玻片下会逐渐干燥。对于长期成像，建议采用琼脂垫法46，或在装有 SC 培养基的玻璃底培养皿中固定细胞。
生物传感器的选择应根据实验条件下目标分子的浓度来决定。如果HyPer7的灵敏度过高，建议选用其他版本的HyPer，例如HyPer3或HyPerRed47,48。但需要注意的是，其他HyPer探针对pH更敏感。若需要更高的灵敏度，基于过氧还蛋白的roGFP可能更为合适（roGFP2Tsa2ΔCR）27。
H2O2 传感器的氧化稳态与氧化速率和还原速率均相关。生物传感器的氧化速率主要由 H2O2 引起，而还原速率则取决于细胞和细胞器中活跃的抗氧化还原系统。已有研究表明，在酵母细胞质中，HyPer7 主要由硫氧还蛋白系统还原，其还原速度比 roGFP2Tsa2ΔCR27 更快。因此，在解读 H2O2 生物传感器测量结果时，应考虑探针不同的还原机制和响应动力学。特别是，若要从生物传感器信号推断 H2O2 水平，必须假设实验过程中还原系统的还原能力保持恒定。除本文所述脚本外，目前已有多种其他软件被免费提供用于氧化还原传感器的分析49。
关键步骤 
对于任何生物传感器，关键是要证明该生物传感器本身不会影响所测量的过程。因此，比较每种实验条件下菌株的生长情况和线粒体形态非常重要。此处使用 MitoTracker Red 评估线粒体形态，该染料以膜电位依赖的方式对线粒体进行染色。然而，也可以通过使用四甲基罗丹明甲酯（TMRM）——另一种可感应膜电位的线粒体活体染料，或使用 MitoTracker Green——一种不依赖膜电位的线粒体染料，对未转化细胞和携带生物传感器的转化细胞中的线粒体进行比较。如果怀疑存在有害效应，降低表达水平或改变整合位点可能有助于缓解问题。
验证探针的剂量-反应行为以及成像技术的信噪比，对于获得可靠结果同样至关重要。如果组内变异程度超过组间变异程度，则难以检测到组间差异。组内变异可能源于真实的群体差异，也可能来自检测过程中的噪声。提高信噪比的关键步骤包括图像采集（像素值范围和噪声）、背景扣除以及阈值设定。
在计算步骤中也可以减少噪声的影响。最直接的方法是从比率图像测量值（Results.csv）中计算加权平均强度，其中每个像素代表局部激发效率之间的比率。这将生成一个&#34;逐像素&#34;比率。然而，如果图像的信噪比较低，则可以通过分别对分子和分母通道中的感兴趣区域（ROI）计算加权平均强度，再计算这两个加权平均值之间的比率，从而获得更稳健的结果（&#34;逐区域&#34;比率）。
为了选择一种阈值分割方法，可以使用 Fiji 命令 图像 | 调整 | 自动阈值 来自动尝试所有 Fiji 内置的阈值方法。为了评估分割（阈值）效果，可将已保存的掩膜通过点击 编辑 | 选择 | 创建选区 转换为选区，然后添加到 ROI 管理器（按 T 键），并将其激活应用于原始图像文件。如果线粒体未被充分检测到，则应尝试不同的分割方法。
在比较图像时，必须在相同的成像条件下获取所有图像，并以相同的对比度增强方式显示所有图像。
在优化成像条件时，必须考虑线粒体的运动。如果线粒体在405 nm和488 nm激发之间发生显著移动，则比值成像将不准确。建议曝光时间保持在&#60;500 ms，并通过最快可用的方法切换激发光（例如触发脉冲或声光可调滤波器）。在采集Z轴层叠图像时，应在移动到下一个Z轴步进前，完成每个Z轴层面的两种激发。
在结果的显示中，色调（颜色）的变化比强度的变化更易被人类眼睛察觉。因此，将比值转换为颜色标尺，以便更直观地进行视觉解读。着色图像可以是非调制的，即所有线粒体像素以相同的亮度显示；也可以是强度调制的，即使用原始图像中的像素强度来设定着色图像中的像素强度。
修饰与故障排除 
作为通过百草枯处理来验证线粒体功能的替代方法，可将细胞进行影印接种或接种至可发酵与不可发酵的碳源中。
用于背景扣除，滚动球扣除（通过导航至 处理 | 减去背景…)&#160;也可用于消除照明不均匀性。应确保细胞的存在不会改变被减去的背景（通过勾选相应选项来验证这一点） 创建背景 并检查结果。
总之，mtHyPer7探针提供了一种稳定且微创的方法，可用于关联活细胞中酵母线粒体的形态学与功能状态，并能够在遗传操作简便且易于获取的模式系统中研究一种重要的细胞应激因子和信号分子。

