利用基因分型与基因组规模的基因剔除筛选鉴定恶性外周神经鞘瘤小鼠模型中的治疗靶点

我们正致力于阐明散发性及与神经纤维瘤病1型（NF1）相关的恶性外周神经鞘瘤的发病机制。我们的目标是合理地开发针对这些高度侵袭性肿瘤的新疗法。目前我们正在采用多种技术推进研究，包括无偏倚的全基因组规模shRNA筛选、单细胞测序、BaseScope原位探针技术以及生物信息学分析。

通过采用多种现有方法，我们已鉴定出多个对恶性外周神经鞘瘤的增殖和存活至关重要且具有治疗靶向性的受体。这些受体包括神经调节蛋白受体erbB3和溶血磷脂酸受体3。该方法的优势在于能够检测超过15,000个基因在MPNST癌细胞系中的促增殖作用。

这是一种无偏倚的方法，可识别在恶性周围神经鞘瘤（MPNST）治疗中尚未被探索的靶点。未来，我们实验室的研究重点将集中在验证筛选中发现的靶点，包括在细胞系和培养物中使用抑制剂，并最终将其转化为动物实验研究。

在第0天，将一千万个293T细胞接种于30毫升含10%FBS的无抗生素DMEM培养基中，置于直径15厘米的培养皿内。共准备10个这样的培养皿。在次日（即第1天），确认细胞融合度达到80%，并已准备好进行转染。

然后在50毫升锥形管中依次加入600微升浓度为0.5微克/微升的包装质粒混合物，以及60微升质粒条形码文库。在另一个15毫升锥形管中，将900微升转染试剂与12毫升DMEM通过涡旋混合。将12.9毫升该混合液加入DNA混合物中，轻轻弹击管壁混匀即可。

不再进一步混匀，将混合物在室温下孵育15分钟。然后将2.5毫升孵育后的混合物逐滴加入每个含有293T细胞的15厘米培养皿中，并在组织培养孵箱中过夜孵育细胞。第三天，通过0.2微米滤器过滤培养基，收集病毒。

将含有病毒颗粒的滤液分装至15毫升锥形管中。此外，将过滤后的病毒液在冻存管中分装成五份，每份1毫升，用于病毒滴度测定。为滴定慢病毒液，向一个无菌玻璃烧瓶中加入65微升阳离子聚合物，该烧瓶内含有65毫升肿瘤细胞生长培养基。

将含有聚合物的培养基每孔1毫升加入11个6孔组织培养板中。接着用胰蛋白酶消化早期传代的肿瘤细胞。使用偏好的方法计数细胞后，将细胞转移至6孔板中。

从冰箱中取出 1 毫升 48 小时慢病毒分装液，在 37 摄氏度水浴中解冻。根据表格为每种病毒模块准备感染操作。进行慢病毒感染时，将经胰蛋白酶消化并计数后的 MPNST 目标细胞接种，每 15 厘米培养皿接种 250 万个细胞。

在存在每毫升五微克阳离子聚合物的条件下，以0.5的感染复数用解冻的病毒转导细胞。在加入嘌呤霉素三天后，用胰蛋白酶消化细胞。将一半的细胞群体在台式离心机中以200×g离心五分钟。

将另一半细胞群体重新接种后，培养至大约经历七次群体倍增，然后按照之前所示方法进行收集和离心。将对应所需时间点的重悬细胞沉淀均分为两份，分别加入两个15毫升的聚甲基戊烯管中。每管加入500微升10% SDS，混匀后室温孵育5分钟。

将试管放入DNA剪切仪中对DNA进行超声处理。加入苯酚和氯仿后，在最大可能速度下剧烈涡旋振荡45至60秒，充分混匀。将每根试管中所得澄清上层相的3毫升转移至另一新的15毫升离心管中。

加入0.5毫升3摩尔的醋酸钠和4毫升异丙醇，充分混匀。在20摄氏度、7,200g条件下离心30分钟，弃去上清液后，向沉淀中加入0.5毫升70%乙醇，通过上下吹打使沉淀脱离管底。将两个管中的重悬沉淀合并至一个1.5毫升离心管中。

使用屏幕上显示的条件进行PCR反应。第二次PCR反应结束后，将四个样品合并至一个微量离心管中，并加入80微升6X上样染料。观察凝胶，确认在约250个碱基对处出现条带。

转导了非靶向对照和表达四种不同BCL6短发夹RNA的慢病毒的人类MPNST细胞显示，其中多个BCL6短发夹RNA显著减少了细胞数量。免疫印迹结果表明，细胞数量的减少程度与BCL6敲低程度相关。首先，将80%汇合的恶性周围神经鞘瘤（MPNST）细胞以每孔1,200个细胞的密度接种于黑色壁的96孔板中。

在配制待测药物的系列稀释液后，将每种稀释液或对照溶剂加入至少三个重复的细胞样本中。为评估直接细胞数量，向培养板中加入Hoechst 33342，使其终浓度为每毫升1至5微克，并在37摄氏度下孵育30分钟。将培养板置于高通量成像细胞仪上，选择“直接细胞计数法测定总细胞数”选项，以100,000至600,000毫秒的曝光时间扫描培养板。

使用软件分析测序数据，导出至电子表格，并采用适当的软件进行统计分析。