Name: 用于高通量聚糖分析的微阵列聚合物分析 （MAPP） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: 了解微阵列聚合物分析（MAPP）技术用于高通量聚糖分析的方法。该技术保留聚糖三维结构信息，通过单克隆抗体检测表位，适用于植物细胞壁多糖等生物样本的糖组学研究。

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作者谨此感谢 ArrayJet 在微阵列机器人技术方面提供的专业建议。SS 和 JS 谨此感谢清迈大学 2022 年基础基金（FF65/004）的支持。

MAPP 方法的主要实验步骤总结于图1中。
1. 样品制备
注意：此处以植物组织为例说明该方法的应用。所选植物为阿拉比卡咖啡（Coffea arabica）、蛇蒜（Allium sativum var. ophioscorodon）以及多种泰国芒果品种（Aokrong、Kam、Rad、Chokanan、Mamkamdang、Talabnak、Mahachanok 和 Nga），选择这些植物是因其具有重要的商业价值。这些植物在加工供人类食用的过程中会产生大量目前尚未充分利用的农业工业废弃物，而这些废弃物可能成为高附加值产品（包括纯化多糖）的来源。因此，应用MAPP方法对这些废弃植物生物质中的多糖组成进行表征，以用于生物资源勘探。
<ol>
	<li>将植物材料分离为不同的组织（例如根、茎和叶）。</li>
	<li>将植物组织置于40 °C的热风烘箱中干燥12–24小时（根据样品情况适当缩短或延长干燥时间）。或者，将样品在液氮中速冻，随后冷冻干燥约4天。</li>
	<li>使用研钵和研杵，或机械组织研磨仪（见材料表），配合每个离心管中的金属研磨珠，将样品研磨成细粉。 
	&#8203;注意：对于新鲜植物组织，建议在均质化前进行干燥或冷冻干燥处理。通常情况下，使用研钵和研杵即可满足大多数干燥样品的均质化需求。对于特别坚韧的样品，如谷物、豆类以及加工食品（如意大利面），在液氮中速冻可提高样品均质化的速度和效率。我们发现，机械均质化几乎适用于所有类型的样品，速度显著更快，劳动强度更低，并能有效减少因重复使用相同设备（如研钵和研杵）而导致的样品交叉污染风险。</li>
</ol>
2. 醇不溶残渣（AIR）的制备
<ol>
	<li>向50–100 mg风干并均质化的样品材料中加入1.5 mL 70% (v/v) 乙醇。</li>
	<li>充分涡旋混匀，然后在室温下以10,000 × g 离心10分钟。用移液器弃去上清液，保留沉淀。</li>
	<li>向剩余沉淀中加入1.5 mL甲醇与氯仿（1:1 [v/v]）。涡旋混匀、离心并弃去上清液，操作同步骤2.2。</li>
	<li>向剩余沉淀中加入1.5 mL 100%丙酮。涡旋混匀、离心并弃去上清液，操作同步骤2.2。</li>
	<li>将所得沉淀置于通风橱中过夜，使残留丙酮挥发，或置于真空离心浓缩仪中至干燥。 
	注意：AIR材料可在室温下保存，直至使用。</li>
</ol>
3. 糖链提取
注意：如果可能，所有提取步骤均应在组织研磨器中进行，并在每个试管中加入一个钢珠以辅助重悬。若无组织研磨器，也可通过持续搅拌或振荡方式进行提取。若无法实现上述条件，可能需要延长提取时间。
<ol>
	<li>向10 mg AIR材料中加入30 µL/mg的50 mM环己烷二胺四乙酸（CDTA；参见 材料表，pH 7.5。</li>
	<li>以 27 Hz 频率振荡&#160;2 分钟，随后 10 Hz&#160;2小时。</li>
	<li>在 10,000 x g 条件下离心 g 4 °C下离心10分钟。保留所得上清液，转移至无菌微量离心管中，并在4 °C下置于旋转摇床上保存。</li>
	<li>向残留沉淀物中加入 30 µL/mg 的 4 M NaOH + 0.1 % (w/v) NaBH4. 
