Name: 遗传分析和基因组规模的辍学筛选以确定恶性周围神经鞘瘤小鼠模型中的治疗靶点 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: 了解恶性周围神经鞘瘤的遗传分析方法，利用全基因组shRNA筛选和单细胞测序技术鉴定erbB3等治疗靶点。该计算生物学方法为开发新型癌症治疗策略提供重要依据。

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本研究由美国国家神经疾病与卒中研究所（R01 NS048353 和 R01 NS109655 资助 S.L.C.；R01 NS109655-03S1 资助 D.P.J.）、美国国家癌症研究所（R01 CA122804 资助 S.L.C.）以及美国国防部（X81XWH-09-1-0086 和 W81XWH-12-1-0164 资助 S.L.C.）的资助项目支持。

Genome-Scale Screening to Identify and Compare Therapeutic Targets in Tumors

<ol><li>Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+promoting+the+pathogenesis+of+Schwann+cell+neoplasms%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms promoting the pathogenesis of Schwann cell neoplasms.</a> Acta Neuropathol. 123 (3), 321-348 (2012).</li>
<li>Longo, J. F., Weber, S. M., Turner-Ivey, B. P., Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+Advances+in+the+Diagnosis+and+Pathogenesis+of+Neurofibromatosis+Type+1+%28NF1%29-associated+Peripheral+Nervous+System+Neoplasms%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Anat+Pathol%22%5BJournal%5D)">Recent Advances in the Diagnosis and Pathogenesis of Neurofibromatosis Type 1 (NF1)-associated Peripheral Nervous System Neoplasms.</a> Adv Anat Pathol. 25 (5), 353-368 (2018).</li>
<li>Longo, J. F., Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RASopathies%3A+Biology%2C+genetics+and+therapeutic+options%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The RASopathies: Biology, genetics and therapeutic options.</a> Adv Cancer Res. 153, 305-341 (2022).</li>
<li>Birindelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rb+and+TP53+pathway+alterations+in+sporadic+and+NF1-related+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Rb and TP53 pathway alterations in sporadic and NF1-related malignant peripheral nerve sheath tumors.</a> Lab Invest. 81 (6), 833-844 (2001).</li>
<li>Legius, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TP53+mutations+are+frequent+in+malignant+NF1+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Chromosomes+Cancer%22%5BJournal%5D)">TP53 mutations are frequent in malignant NF1 tumors.</a> Genes Chromosomes Cancer. 10 (4), 250-255 (1994).</li>
<li>Menon, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+17p+deletions+and+p53+gene+mutations+associated+with+the+formation+of+malignant+neurofibrosarcomas+in+von+Recklinghausen+neurofibromatosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chromosome 17p deletions and p53 gene mutations associated with the formation of malignant neurofibrosarcomas in von Recklinghausen neurofibromatosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (14), 5435-5439 (1990).</li>
<li>Upadhyaya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+and+somatic+NF1+gene+mutation+spectrum+in+NF1-associated+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors+%28MPNSTs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mutat%22%5BJournal%5D)">Germline and somatic NF1 gene mutation spectrum in NF1-associated malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs).</a> Hum Mutat. 29 (1), 74-82 (2008).</li>
<li>Kourea, H. P., Orlow, I., Scheithauer, B. W., Cordon-Cardo, C., Woodruff, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletions+of+the+INK4A+gene+occur+in+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors+but+not+in+neurofibromas%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Deletions of the INK4A gene occur in malignant peripheral nerve sheath tumors but not in neurofibromas.</a> Am J Pathol. 155 (6), 1855-1860 (1999).</li>
<li>Nielsen, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+transformation+of+neurofibromas+in+neurofibromatosis+1+is+associated+with+CDKN2A%2Fp16+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Malignant transformation of neurofibromas in neurofibromatosis 1 is associated with CDKN2A/p16 inactivation.</a> Am J Pathol. 155 (6), 1879-1884 (1999).</li>
<li>Gregorian, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTEN+dosage+is+essential+for+neurofibroma+development+and+malignant+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">PTEN dosage is essential for neurofibroma development and malignant transformation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (46), 19479-19484 (2009).</li>
<li>Lee, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRC2+is+recurrently+inactivated+through+EED+or+SUZ12+loss+in+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">PRC2 is recurrently inactivated through EED or SUZ12 loss in malignant peripheral nerve sheath tumors.</a> Nat Genet. 46 (11), 1227-1232 (2014).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+mutations+of+SUZ12+in+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Somatic mutations of SUZ12 in malignant peripheral nerve sheath tumors.</a> Nat Genet. 46 (11), 1170-1172 (2014).</li>
<li>Varela, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+structural+rearrangements+in+genetically+engineered+mouse+mammary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Somatic structural rearrangements in genetically engineered mouse mammary tumors.</a> Genome Biol. 11 (10), 100(2010).</li>
<li>Johnson, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-species+genomics+matches+driver+mutations+and+cell+compartments+to+model+ependymoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cross-species genomics matches driver mutations and cell compartments to model ependymoma.</a> Nature. 466 (7306), 632-636 (2010).</li>
<li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+oncogenomics+identifies+NEDD9+as+a+melanoma+metastasis+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comparative oncogenomics identifies NEDD9 as a melanoma metastasis gene.</a> Cell. 125 (7), 1269-1281 (2006).</li>