线粒体是真核细胞中至关重要的细胞器，以其通过氧化磷酸化和电子传递产生ATP的功能而广为人知1。此外，线粒体还参与钙离子储存、脂质、氨基酸、脂肪酸以及铁硫簇的合成，并在信号转导中发挥重要作用2,3。在细胞内，线粒体形成具有特定形态和分布的动态网络，其结构随细胞类型和代谢状态而变化。此外，尽管线粒体能够发生融合与分裂，但细胞内的线粒体并非完全等同。大量研究已证实，单个细胞内的线粒体在膜电位和氧化状态等功能特性上存在异质性4,5,6。这种功能差异部分源于线粒体自身受到的损伤，包括线粒体DNA（mtDNA）突变（其突变率高于核DNA）以及线粒体内外产生的活性氧（ROS）所导致的氧化损伤7,8,9。细胞通过线粒体质量控制机制来减轻这些损伤，这些机制可修复损伤或清除无法修复的受损线粒体10。
过氧化氢（H2O2）是一种活性氧，可导致细胞蛋白质、核酸和脂质发生氧化损伤。然而，H2O2 也可作为信号分子，通过可逆地氧化靶蛋白中的硫醇基团来调控细胞活动11,12。H2O2 可由线粒体电子传递链中泄漏的电子以及特定酶（如 NADPH 氧化酶和单胺氧化酶）产生13,14,15,16,17,18,19,20。同时，它也可被抗氧化系统（包括硫氧还蛋白和谷胱甘肽系统）所清除21,22,23。因此，分析线粒体中 H2O2 的水平对于理解该代谢物在正常线粒体和细胞功能以及氧化应激条件下的作用至关重要。
本实验方案的总体目标是检测线粒体H2O2 使用一种基因编码的比率型 H2O2 生物传感器 HyPer7，靶向定位于细胞器（mtHyPer7）。mtHyPer7 是一种嵌合体，包含来自线粒体的信号序列 ATP9 （Su9前序列），绿色荧光蛋白（GFP）的一种环状重排形式，以及H2O2OxyR 蛋白的结合域 Neisseria meningitidis24 (图1）。在环状重排的GFP中，天然GFP的N端和C端被融合，而在发色团附近形成新的末端，这使得蛋白质具有更高的灵活性，以及相较于天然GFP更不稳定的光谱特性25. mtHyPer7的OxyR结构域与H的相互作用2O2 具有高亲和力，H2O2选择性，并导致保守的半胱氨酸残基发生可逆氧化及二硫键的形成。OxyR 氧化所引发的构象变化会传递至 mtHyPer7 中的环状重排绿色荧光蛋白，从而使 mtHyPer7 发色团在还原状态下的激发最大值由 405 nm 发生光谱偏移&#160;488 nm 在 H2O2-氧化态26因此，mtHyPer7 在 488 nm 与 405 nm 激发下的荧光强度比值反映了探针对 H₂O₂ 的氧化程度2O2.
理想情况下，生物传感器应能够实时、绝对且定量地检测其目标分子。然而，在实际测量中，这并不总是可行的。以氧化还原传感器为例，如 mtHyPer7，其实时信号读数会受到二硫键还原速率的影响。活性氧生物传感器所依赖的还原系统各不相同，这些差异会显著改变探针的响应动力学——这一点已在酵母细胞质中通过 HyPer7（由硫氧还蛋白系统还原）与 roGFP2-Tsa2ΔCR（由谷胱甘肽还原）的比较中得到证实27。因此，若要根据 mtHyPer7 的比值推断相对 H2O2 浓度，必须假设实验过程中还原系统的还原能力保持恒定。尽管存在上述限制，HyPer7 及相关探针仍已被广泛应用于多种研究场景，以获取活细胞内 H2O2 的相关信息25,28,29。
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig01.jpg" /> 
图1设计、分子机制及H的激发/发射光谱2O2 生物传感器 mtHyPer7 (AmtHyPer7 探针是通过将环状重排的 GFP 插入来自 OxyR-RD 结构域而获得的 脑膜炎奈瑟菌. 它包含来自ATP合酶亚基9的线粒体靶向序列 Neurospora crassa (Su9). (B) H 的示意图2O2-mtHyPer7 的感应机制。RD 结构域中的半胱氨酸被氧化后，在 488 nm 激发下的荧光发射增强，而在 405 nm 激发下的发射减弱。C) HyPer7在氧化态和还原态下的激发光谱和发射光谱。本图经Pak等授权转载。24缩写：GFP = 绿色荧光蛋白；cpGFP = 环状重排绿色荧光蛋白。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
这种对 mtHyPer7 的比率成像在定量线粒体 H2O2 方面具有重要优势24,27；它可提供探针浓度的内部对照。此外，H2O2 刺激引起的激发峰位移即使在 H2O2 饱和浓度下也不完全。因此，比率成像可通过在分析中整合两个光谱点来提高检测灵敏度。
本文所使用的mtHyPer7探针对于H2O2具有很高的亲和力，且对pH的敏感性相对较低24，并已成功靶向至Caenorhabditis elegans的线粒体30。该蛋白也已在酵母中得到应用27,31。然而，以往的研究依赖于质粒介导的mtHyPer7表达，这会导致探针在细胞间的表达水平存在差异27。此外，本实验方案中描述的构建体通过基于CRISPR的方法整合到X染色体上一个保守的、无基因区域中，实现无标记整合32。整合后的生物传感器基因由强组成型TEF1启动子驱动表达（图2）。因此，与使用质粒表达的生物传感器相比，酵母细胞群体中该生物传感器的表达更加稳定且一致，携带该生物传感器的细胞无需选择性培养基即可持续传代。
<img alt="图 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig02.jpg" /> 
图 2：通过 CRISPR 生成表达 mtHyPer7 的细胞。 将含有 Cas9 和 sgRNA 的质粒（YN2_1_LT58_X2site）与通过 PCR 扩增获得的含 mtHyPer7 生物传感器构建体，利用乙酸锂转化法导入酿酒酵母细胞中。染色体 X 上的无基因插入位点（X2）被 Cas9 蛋白在 sgRNA 引导下识别并切割，生物传感器通过同源重组整合到基因组中。通过显微镜筛选、菌落 PCR 和测序鉴定成功转化的菌株后，通过在非选择性培养基中培养去除 Cas9 质粒（消除质粒）。缩写：sgRNA = 单链引导 RNA；TEF = 转录增强因子。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
最后，mtHyPer7 相较于其他活性氧生物传感器具有多项优势。例如，用于检测活性氧的有机染料（如二氢乙啶 [DHE]2 和 MitoSOX3）可能产生不均匀或非特异性的染色，且通常需用乙醇或二甲基亚砜等溶剂递送，因此需要额外设置溶剂效应的对照组。另一类活性氧生物传感器是基于荧光共振能量转移（FRET）的传感器（如用于细胞氧化还原状态的 Redoxfluor4，以及过氧化物传感器 HSP-FRET5、OxyFRET6 和 PerFRET6）。这类探针为基因编码，理论上具有高灵敏度，并可通过已明确的线粒体信号序列实现对线粒体的定量靶向。然而，FRET 基探针在使用中存在一些挑战，包括因交叉激发和荧光串扰导致的背景干扰，以及 FRET 发生对荧光基团之间距离和取向的严格要求33,34。此外，FRET 探针包含两个荧光蛋白，相较于光谱位移型探针，其在目标细胞中表达所需的构建体更大。本文所述方案旨在充分利用基于 HyPer7 的生物传感器的优势，利用这一紧凑、可比率检测、高亲和力、基因编码的探针，对活酵母细胞中线粒体内的过氧化物进行定量成像。