	警告：NaBH4 吞咽有毒。使用个人防护装备（PPE）。在通风橱中操作。避免粉尘生成。避免吸入粉尘。切勿让产品接触水。</li>
	<li>重复步骤 3.2 至 3.3。用 dH₂O 将残余沉淀洗涤两到三次2O 以去除残留的 NaOH。</li>
	<li>加入30 µL/mg纤维素酶（建议使用GH5家族内切-1,4-β-葡聚糖酶，溶于制造商推荐的适当酶缓冲液中；参见 材料表将酶加入沉淀中，在酶的最适温度下孵育16小时。</li>
	<li>将样品在10,000 x g 4 °C 下离心 10 分钟。保留上清液，转移至洁净的微量离心管中，并在 4 °C 下置于旋转摇床上保存。样品提取后应尽快进行打印。</li>
	<li>再次以 10,000 x g 离心所有储存的提取物 g 4 °C 下 10 分钟。 
	&#8203;注意：样品必须无颗粒物和碎片。如有必要，在微阵列点样前需通过0.2 µm离心滤膜过滤。特别黏稠的样品不适合用于微阵列分析，因为微阵列点样仪的毛细管和打印头容易发生堵塞。一般原则是，所有拟用于点样的样品均应能够使用标准低体积移液器进行移液操作。</li>
</ol>
4. 标准品的制备
<ol>
	<li>制备1 mg/mL的确定糖链标准品溶液（表1) 于无菌 dH₂O 中2若使用帕氏曼作为标准品，则改用4 M NaOH溶解，溶解后用冰醋酸中和。</li>
	<li>将配制好的标准品置于4 °C旋转摇床中过夜孵育，以确保完全溶解。</li>
	<li>将所有标准品在 10,000 x g 条件下离心 10 分钟 g 4 °C 离心以沉淀任何碎片。所得上清液用于后续打印。</li>
</ol>
5. 微阵列打印
<ol>
	<li>配制1:20（v/v）的印度黑墨水/绘图墨水甘油系统缓冲液（GSB；由47%甘油、52.9%去离子水2O、0.06% Triton X-100 和 0.04% 杀菌剂［水中含 0.15%–0.17% 硝酸铜和 1.4%–2.0% 硝酸镁］，过滤除菌）（见 材料表) 并在 15,000 x g 条件下离心 10 分钟 g （室温） 
	注意：需要使用墨水溶液在打印的样品周围创建上下边框，以便在膜上直观地识别打印的微阵列。然而，墨水溶液可能含有沉淀物。所有用于打印的溶液必须无颗粒，因此在移液时应避免扰动沉淀物。当无法避免时，应弃去溶液并重新配制。该溶液难以通过过滤有效去除颗粒。</li>
	<li>向第一个384孔板的第一部分加入40 µL墨水溶液和GSB图2).</li>
	<li>向所有稀释1（D1）孔中加入25 µL GSB。向所有稀释2、3和4（D2-D4）孔中加入40 µL GSB。</li>
	<li>将提取的糖链样品和已知的糖链底物与GSB按1:1（v/v）稀释，依次向D1孔中加入25 µL提取的糖链样品。</li>
	<li>将每个样本进行连续四次稀释，从D1孔中取出10 µL样本加入D2孔中。用移液器轻轻抽吸混匀。</li>
	<li>从D2孔中取10 µL样品，加入D3孔中，重复此步骤。</li>
	<li>对 D4 孔重复上述操作。混匀后，从 D4 孔中弃去 10 µL，使每个孔的最终体积为 40 µL。</li>
	<li>向最后一块培养板的最后一个孔中加入 40 µL 墨水溶液和 GSB。</li>
	<li>用粘性板盖覆盖板子，在3,000 x g条件下离心10分钟 g （室温）。离心后确保无气泡残留，必要时重复操作。</li>
	<li>使用非接触式压电微阵列打印机器人，将样品打印到硝酸纤维素膜上（参见 材料表）按照以下步骤进行。 
	注意：以下操作建议可实现最佳打印质量；然而，具体所需参数最终取决于所使用的仪器。建议用户联系仪器制造商，以讨论其设备所需的适当自定义设置和打印参数。