<li>Zender, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+validation+of+oncogenes+in+liver+cancer+using+an+integrative+oncogenomic+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification and validation of oncogenes in liver cancer using an integrative oncogenomic approach.</a> Cell. 125 (7), 1253-1267 (2006).</li>
<li>Uren, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+mutagenesis+in+p19%28ARF%29-+and+p53-deficient+mice+identifies+cancer+genes+and+their+collaborative+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Large-scale mutagenesis in p19(ARF)- and p53-deficient mice identifies cancer genes and their collaborative networks.</a> Cell. 133 (4), 727-741 (2008).</li>
<li>Starr, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transposon-based+genetic+screen+in+mice+identifies+genes+altered+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A transposon-based genetic screen in mice identifies genes altered in colorectal cancer.</a> Science. 323 (5922), 1747-1750 (2009).</li>
<li>Dupuy, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+sleeping+beauty+transposon+system+that+can+be+used+to+model+a+wide+variety+of+human+cancers+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A modified sleeping beauty transposon system that can be used to model a wide variety of human cancers in mice.</a> Cancer Res. 69 (20), 8150-8156 (2009).</li>
<li>Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Challenge+of+Cancer+Genomics+in+Rare+Nervous+System+Neoplasms%3A+Malignant+Peripheral+Nerve+Sheath+Tumors+as+a+Paradigm+for+Cross-Species+Comparative+Oncogenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">The Challenge of Cancer Genomics in Rare Nervous System Neoplasms: Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors as a Paradigm for Cross-Species Comparative Oncogenomics.</a> Am J Pathol. 186 (3), 464-477 (2016).</li>
<li>Huijbregts, R. P., Roth, K. A., Schmidt, R. E., Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertrophic+neuropathies+and+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors+in+transgenic+mice+overexpressing+glial+growth+factor+beta3+in+myelinating+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Hypertrophic neuropathies and malignant peripheral nerve sheath tumors in transgenic mice overexpressing glial growth factor beta3 in myelinating Schwann cells.</a> J Neurosci. 23 (19), 7269-7280 (2003).</li>
<li>Kazmi, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+overexpressing+neuregulin-1+model+neurofibroma-malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+progression+and+implicate+specific+chromosomal+copy+number+variations+in+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice overexpressing neuregulin-1 model neurofibroma-malignant peripheral nerve sheath tumor progression and implicate specific chromosomal copy number variations in tumorigenesis.</a> Am J Pathol. 182 (3), 646-667 (2013).</li>
<li>Brosius, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuregulin-1+overexpression+and+Trp53+haploinsufficiency+cooperatively+promote+de+novo+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Neuregulin-1 overexpression and Trp53 haploinsufficiency cooperatively promote de novo malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis.</a> Acta Neuropathol. 127 (4), 573-591 (2014).</li>
<li>Hart, T., Brown, K. R., Sircoulomb, F., Rottapel, R., Moffat, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+error+rates+in+genomic+perturbation+screens%3A+gold+standards+for+human+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Measuring error rates in genomic perturbation screens: gold standards for human functional genomics.</a> Mol Syst Biol. 10 (7), 733(2014).</li>
<li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+Design+of+Genome-Wide+CRISPR%2FSpCas9+Knockout+Screens%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knockout Screens.</a> G3. 7 (8), Bethesda. 2719-2727 (2017).</li>
<li>Longo, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+genomic+characterization+of+a+sporadic+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Establishment and genomic characterization of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor cell line.</a> Sci Rep. 11 (1), 5690(2021).</li>
<li>Maser, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomally+unstable+mouse+tumours+have+genomic+alterations+similar+to+diverse+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chromosomally unstable mouse tumours have genomic alterations similar to diverse human cancers.</a> Nature. 447 (7147), 966-971 (2007).</li>
<li>Rahrmann, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+genetic+screen+for+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+formation+identifies+new+genes+and+pathways+driving+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Forward genetic screen for malignant peripheral nerve sheath tumor formation identifies new genes and pathways driving tumorigenesis.</a> Nat Genet. 45 (7), 756-766 (2013).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本文介绍的详细方法旨在研究周围神经系统肿瘤及恶性周围神经鞘瘤（MPNST）的发病机制。尽管我们发现这些方法行之有效，但仍需认识到本文所述方法存在一些潜在的局限性。下文将讨论这些局限性以及在其他模型系统中可能采用的克服策略。
我们发现，全外显子组测序能有效鉴定 P0-GGFβ3 小鼠中感兴趣的突变。然而，应当认识到全外显子组测序本身存在局限性。首先，全外显子组测序在鉴定融合基因产物方面效果不佳。这是因为大多数染色体断裂及随后的融合主要涉及基因间区域和内含子，而这些区域占基因组的大部分。我们发现，采用双端测序的 RNA-Seq 能更有效地鉴定融合基因。此外，全外显子组测序在识别相对较大的染色体缺失区域方面的有效性也存在疑问。
尽管已有多种算法被开发用于识别此类缺失，但“全外显子组测序”这一术语本身具有误导性，因为在测序效果良好的运行中，外显子组的捕获仍常常会遗漏多达5-10%的外显子区域。因此，我们常规地将全外显子组测序与其他方法（如阵列比较基因组杂交（aCGH））相结合。在识别出拷贝数增加和缺失后，我们检查...