<table><tbody><tr><td>100x/1.45 Plan Apo Lambda 物镜</td><td>尼康</td><td>MRD01905</td><td></td></tr><tr><td>硫酸腺嘌呤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9126</td><td></td></tr><tr><td>Bacto 琼脂</td><td>BD Difco</td><td>DF0145170</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>BD Difco</td><td>DF0118170</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>BD Difco</td><td>DF211705</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物（Bacto）</td><td>BD Difco</td><td>DF0127179</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>BglII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0144S</td><td></td></tr><tr><td>羧苄西林</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1389</td><td></td></tr><tr><td>卡尔·蔡司 Immersol 浸油</td><td>卡尔·蔡司</td><td>444960</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖（D-(+)-葡萄糖）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>E. cloni 10G 化学感受态细胞</td><td>Bioserch Technologies</td><td>60108</td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td>美国国立卫生研究院</td><td></td><td>Schindelin 等，2012</td></tr><tr><td>G418（遗传霉素）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1720</td><td></td></tr><tr><td>GFP发射滤光片</td><td>色度</td><td></td><td>525/50</td></tr><tr><td>吉布森组装</td><td>New England Biolabs</td><td>E2611</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism 7</td><td>GraphPad</td><td></td><td>https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; （稳定）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>HO-pGPD-mito-roGFP-KanMX6-HO</td><td>Pon 实验室</td><td>JYE057/EP41</td><td>廖 et al 2020¹</td></tr><tr><td>摇床培养箱</td><td>新不伦瑞克科学公司</td><td>E24</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi PCR 试剂盒</td><td>罗氏测序与生命科学，Kapa生物系统公司，马萨诸塞州威尔明顿</td><td>KK1006</td><td></td></tr><tr><td>L-精氨酸盐酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8094</td><td></td></tr><tr><td>激光</td><td>安捷伦</td><td></td><td>405 和 488 nm</td></tr><tr><td>L-组氨酸盐酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5659</td><td></td></tr><tr><td>L-亮氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8912</td><td></td></tr><tr><td>L-赖氨酸盐酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8662</td><td></td></tr><tr><td>L-甲硫氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9625</td><td></td></tr><tr><td>L-苯丙氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5482</td><td></td></tr><tr><td>L-色氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8941</td><td></td></tr><tr><td>L-酪氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8566</td><td></td></tr><tr><td>mHyPer7 质粒</td><td>本研究</td><td>JYE116</td><td></td></tr><tr><td>显微镜盖玻片</td><td>ThermoScientific</td><td>3406</td><td>#1.5 (170 &amp;micro;m 厚度)</td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>3050</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker Red CM-H2Xros</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>M7513</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi 一步连接预混液</td><td>New England Biolabs</td><td>E2621</td><td></td></tr><tr><td>尼康 Elements</td><td>尼康</td><td></td><td>显微镜图像采集软件</td></tr><tr><td>尼康Ti Eclipse倒置显微镜</td><td>尼康</td><td></td><td></td></tr><tr><td>百草枯（甲基紫精二氯化物水合物）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>目录号 856177&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RStudio</td><td>Posit.co</td><td>免费桌面版</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>贝克曼</td><td>BU530</td><td></td></tr><tr><td>Stagetop 培养箱</td><td>东海日立</td><td>INU</td><td></td></tr><tr><td>尿嘧啶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U1128</td><td></td></tr><tr><td>含硫酸铵但不含氨基酸的酵母氮源基础培养基（YNB）</td><td>BD Difco</td><td>DF0919073</td><td></td></tr><tr><td>YN2_1_LT58_X2位点</td><td>Addgene</td><td>177705</td><td>Pianale 等，2021</td></tr><tr><td>Zyla 4.2 sCMOS 相机</td><td>安道尔</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