	<ol>
		<li>打印前，根据需要清空废液缓冲液储液槽，并向干净的缓冲液储液槽中加入洁净的GSB。打开仪器电源，使其稳定 &#62;如果集成了湿度和温度控制系统，则需10分钟。打开微阵列仪并初始化系统。 
		注意：建议运行测试以确定仪器的内部压力。如果压力过低，则可能需要执行高压吹扫。请再次联系仪器制造商，以讨论特定仪器的具体操作方法。</li>
		<li>用 GSB 多次清洗打印头和毛细管，以去除碎屑和潜在污染物。通过仅加载一块 GSB 平板，或设置仪器直接从洁净的缓冲液储液池中打印（绕过已加载平板的样品吸取步骤），执行一次测试打印运行。 
		注意：使用硝酸纤维素膜进行测试打印并非必要；干净的显微镜载玻片已足够，且具有可在样品打印前直观评估斑点大小、形状和质量的优点。</li>
		<li>打印提取的糖链样本时，应设置系统在每个样本之间用洁净的GSB冲洗。 
		注意：通常情况下，每个打印点的样品体积为 100 pL 至 10 nL，点样尺寸范围为 20 µm 至 100 µm，具体取决于所选的样品体积。从一个 384 孔板来源打印 100 张微阵列大约需要 40 分钟，包括系统冲洗时间。最终获得的微阵列尺寸约为 1 cm2 大小。每增加一块载玻片，阵列长度将增加约1 cm。打印的微阵列设计示意图如下所示。 图3打印完成后，微阵列可立即使用，并可保存数年。若因任何原因需要重复打印，由于样品在打印过程中可能存在蒸发，建议加载新的样品板并丢弃原始样品板。</li>
		<li>每周一次，彻底清洁打印头和毛细管。操作方法为：在384孔板中加入用GSB稀释的1:20浓NaOH溶液，然后执行&#160;40分钟至1小时的打印过程到显微镜载玻片上。用户在操作前应确保该清洗溶液与其仪器兼容。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>保存为打印的微阵列生成的独特网格文件（.gal 文件），以供后续分析使用。</li>
</ol>
6. 微阵列检测
<ol>
	<li>从硝酸纤维素膜上裁下单独且相同的打印微阵列，并将其放入适当大小的探针反应容器中（例如，12孔或24孔微孔板）（参见 材料表）。阵列应平放&#160;平放在容器底部。每个探针需要一个微阵列，代表一个技术重复。</li>
	<li>为减少非特异性结合，将微阵列置于 MP-TBST 封闭缓冲液（1× Tris-缓冲盐溶液，pH 7.5，含 0.1% [v/v] TWEEN 20 [TBST]，并添加 5% [w/v] 脱脂奶粉）中孵育 1 小时；参见 材料表在旋转/摇动摇床上孵育，确保液体体积足以完全浸没整个阵列。</li>
	<li>孵育后，移除 MP-TBST，并替换为新鲜的 MP-TBST。</li>
	<li>将芯片与单克隆抗体（mAbs）或带 His 标签的碳水化合物结合模块（CBMs），或其他糖类识别分子探针（GRMPs，例如凝集素）孵育，按制造商说明稀释至 1:10–1:1,000（参见 材料表在旋转/摇摆摇床上用 MP-TBST 溶液孵育 2 小时。</li>
	<li>孵育结束后，移除分子探针溶液，加入洁净的TBST覆盖芯片，确保芯片完全浸没。为去除残留的探针溶液，立即吸去TBST，更换新鲜TBST溶液，并将芯片置于旋转/摇摆摇床孵育5分钟。5分钟后，吸去TBST，更换新鲜TBST溶液，再次置于旋转/摇摆摇床孵育5分钟。 
	注意：此步骤应重复三次，不包括初始加入TBST后立即去除的那一步。</li>
	<li>将芯片与碱性磷酸酶标记的二抗（根据需要选用抗小鼠、抗大鼠、抗兔、抗His抗体；参见 材料表在摇床或旋转摇床上用 MP-TBST 以 1:1,000 的比例稀释孵育 2 小时。 