恶性外周神经鞘瘤（MPNSTs）是一种高度侵袭性的梭形细胞肿瘤，可发生于与肿瘤易感综合征1型神经纤维瘤病（NF1）相关的患者中，也可在普通人群中散发出现，或出现在既往接受过放射治疗的部位。1,2,3NF1 患者出生时携带一个野生型的拷贝 NF1 肿瘤抑制基因和第二个 NF1 等位基因发生功能缺失突变。这种单倍体不足状态使NF1患者易在其野生型等位基因上发生第二次功能缺失突变 NF1 基因，可触发肿瘤发生。当该 &#34;二次打击&#34; NF1 当施万细胞谱系中的细胞发生突变时，会形成两种肿瘤：一种是起源于皮肤的皮肤型神经纤维瘤，另一种是发生在大神经或神经丛的丛状神经纤维瘤。尽管皮肤型神经纤维瘤与丛状神经纤维瘤的病理特征相同，但它们的生物学行为却显著不同——虽然两者均为良性肿瘤，但只有丛状神经纤维瘤可能发生恶性转化并发展为恶性周围神经鞘膜瘤（MPNSTs）。除了神经纤维瘤蛋白的缺失外，还包括由Ras GTPase激活蛋白编码的基因的失活 NF1 基因，MPNSTs 携带多个其他肿瘤抑制基因的突变，包括 TP534,5,6,7CDKN2A8,9, 和 PTEN10, 编码组分的基因突变&#160;多梳抑制复合物211,12 PRC2；该 SUZ12 和 EED 基因）和受体酪氨酸激酶的异常表达1,2. 突变 NF1 上述其他基因在散发性和辐射诱导的恶性周围神经鞘膜瘤（MPNSTs）中同样存在11,12.
尽管这些关于 MPNST 基因组异常的研究进展对于理解其发病机制具有重要价值，但它们尚未推动 MPNST 新疗法的有效开发。阻碍新疗法研发的一个主要障碍在于 MPNST 是一种罕见癌症。正因如此，很难获得足够数量的患者样本，以开展诸如癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）所进行的全局性分析，用以确定关键的驱动突变。根据我们的经验，即使积累数量有限的人类 MPNST 标本也可能需要数年时间。为了克服这些限制，许多研究其他罕见癌症类型的研究人员已转向跨物种比较肿瘤基因组学方法，以鉴定关键的驱动基因突变，明确特定肿瘤中必需的胞质信号通路，并发现新的治疗靶点。由于对肿瘤发生至关重要的信号通路在人类与其他脊椎动物物种之间高度保守，因此采用功能基因组学方法（如全基因组规模的 shRNA 筛选）可能是识别这些新的驱动突变、信号通路和治疗靶点的有效手段13,14,15,16,17,18,19，尤其是在研究样本数量极为有限的罕见人类肿瘤类型时尤为有效20。
在本文所述的方法中，我们介绍了在人类恶性周围神经鞘瘤（MPNST）细胞系及源自P的早期传代MPNST培养物中进行基因组谱型分析的这一方法0-GGFβ3 小鼠，一种基因工程小鼠模型（GEM），其施万细胞特异性过表达生长因子神经调节蛋白-1（NRG1），可促进丛状神经纤维瘤的发生及其向恶性周围神经鞘瘤（MPNST）的进展21,22,23该方法的第一步是识别P中的候选驱动基因0-GGFβ3 MPNSTs、人类MPNST细胞系以及手术切除的人类MPNST组织。为了在功能上验证这些突变所影响的信号通路，我们随后利用全基因组规模的shRNA筛选，鉴定在人类和小鼠MPNST细胞系中增殖与存活所必需的基因。在确定了增殖与存活所必需的基因后，我们进一步从这些基因集合中鉴定出具有药物靶向潜力的基因产物 &#34;命中数&#34; 使用药物基因相互作用数据库。我们还比较了 &#34;命中数&#34; 在人和小鼠的恶性周围神经鞘瘤（MPNST）细胞中，确定GEM模型与人类MPNST是否表现出对相同基因和信号通路的相似依赖性。识别在增殖和存活过程中所需基因以及受影响的信号通路中的重叠部分，可作为验证P的手段0在分子水平上研究GGFβ3小鼠模型。该方法还强调了结合人类与小鼠筛选以发现新治疗靶点的有效性，其中小鼠模型可作为人类筛选的补充。这种跨物种方法在寻找罕见肿瘤的治疗靶点时尤为有价值，因为在这些情况下，人类肿瘤组织和细胞系难以获得。