活酵母细胞中线粒体过氧化氢比率型生物传感器 mthyper7 的成像

Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells

线粒体功能障碍或功能改变存在于多种疾病和病理状态中，包括神经退行性疾病、肌肉骨骼系统疾病、癌症以及正常衰老过程。本文介绍一种利用基因编码、侵入性极小、基于比率检测的生物传感器，在细胞和亚细胞水平上评估活酵母细胞中线粒体功能的方法。该生物传感器为靶向线粒体的HyPer7（mtHyPer7），可检测过氧化氢（H₂O₂）水平，从而反映线粒体活性。通过荧光显微镜成像，结合特异性刺激与抑制剂处理，可动态监测线粒体氧化还原状态的变化。该方法具有高时空分辨率，适用于研究线粒体在代谢调控、应激响应及细胞命运决定中的作用。此外，该技术可拓展至其他真核细胞系统，为探究线粒体相关疾病的机制提供有力工具。

关键词：线粒体功能障碍，酵母细胞，mtHyPer7，过氧化氢检测，比率型生物传感器，活细胞成像，氧化还原状态，线粒体靶向2O2)在线粒体中。它由一个线粒体信号序列与一个环状重排的荧光蛋白及H2O2-细菌OxyR蛋白的响应域。该生物传感器利用CRISPR-Cas9无标记系统在酵母基因组中生成并整合，用于&#160;相较于质粒携带的构建体，表达更加一致。
mtHyPer7 可定量靶向至线粒体，对酵母生长速率或线粒体形态无明显影响，并可在正常生长条件及氧化应激暴露下，提供线粒体 H2O2 的定量读数。本方案详细说明了如何利用转盘共聚焦显微镜系统优化成像条件，并使用免费软件进行定量分析。这些工具使得收集细胞内及细胞群体中线粒体的丰富时空信息成为可能。此外，本文所述的工作流程还可用于验证其他生物传感器。

