用于高通量聚糖分析的微阵列聚合物谱型分析（MAPP）

我们的研究聚焦于复杂聚糖在多种家庭、工业和商业系统中的存在、功能和结构。非接触式微阵列技术的进一步优化，以及我们快速获取碳水化合物结合模块序列信息的能力，正在提升我们打印和分析聚糖微阵列的水平。由于聚糖在结构上的异质性、复杂性以及生物合成过程中的变异性，其研究具有较大挑战性。

许多聚糖分析方法需要将聚糖分解为其组成的单糖。MAPP 提供了一个多功能的聚糖分析平台，能够保留大量重要的三维结构信息。首先，使用机械组织研磨仪以 27 赫兹振荡预先制备的 AIR-CDTA 混合物 2 分钟，随后以 10 赫兹振荡 2 小时。

接下来，在 4 摄氏度条件下，以 10,000 G 离心 10 分钟。将上清液转移至无菌的微量离心管中。最后，向残留的沉淀物中加入氢氧化钠和硼氢化钠的混合物。

振荡并离心后，用蒸馏水将残余沉淀物洗涤2-3次。每毫克纤维素酶向沉淀物中加入30微升。然后将试管置于酶的最适温度的加热块中孵育16小时。

将样品离心，并将上清液置于旋转摇床上保存。将所有储存的提取物在4摄氏度下以10,000 G离心10分钟。首先配制1:20的印度墨水与甘油系统缓冲液稀释液，然后在室温下以15,000 G离心10分钟。

向384孔板的第一个区域加入40微升墨水溶液和甘油体系缓冲液。然后向所有稀释1孔中加入25微升甘油体系缓冲液，向所有稀释2、3和4孔中各加入40微升。向稀释1孔中加入25微升提取的糖链样品，以1:1的比例稀释样品。

将每个样本进行四倍系列稀释：从稀释1孔中转移10微升至稀释2孔，然后使用移液器轻轻混匀。重复该步骤，将10微升样本从稀释2孔转移至稀释3孔。在对稀释4孔重复该步骤后，从此孔中弃去10微升，使所有孔的终体积均为40微升。

向最终反应板中加入 40 微升墨水溶液和甘油体系缓冲液。然后用粘性封板膜覆盖反应板，在室温下以 3,000 G 离心 10 分钟。为将样品打印到硝酸纤维素膜上，需先用甘油体系缓冲液多次清洗打印头和毛细管。

通过仅加载缓冲液的微孔板启动一次测试打印运行。要将仪器配置为直接从洁净的缓冲液储液槽中打印，请依次点击文件（File）和新建（New），然后选择打印运行（Print Run）。选择微孔板类型，并相应地调整玻片设置。

接下来，在编辑点样属性设置之前，先更改微阵列设置。单击“概览”选项卡以查看板片。最后，在“选项”选项卡下，选择使用缓冲液并计算打印时间，然后分配文件保存位置以保存文件。

保存位置后，点击“开始打印运行”以继续执行运行。在打印提取的糖链样品时，按之前的步骤对系统进行编程。在“选项”选项卡下，点击“使用源微孔板”。

最后，保存为打印的微阵列生成的唯一网格文件，以用于下游分析。打印的微阵列中也包含了定义明确的聚糖标准品作为阳性对照。所获得的选定聚糖标准品的MAPP结合谱与先前报道的表位特异性一致。

首先从硝酸纤维素膜上切下相同的打印微阵列，并将其放入适合杂交的容器中。为减少非特异性结合，向微阵列中加入MP-TBST封闭缓冲液，在旋转摇床上孵育1小时。孵育结束后，弃去缓冲液，更换为新鲜的MP-TBST缓冲液。

将芯片置于旋转摇床中，与单克隆抗体和MP-TBST共同孵育2小时。孵育结束后，移除分子探针溶液，将芯片完全浸入干净的TBST中。

立即用新鲜缓冲液替换原有缓冲液，以去除残留的探针溶液。将芯片置于旋转摇床上孵育5分钟。再次更换TBST缓冲液，并将芯片置于摇床上继续孵育5分钟。

接下来，在旋转摇床上用碱性磷酸酶标记的抗体孵育芯片2小时。孵育完成后，将微阵列洗涤，然后加入硝基蓝四氮唑（NBT）和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐（BCIP）显色液，进行显色以检测抗体结合情况。将芯片浸入洁净的自来水中以终止反应。

然后将芯片置于吸水纸之间，在室温下过夜干燥。通过将针对聚糖的单克隆抗体结合到印迹的提取物上，检测出16种非纤维素植物细胞壁多糖特异性表位的相对丰度。大多数提取的聚糖均在碱性氢氧化钠组分中被检测到。

LM10 和 LM11 在所有测试芒果品种果皮中显示出对木聚糖和阿拉伯木聚糖的强结合信号。LM10 和 LM11 优先结合大蒜根组织提取物，而对叶片组织提取物的结合较弱。LM19 代表部分甲酯化或非酯化的同型半乳糖醛酸聚糖，与某些芒果品种提取物强烈结合，且仅与咖啡果肉组分结合。