<table><tbody><tr><td>生物破碎仪超声系统</td><td>Diagenode&amp;nbsp;</td><td>UCD-600</td><td></td></tr><tr><td>CASAVA 1.8.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cbot</td><td>Illumina, San Diego, CA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Celigo 图像细胞仪</td><td>Nexcelom</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cellecta 条形码分析与解卷积软件</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citrisolve 混合清洗剂</td><td>Decon Laboratories</td><td>5989-27-5</td><td></td></tr><tr><td>康宁 96 孔黑色微孔板</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS3603</td><td></td></tr><tr><td>Diagenode Bioruptor 15 ml 锥形管</td><td>Diagenode&amp;nbsp;</td><td>C30010009</td><td></td></tr><tr><td>dNTP 混合液</td><td>Clontech</td><td>639210</td><td></td></tr><tr><td>伊红 Y</td><td>Thermo Scientific</td><td>7111</td><td></td></tr><tr><td>洗脱缓冲液</td><td>Qiagen&amp;nbsp;</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>乙醇（200 证明）</td><td>Decon Laboratories</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Excel&amp;nbsp;</td><td>Microsoft&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FWDGEX 5&amp;rsquo;-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA-3&amp;rsquo;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FWDHTS 5&amp;rsquo;-TTCTCTGGCAAGCAAAAGACGGCATA-3&amp;rsquo;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GexSeqS (5&amp;rsquo; AGAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAA-3&amp;rsquo;</td><td></td><td></td><td>HPLC 纯化</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>Dotmatics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>哈里斯苏木精</td><td>Fisherbrand</td><td>245-677</td><td></td></tr><tr><td>Illumina HiScanSQ</td><td>Illumina, San Diego, CA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛（4%）</td><td>Thermo Scientific</td><td>J19943-K2</td><td></td></tr><tr><td>PLUS 转染试剂</td><td>Thermo Scientific</td><td>11514015</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene 转染试剂</td><td>Millipore Sigma</td><td>TR1003G</td><td></td></tr><tr><td>PureLink 快速 PCR 纯化试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>K310001</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen Buffer P1</td><td>Qiagen&amp;nbsp;</td><td>19051</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen 凝胶回收试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>RevGEX 5&amp;rsquo;-AATGATACGGCGACCACCGAGA-3&amp;rsquo;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RevHTS1 5&amp;rsquo;-TAGCCAACGCATCGCACAAGCCA-3&amp;rsquo;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Titanium Taq 聚合酶</td><td>Clontech</td><td>639210</td><td></td></tr><tr><td>Trimmomatic 软件</td><td></td><td>www.usadellab.org</td><td></td></tr></tbody></table>