为验证 mtHyPer7 是否适合作为检测线粒体 H2O2 的探针，评估了 mtHyPer7 的定位及其对酵母线粒体和细胞健康的影响。为评估 mtHyPer7 的靶向性，在对照酵母细胞及表达 mtHyPer7 的酵母细胞中，使用活细胞特异性线粒体染料 MitoTracker Red 对线粒体进行染色。通过 MitoTracker Red 染色可见，线粒体呈现为沿母细胞-芽体轴排列的长管状结构，并在芽体顶端以及远离芽体的母细胞顶端聚集41。对照组与表达 mtHyPer7 的细胞中，线粒体形态相似。此外，mtHyPer7 与 MitoTracker Red 染色的线粒体共定位（图 3A）。因此，mtHyPer7 能高效且定量地靶向线粒体，且不影响线粒体正常的形态或分布。
接下来，进行了额外的验证实验，以评估mtHyPer7对细胞适应性以及线粒体氧化应激敏感性的影响。表达mtHyPer7的细胞在富含营养或基于葡萄糖的合成培养基（YPD或SC）中的生长速率与未转化的野生型细胞相似（图3B、D）。为了评估mtHyPer7对线粒体氧化应激可能产生的影响，将对照组和表达mtHyPer7的酵母细胞用低浓度的百草枯处理；百草枯是一种具有氧化还原活性的小分子化合物，可在线粒体中积累，并导致细胞器内超氧化物水平升高24,27。如果mtHyPer7的表达本身会诱导线粒体内的氧化应激，或对线粒体起到抗氧化保护作用，则表达mtHyPer7的细胞应分别表现出对百草枯处理的敏感性增加或降低。低浓度百草枯处理导致酵母生长速率下降。此外，在百草枯存在条件下，野生型细胞与表达mtHyPer7细胞的生长速率相似（图3C、E）。因此，该生物传感器的表达并未在芽殖酵母细胞中引起显著的细胞应激，也未改变酵母对线粒体氧化应激的敏感性。
鉴于已有证据表明 mtHyPer7 适用于研究芽殖酵母中的线粒体 H2O2，因此进一步检测了 mtHyPer7 是否能够检测对数中期野生型酵母中线粒体&#160;H2O2 水平，以及由外源添加 H2O2 所诱导的线粒体 H2O2 变化。通过开展 H2O2 滴定实验，测定线粒体中氧化态与还原态（O/R）mtHyPer7 的平均比值。
自动化分析脚本生成了多个输出文件。
比值图像（ratio.tif）：由经过背景校正并设定阈值的488 nm和405 nm图像堆栈计算其比值得到的Z堆栈。该堆栈可在Fiji中直接查看，无需额外处理；但在查看前建议按照方案步骤4.3或5.6所述增强对比度和/或对图像进行伪彩处理。
掩膜图像（mask.tif）：由用于分析的经阈值处理的线粒体区域组成的Z堆栈。该图像必须用于评估阈值处理的准确性。
用于分析的感兴趣区域（ROIs.zip）：将此文件与源图像一同在 Fiji 中打开时，感兴趣区域将叠加显示在图像上，以便对照结果表与源图像。每个感兴趣区域均被重命名为细胞编号和感兴趣区域编号。
包含每个切片在分子、分母和比值图像中经阈值处理后的线粒体面积、平均值和积分密度的测量表（NumResults.csv、DenomResults.csv、Results.csv）。在线粒体缺失或失焦的切片中，记录为 NaN。
记录用于背景和噪声校正、阈值设定及比率计算的参数选项的日志文件（Log.txt）。
mtHyPer7 的 O/R 比值对 H2O2 浓度呈现剂量依赖性反应，在外源添加 1–2 mM H2O2 时达到平台期（图 7）。令人意外的是，暴露于 0.1 mM H2O2 的细胞中 HyPer7 比值低于对照组细胞，尽管该差异无统计学意义。此现象的一种可能解释是应激适应效应（hormesis response），即低水平应激源的暴露可能诱导应激反应（如抗氧化机制），从而降低探针可检测到的活性氧（ROS）水平。相比之下，较高水平的应激源可能压倒细胞内的应激防御系统，导致 HyPer7 检测信号升高。
<img alt="图7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig07.jpg" /> 
图7mtHyPer7 对外源添加 H₂O₂ 的响应2O2. (A)&#160;405 nm 和 488 nm 激发下 mtHyPer7 在对数中期细胞中的最大投影，以及不同浓度 H₂O₂ 处理条件下比率成像的平均强度投影2O2伪彩色表示氧化态与还原态 mtHyPer7 的比值（底部标尺）。标尺 = 1 &#181;m细胞轮廓以白色显示；n &#62; 每种条件下100个细胞。B)&#160;不同浓度 H₂O₂ 处理的芽殖酵母细胞中 mtHyPer7 氧化态:还原态比率的定量分析2O2五次独立实验的均值以不同形状和颜色的符号表示。均值 &#177; mtHyPer7 氧化态与还原态比值的扫描电镜分析：1.794 &#177; 0.07627（未处理），1.357 &#177; 0.03295（0.1 mM），2.571 &#177; 0.3186（0.5 mM），6.693 &#177; 0.5194（1 mM），7.017 &#177; 0.1197（2 mM） p &#60; 0.0001（采用Tukey多重比较检验的单因素方差分析）。 p 数值表示为：****p &#60; 0.0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