	注意：辣根过氧化物酶标记的二抗也可使用，需与四甲基联苯胺（TMB）/过氧化氢底物配合以实现显色。</li>
	<li>孵育后，按照步骤6.5重复洗涤操作，以去除非特异性结合的二抗。</li>
	<li>用硝基蓝四氮唑盐（NBT）/5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐（BCIP）显色液覆盖芯片 材料表用于抗体结合的显色检测。静置至抗原结合位点处出现紫色沉淀斑点（通常为5-30分钟，但应密切观察芯片，避免过度饱和，因反应可能迅速发生）。 
	警告：BCIP 接触皮肤有害，可能引起呼吸道刺激。使用个人防护装备。避免粉尘形成。避免吸入粉尘。</li>
	<li>为终止反应，将芯片浸入干净的自来水并充分清洗。</li>
	<li>将芯片置于吸水纸之间，在室温下放置过夜以干燥。</li>
	<li>丢弃存在明显缺陷的芯片，并在这些情况下重复探针实验步骤（图4).</li>
</ol>
7. 分析与定量
<ol>
	<li>使用台式扫描仪以每英寸2400点（dpi）的分辨率扫描已制备的芯片阵列。将图像转换为TIFF文件，然后转换为负片图像。</li>
	<li>利用微阵列分析软件（参见材料表），将唯一的.gal网格文件叠加到每张微阵列图像上，以计算每个抗原结合位点处斑点的颜色强度，并扣除局部背景值。</li>
	<li>将网格数据导出为.txt文件，随后可手动导入Excel表格进行分析。</li>
	<li>通过先对每个样本稀释度下的斑点强度取平均，再对所有生物学重复样本取平均，计算每个样本的平均斑点信号强度值。</li>
	<li>将最高平均斑点信号强度设为100，并据此对剩余数据进行归一化处理。 
	注意：归一化后的平均斑点信号强度可利用Excel中的条件格式功能33，或R语言ggplot2包中的geom_tile函数40,41，以相对糖链表位丰度的热图形式展示。</li>
</ol>

Elucidating Glycan Structure and Occurrence Using Microarray Polymer Profiling

作者声明无利益冲突。

本文所述的MAPP技术现已成为一种成熟的聚糖分析方法。其基本原理最早于2007年提出11，但该技术持续发展，以充分利用微阵列技术、分子探针开发以及聚糖生物化学认知方面的最新进展。通常情况下，聚糖（尤其是多糖）由于结构复杂且具有异质性45，加之难以直接测序或合成1，因此相较于蛋白质和核苷酸更难分析。在许多情况下，单一技术无法明确解析聚糖的复杂性；因此，MAPP常与其他方法联合使用。这正是通常选择AIR制备作为MAPP起始步骤的原因之一，因为AIR与大多数其他聚糖分析方法兼容34，便于后续数据集的比较。
由于在制备AIR之前对样品进行了均质化处理，部分空间信息不可避免地会丢失。然而，随着多糖从样品中依次释放，各组分中表位的存在可提供有关该样品分子结构和组成的信息17。因此，选择合适的提取方案对该方法的成功至关重要。多个参数决定了提取方法的适用性：细胞结构、时间、温度、pH、压力、溶剂的离子强度以及固体颗粒样品的细度49。建议使用一系列强度逐渐增强的溶剂，以最大程度地提高成功提取组分糖链并构建样品代表性组成图谱的可能性。对于大多数样品，CDTA、NaOH和纤维素酶足以去除植物来源的储存性多糖和细胞壁多糖33,50,51,52。对于某些组织样品，包含CaCl2、HCl和Na2CO3的混合提取方案已被证明是有效的53，而海洋微藻样品可能需要添加乙二胺四乙酸（EDTA）10。