利用基因分型与基因组规模的基因剔除筛选鉴定恶性外周神经鞘瘤小鼠模型中的治疗靶点

Genetic Profiling and Genome-Scale Dropout Screening to Identify Therapeutic Targets in Mouse Models of Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor

恶性周围神经鞘瘤（MPNSTs）起源于施万细胞或其前体细胞。在患有肿瘤易感综合征——1型神经纤维瘤病（NF1）的患者中，MPNSTs是最常见的恶性肿瘤，也是导致死亡的主要原因。这类罕见且具有高度侵袭性的软组织肉瘤预后极差，5年无病生存率仅为34%–60%。目前针对MPNSTs患者的治疗手段非常有限，主要治疗方式仍为致残性手术。许多曾被寄予厚望的疗法在临床试验中均告失败，例如Ras信号通路抑制剂替吡法尼（tipifarnib）。同样，以厄洛替尼（erlotinib，靶向表皮生长因子受体EFGR）和索拉非尼（sorafenib，靶向血管内皮生长因子受体VEGF、血小板源性生长因子受体PDGF及Raf）联合标准化疗方案进行的II期临床试验，也未能在患者中产生有效应答。
近年来，功能基因组筛选方法与肿瘤细胞系的遗传谱型分析相结合，已被证明在识别关键的胞质信号通路以及开发靶向特异性治疗策略方面具有重要价值。对于罕见肿瘤类型，一种被称为跨物种比较肿瘤基因组学的方法正被 increasingly 用于发现新的治疗靶点。在跨物种比较肿瘤基因组学中，首先在基因工程小鼠（GEM）模型中进行遗传谱型分析和功能基因组学研究，然后在可获得的罕见人类样本和细胞系中验证结果。
本文介绍了如何利用全外显子组测序（WES）在人和小鼠恶性周围神经鞘瘤（MPNST）细胞中识别候选驱动基因突变。随后，我们描述了如何开展全基因组规模的短发夹RNA（shRNA）筛选，以鉴定并比较小鼠与人MPNST细胞中的关键信号通路，并识别这些通路中可作为药物靶点的分子。这些方法为在多种人类癌症类型中发现新的治疗靶点提供了有效途径。