最后，先前的研究表明，功能更健全的线粒体（其还原程度更高且超氧化物含量更低）会优先被酵母子代细胞继承4，并且细胞质过氧化氢酶会被转运至酵母子代细胞并在其中被激活42,43,44,45。这些研究记录了酵母细胞分裂过程中线粒体的不对称遗传现象，以及该过程在子代细胞适应性、寿命和母子代年龄不对称性中的作用。为了检验母细胞与芽体之间是否存在H2O2水平的差异，研究人员测定了芽体和母细胞中的mtHyPer7信号。在酵母细胞内观察到线粒体H2O2水平存在差异，与母细胞中的线粒体相比，芽体中线粒体的H2O2生物传感器信号呈现出虽微弱但具有统计学意义的降低（图8）。这些发现与此前关于芽体中线粒体对氧化应激具有更强保护能力的研究结果一致。同时，本研究也证实mtHyPer7可在出芽酵母中以细胞级和亚细胞级分辨率对线粒体H2O2提供定量检测信号。
<img alt="图8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig08.jpg" /> 
图8：线粒体 H2O2 子细胞中的水平较低。 (A)&#160;代表性细胞中mtHyPer7比率成像的最大投影。伪彩色表示氧化型:还原型mtHyPer7的比率（底部标尺）。比率在亚细胞结构间的差异明显（箭头所示）。比例尺 = 1 &#181;m细胞轮廓：白色。&#160;(B) 芽细胞与母细胞之间 mtHyPer7 比值的差异。对每个单独的细胞，用芽细胞的比值减去母细胞的比值，并将结果作为单个数据点绘图。n = 193 个细胞，来自五次独立实验，每次实验的数据用不同颜色的符号表示。均值 &#177; mtHyPer7比率在芽细胞与母细胞间差异的扫描电镜分析：-0.04297 &#177; 0.01266. p = 0.0008（配对） t-测试) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig08large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
补充表 S1：本研究中使用的小鼠品系。 本研究中使用的小鼠品系列表。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428_Supplemental Table 1 Strains used in this study-R2.xls" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充表 S2：本研究中使用的质粒。 所使用质粒的列表。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/Supplemental Table 2 Plasmids used in this study-R2.xls" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充表 S3：本研究中使用的引物。 使用的引物列表。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428_Supplemental Table 3 Primers used in this study-R2.xls" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件1：生物传感器质粒构建方案。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428_Yang et al Supp Protocol 2023.docx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 2：&#160;用于自动分析的脚本。 每个脚本均提供示例输入文件和输出文件。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/biosensor-supplemental-coding-files.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