图5 图中展示了在每种经过筛选的人类细胞系中，被标记为 TRUE 的核心必需基因（CEGs）与被标记为 FALSE 的非核心必需基因（非-CEGs）的耗竭评分。数据点表示各个基因的耗竭评分倍数变化的 log2 值，叠加在整体评分分布的箱线图上。Student's t-采用t检验分析每种细胞系中两组间耗竭评分均值的显著性差异。所得结果 p每个图中均标示了数值。请注意，核心必需基因（CEGs）的平均耗竭倍数得分显著高于非核心必需基因（非-CEGs）。这是符合预期的，因为根据定义，核心必需基因在大多数细胞类型中始终是增殖和/或存活所必需的。
图6A展示了三种人源MPNST细胞系中筛选出的“命中基因”的维恩图。我们通常发现多个细胞系之间存在大量共有的基因；这些共有的命中基因为高优先级，因为它们编码的蛋白质可能对大多数MPNST细胞的增殖和/或存活至关重要。还需注意的是，也存在仅在一个细胞系中被命中的基因。这种情况较为常见，不应将其视为筛...

我们开发了一种跨物种比较肿瘤基因组学方法，通过基因组分析和功能基因组筛选，鉴定并比较在基因工程小鼠模型中以及相应人类肿瘤类型中发生的肿瘤的治疗靶点。

恶性周围神经鞘瘤（MPNSTs）起源于施万细胞或其前体细胞。在患有肿瘤易感综合征的患者中……

我们正致力于阐明散发性及与神经纤维瘤病1型（NF1）相关的恶性外周神经鞘瘤的发病机制。我们的目标是合理地开发针对这些高度侵袭性肿瘤的新疗法。目前我们正在采用多种技术推进研究，包括无偏倚的全基因组规模shRNA筛选、单细胞测序、BaseScope原位探针技术以及生物信息学分析。通过采用多种现有方法，我们已鉴定出多个对恶性外周神经鞘瘤的增殖和存活至关重要且具有治疗靶向性的受体。这些受体包括神经调节蛋白受体erbB3和溶血磷脂酸受体3。该方法的优势在于能够检测超过15,000个基因在MPNST癌细胞系中的促增殖作用。这是一种无偏倚的方法，可识别在恶性周围神经鞘瘤（MPNST）治疗中尚未被探索的靶点。未来，我们实验室的研究重点将集中在验证筛选中发现的靶点，包括在细胞系和培养物中使用抑制剂，并最终将其转化为动物实验研究。在第0天，将一千万个293T细胞接种于30毫升含10%FBS的无抗生素DMEM培养基中，置于直径15厘米的培养皿内。共准备10个这样的培养皿。在次日（即第1天），确认细胞融合度达到80%，并已准备好进行转染。然后在50毫升锥形管中依次加入600微升浓度为0.5微克/微升的包装质粒混合物，以及60微升质粒条形码文库。在另一个15毫升锥形管中，将900微升转染试剂与12毫升DMEM通过涡旋混合。将12.9毫升该混合液加入DNA混合物中，轻轻弹击管壁混匀即可。不再进一步混匀，将混合物在室温下孵育15分钟。然后将2.5毫升孵育后的混合物逐滴加入每个含有293T细胞的15厘米培养皿中，并在组织培养孵箱中过夜孵育细胞。第三天，通过0.2微米滤器过滤培养基，收集病毒。将含有病毒颗粒的滤液分装至15毫升锥形管中。此外，将过滤后的病毒液在冻存管中分装成五份，每份1毫升，用于病毒滴度测定。为滴定慢病毒液，向一个无菌玻璃烧瓶中加入65微升阳离子聚合物，该烧瓶内含有65毫升肿瘤细胞生长培养基。将含有聚合物的培养基每孔1毫升加入11个6孔组织培养板中。接着用胰蛋白酶消化早期传代的肿瘤细胞。使用偏好的方法计数细胞后，将细胞转移至6孔板中。从冰箱中取出 1 毫升 48 小时慢病毒分装液，在 37 摄氏度水浴中解冻。根据表格为每种病毒模块准备感染操作。进行慢病毒感染时，将经胰蛋白酶消化并计数后的 MPNST 目标细胞接种，每 15 厘米培养皿接种 250 万个细胞。在存在每毫升五微克阳离子聚合物的条件下，以0.5的感染复数用解冻的病毒转导细胞。在加入嘌呤霉素三天后，用胰蛋白酶消化细胞。将一半的细胞群体在台式离心机中以200×g离心五分钟。将另一半细胞群体重新接种后，培养至大约经历七次群体倍增，然后按照之前所示方法进行收集和离心。将对应所需时间点的重悬细胞沉淀均分为两份，分别加入两个15毫升的聚甲基戊烯管中。每管加入500微升10% SDS，混匀后室温孵育5分钟。将试管放入DNA剪切仪中对DNA进行超声处理。加入苯酚和氯仿后，在最大可能速度下剧烈涡旋振荡45至60秒，充分混匀。将每根试管中所得澄清上层相的3毫升转移至另一新的15毫升离心管中。加入0.5毫升3摩尔的醋酸钠和4毫升异丙醇，充分混匀。在20摄氏度、7,200g条件下离心30分钟，弃去上清液后，向沉淀中加入0.5毫升70%乙醇，通过上下吹打使沉淀脱离管底。将两个管中的重悬沉淀合并至一个1.5毫升离心管中。使用屏幕上显示的条件进行PCR反应。第二次PCR反应结束后，将四个样品合并至一个微量离心管中，并加入80微升6X上样染料。观察凝胶，确认在约250个碱基对处出现条带。转导了非靶向对照和表达四种不同BCL6短发夹RNA的慢病毒的人类MPNST细胞显示，其中多个BCL6短发夹RNA显著减少了细胞数量。免疫印迹结果表明，细胞数量的减少程度与BCL6敲低程度相关。首先，将80%汇合的恶性周围神经鞘瘤（MPNST）细胞以每孔1,200个细胞的密度接种于黑色壁的96孔板中。在配制待测药物的系列稀释液后，将每种稀释液或对照溶剂加入至少三个重复的细胞样本中。为评估直接细胞数量，向培养板中加入Hoechst 33342，使其终浓度为每毫升1至5微克，并在37摄氏度下孵育30分钟。将培养板置于高通量成像细胞仪上，选择“直接细胞计数法测定总细胞数”选项，以100,000至600,000毫秒的曝光时间扫描培养板。使用软件分析测序数据，导出至电子表格，并采用适当的软件进行统计分析。

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Cancer Research

癌症研究

遗传分析和基因组规模的辍学筛选以确定恶性周围神经鞘瘤小鼠模型中的治疗靶点

我们已建立一种方法，用于评估基因工程小鼠中神经系统肿瘤是否能准确再现其人类对应疾病的病理特征。在此，我们将这些组织学技术、明确的病理学标准以及培养方法应用于P0-GGFβ3小鼠模型中发生的神经纤维瘤和恶性外周神经鞘瘤。...