过氧化氢（H2O2）既是氧化损伤的来源，也是一种信号分子。本实验方案介绍了如何在活酵母细胞中利用线粒体靶向的基因编码比率型生物传感器 HyPer7（mtHyPer7）来检测线粒体内的 H2O2，并详细说明了如何优化成像条件，以及如何使用免费软件进行定量的细胞和亚细胞水平分析。

活酵母细胞中线粒体过氧化氢比率型生物传感器 mtHyPer7 的成像

线粒体功能障碍或功能改变存在于多种疾病和病理状态中，包括神经退行性疾病和肌肉骨骼系统疾病，……

线粒体是细胞内的细胞器，参与能量动员、中心代谢、重要大分子的合成、钙离子储存以及信号转导。因此，线粒体在细胞功能、细胞适应性及寿命调控中发挥着关键作用。我们的研究聚焦于利用出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为模式生物，探究线粒体对衰老过程的影响。活细胞成像技术是我们观察线粒体功能变异的最佳工具。本文介绍一种利用基因编码的、具有比率检测特性的光谱转移生物传感器——线粒体型HyPer 7（mtHyPer 7）的方法。mtHyPer 7可检测过氧化氢，后者是一种活性氧，既可能损伤细胞组分，也可在活细胞线粒体中作为信号分子发挥作用。MtHyPer 7 对过氧化氢具有高亲和力，且对 pH 值的敏感性较低。它被整合到酵母基因组中，可在酵母细胞群体中实现稳定且一致的表达。最后，它可被定量靶向至线粒体，且对细胞或线粒体的功能及适应性无明显影响。像 mtHyPer 7 这样的生物传感器对于在亚细胞分辨率下研究线粒体功能、发现线粒体质量控制背后的机制，以及探究该过程如何影响细胞适应性、命运和寿命至关重要。与用于活性氧检测的有机染料相比，mtHyPer 7 能够提供稳定的标记。相较于基于 FRET 的传感器，mtHyPer 7 更为紧凑，并避免了FRET所存在的问题，例如激发光串扰、信号渗漏，以及对供体与受体精确位置和取向的要求。首先，取1 mL表达线粒体靶向HyPer 7的对数中期芽殖酵母细胞培养液。在6,000 G离心30秒，弃去上清液，管中保留10至20微升。使用微量移液器轻轻吹打残留培养基，重悬细胞沉淀。接下来，使用气吹或无绒布清洁载玻片，并在载玻片上加入1.8 µL细胞悬液。最后，将1.5号盖玻片以倾斜角度缓慢盖上，避免产生气泡。然后将载玻片置于显微镜载物台上。为了成像细胞，需设置采集参数，以确保每个荧光通道均具有可检测的信号和可接受的分辨率。例如，在配备 sCMOS 相机的转盘共聚焦显微镜上，可使用 2×2 像素合并，激光功率为 20% 至 40%，曝光时间为 200 至 600 毫秒。接着，检查图像的直方图。在12位图像中，确保像素值的总动态范围至少达到数百个灰度级，且未出现饱和。此外，该范围应比噪声水平高一个数量级。为计算噪声水平，需测量图像中无细胞区域像素值的标准差。然后在无时间间隔的情况下连续采集延时图像，以评估成像条件对线粒体信号稳定性和氧化应激的影响。使用显微镜采集软件或 ImageJ 测量每个荧光通道的平均像素值，以确保信号稳定。如果实验不涉及延时成像，则需确保在两到三次重复采集的 Z 层扫描中荧光信号保持稳定。对于出芽酵母，以0.5微米的Z轴间隔和总共六微米的Z轴堆栈深度采集图像。若采集Z轴堆栈图像，需确保数据集中所有图像的Z轴间隔相同，并包含完整的细胞。同时，采集透射光图像以记录细胞边界。首先，在 Fiji 中打开一个多通道 Z 层图像，并打开所需的生物传感器分析脚本文件。在脚本编辑器窗口中点击“运行”以执行脚本，然后在弹出的对话框中输入所需信息。选择用于比率计算的分子和分母对应的通道编号。对于线粒体靶向的 HyPer 7，分子为在 488 纳米激发的通道，分母为在 405 纳米激发的通道。如果存在透射光图像，请选择其通道编号；若无透射光图像，则选择 0。然后选择所需的背景扣除方法。如果背景均匀，单击“选择图像区域”以测量图像中的背景水平。随后，选择所需的噪声扣除方法，以减少检测器读出中的随机波动。单击“选择图像区域”。选择“固定值”选项以输入先前测得的噪声水平，如果成像条件保持恒定，此方法通常效果良好。为了准确且一致地检测线粒体，请选择一种阈值分割算法，例如 O2 或最大熵算法。对实验中的所有图像使用相同的算法，但需确保准确识别线粒体。然后选择每个细胞的感兴趣区域数量。例如，若测量母细胞与芽细胞的差异，则选择两个。选择用于保存测量结果和比率图像的输出文件夹。如需进行背景或噪声校正，请选择“选择图像区域”，然后根据提示使用矩形 ROI 工具绘制背景区域，再点击“确定”。在分析单个细胞或亚细胞区域时，应基于明场图像绘制感兴趣区域。ROI 无需精确匹配细胞轮廓，因为仅会测量 ROI 内经过阈值处理的线粒体。创建每个 ROI 后，按 T 键将选定的 ROI 添加到 ROI 管理器中。在 ROI 管理器中勾选“显示全部”，以记录已标记的细胞。每个添加的区域将以编号项的形式显示在ROI管理器列表中。若对每个细胞分析多个ROI，请对所有待分析细胞以相同的顺序标记ROI。当所有目标ROI均添加至ROI管理器后，单击“标记细胞”对话框中的“确定”按钮。接下来，选择测量表格式。在多测量对话框窗口中，勾选“测量所有切片”和“每个切片对应一行”选项，以生成所需格式的表格。使用 ProcessMultiROITables。用于处理使用“每切片一行”选项创建的表格的 R 脚本。请勿勾选“追加结果”选项。使用该脚本将输出文件保存到所选文件夹中。现在在 Fiji 中打开比率 Z-栈图像，以生成彩色的比率图像。然后打开 colorize_ratio_image.ijm 脚本文件，在脚本编辑器窗口中点击运行。将弹出一个对话框，提示输入所需信息。在“未调制”选项中，所有线粒体像素均以相同的亮度显示。由于暗像素和亮像素均会对比值图像产生影响，某些图像可能看起来存在噪声。使用强度调制选项以降低噪声。在最小值和最大值显示方法中，选择接近实验中观察到的平均最小值和最大值的数值。为确保一致性，应使用相同的成像条件采集所有图像，并使用相同的最小值和最大值显示所有图像。然后选择投影模式以投影Z轴层叠图像，并在着色前显示完整的线粒体群体。若要生成最大强度投影，请选择“Maximum”；若要生成平均强度投影，请选择“Average”。最后，选择用于保存着色图像的文件夹。如果选择了“未调制”选项，请在出现的对话框中选择一种配色方案。可使用 Fiji 内置的 Fire 或 Rainbow RGB 查找表，或其他任何以 ImageJ 的 LUT 格式提供的所需查找表。使用该脚本将输出文件保存至所选文件夹。线粒体标记的 HyPer 7 的氧化还原比对外源添加的过氧化氢浓度呈剂量依赖性响应，在外源添加的过氧化氢浓度达到 1 至 2 毫摩尔时达到平台期。在酵母细胞内观察到线粒体过氧化氢水平的差异。与母细胞相比，在芽中的线粒体检测到过氧化氢生物传感器信号显著降低。

imaging-mthyper7-ratiometric-biosensor-for-mitochondrial-peroxide

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生物学

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了解使用mtHyPer7生物传感器在活酵母细胞中进行线粒体过氧化氢成像的方法。该技术利用荧光显微镜定量检测Saccharomyces cerevisiae中的活性氧水平，为研究线粒体质量控制与细胞衰老机制提供可靠工具。

活酵母细胞中线粒体过氧化氢比率型生物传感器 mtHyPer7 的成像

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