在基因工程小鼠模型中识别、诊断与分级恶性外周神经鞘瘤

本实验方案演示了如何在果蝇（Drosophila）眼/触角成虫盘（EAD）中生成带有荧光标记且遗传背景明确的克隆肿瘤。方案详细描述了如何从三龄幼虫中解剖出EAD和脑组织，并对其进行处理，以观察和定量基因表达变化及肿瘤侵袭性。...

Drosophila 幼虫盘肿瘤模型：利用遗传镶嵌体可视化与定量分析基因表达及肿瘤侵袭性

确定能够从临床前测试顺利过渡到人体试验的新药物靶点是当前科学研究的重点。为此，本文介绍了一种功能基因组学方法，用于研究基因耗竭对癌细胞系球状体的影响，该模型能更真实地模拟人类癌症 体内.

利用功能基因组筛选鉴定肿瘤细胞球状培养物中潜在的新型药物靶点

本文介绍了一种利用高通量RNA干扰筛选来发现可被调控以增强溶瘤病毒治疗效果的宿主靶点的实验方案，特别是针对弹状病毒和痘苗病毒治疗，但该方法也可轻松适用于其他溶瘤病毒平台，或用于发现普遍调控病毒复制的宿主基因。...

全基因组RNA干扰筛选鉴定调控溶瘤病毒治疗的宿主因子

我们描述了一种用于临床前体内追踪癌症转移的实验方案。该方法基于一种放射性核素-荧光双模报告系统，结合了可通过无创[18F]四氟硼酸盐-PET检测的钠碘同向转运体以及用于简化体外验证的荧光蛋白。该方法不仅适用于肿瘤生物学研究，还可广泛应用于其他领域的临床前体内细胞示踪。...

放射性核素-荧光报告基因成像技术用于追踪啮齿类动物肿瘤模型中的肿瘤进展

数字聚合酶链式反应（PCR）是一种用于高灵敏度检测单核苷酸变异和DNA拷贝数变异的有效工具。本文以管中芯片格式的数字PCR为例，展示利用该技术检测人类基因组中稀有变异时需考虑的关键因素。...

采用管中芯片格式对散发性家族性腺瘤性息肉病患者进行遗传变异数字聚合酶链式反应检测

神经内分泌肿瘤（NETs）起源于神经嵴的神经内分泌细胞。这类肿瘤生长缓慢，且培养难度较大。我们提出一种替代策略，通过将小肠来源的NETs以球状体形式进行培养来实现其体外扩增。这些球状体表达小肠神经内分泌肿瘤标志物，并可用于药物测试。...

小肠神经内分泌肿瘤类球体的建立与表征

此处，我们介绍一种针对胚胎致死基因敲除的实验方案 体内 在基因工程小鼠模型来源的肿瘤中进行基因敲除，随后评估该敲除对肿瘤生长、增殖、存活、迁移、侵袭以及转录组的影响 体外 和 体内.

通过肿瘤发生中定义基因功能 离体 恶性周围神经鞘瘤细胞中 floxed 等位基因的敲除

近期研究揭示了神经元对高级别儿童胶质瘤（pHGG）细胞的影响及其双向相互作用。本研究展示了 体外...

谷氨酸能神经元与儿童高级别胶质瘤细胞在微流控装置中的共培养以评估电相互作用

本方法论文的目的是展示一种稳健且可重复的方法，用于从手术切除的胸膜间皮瘤组织中富集、生成并扩增原代肿瘤细胞系。...

原发性恶性胸膜间皮瘤肿瘤细胞系的建立与扩增

了解恶性周围神经鞘瘤的遗传分析方法，利用全基因组shRNA筛选和单细胞测序技术鉴定erbB3等治疗靶点。该计算生物学方法为开发新型癌症治疗策略提供重要依据。

利用基因分型与基因组规模的基因剔除筛选鉴定恶性外周神经鞘瘤小鼠模型中的治疗靶点

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