芯片应包含一系列纯度高、结构明确的糖类标准品，用作阳性对照5。所包含的标准品应根据样本的性质进行选择。一旦完成点样，需选择适当的糖结合分子探针（GRMPs）。制备针对多糖结构的杂交瘤单克隆抗体具有挑战性54；糖类结合抗体难以制备，且可能亲和力较低55。幸运的是，CBM的基因序列信息相对容易获得，可用于重组表达4以及对其结合特异性进行改造56,57。尽管目前已开发出种类丰富的GRMPs，其中大多数也可从商业渠道获得，但相较于自然界中存在的糖类结构多样性，仅有少数GRMPs被成功制备并得到充分表征58。这可能限制对某些糖结构的检测与区分能力。建议首先使用一至两种代表每种主要糖类结构的探针进行初步探测试验，这些探针的结合特异性应已有充分表征。在后续的探测试验中，可逐步扩展探针列表，以覆盖更广泛的糖类结构，并深入分析其精细结构。
尽管这一操作看似平凡，但在每次孵育步骤后确保微阵列被彻底清洗，对于杂交检测过程的成功至关重要。若未能有效去除非特异性结合的探针，则很可能在显色后产生高背景信号，从而掩盖实验结果。在此情况下，必须重新进行杂交检测，并从使用新的微阵列开始。此外，应尽量减少对芯片的接触，仅能用镊子夹持芯片边缘进行操作；硝酸纤维素膜质地脆而易损。显色液会积聚在膜的裂纹和褶皱中，导致过度饱和，从而妨碍阵列的分析。
MAPP 方法快速、灵活且便捷。该方法适用于来源于任何生物或工业系统的动物、微生物或植物聚糖，只要这些聚糖能够被提取并固定在硝酸纤维素膜上，并且具备相应的分子探针。所获得的数据可提供详细的半定量组成信息，而此类信息通常难以通过其他方式直接获取。 通过 其他聚糖分析方法。

聚糖在所有生命领域中普遍存在，其结构和功能的多样性远超其他大分子1。然而，由于聚糖结构复杂、生物合成过程及糖苷键连接方式具有高度变异性，且缺乏解析聚糖结构的适当方法，目前对聚糖结构与功能多样性的理解仍相对有限2。
许多聚糖分析技术具有破坏性，需要将聚糖分解为其组成的单糖，这可能会掩盖相关的三维结构和生物学背景3。相比之下，单克隆抗体（mAbs）、碳水化合物结合模块（CBMs）、凝集素、病毒凝集素以及微生物黏附素，统称为聚糖识别分子探针（GRMPs）4，能够识别并结合特定表位，可作为工具用于在复杂的多聚糖基质中检测和区分不同的聚糖5,6。
本文介绍了微阵列聚合物分析（MAPP），这是一种快速、通用且非破坏性的聚糖分析方法，适用于多种生物样品。该方法旨在为来自不同生物系统及工业/商业系统的聚糖分析提供一种稳健且高通量的技术。MAPP 结合了针对聚糖的分子探针的识别特异性与可重复、高性能的微阵列筛选技术，能够并行分析数千种分子相互作用。该方法的输出结果可对目标样品或组织中聚糖的组成及相对丰度提供诊断性见解。
MAPP 可作为独立的单一方法使用，也可与其他生物化学技术结合使用，例如免疫荧光显微镜技术7,8,9以及单糖或连接分析10,11。该技术还可用于绘制新型糖结合微生物蛋白（GRMPs）的表位特异性，使用的是印有纯度高且结构明确的寡糖标准品的芯片12。与酶联免疫吸附测定（ELISA）等其他方法相比，MAPP 的主要优势在于其适用于微量样品体积13,14。此外，MAPP 可实现显著更高的高通量分析15，并且提供了一种有效的样品保存形式，因为当样品被固定在硝酸纤维素膜上后，呈干燥且稳定的状态16。
GRMPs 的结合通常依赖于多个连续的糖残基，这些糖残基共同形成一个结合位点（表位），该位点对特定的多糖类别（木聚糖、甘露聚糖、木葡聚糖等）具有特异性17。相比之下，使用大多数生物化学技术（如单糖组成分析或甲基化分析）所测定的单个糖残基（木糖、甘露糖、葡萄糖）可能是多种多糖类别的组分，因此难以准确归属18。
MAPP 的开发旨在应对一项技术空白，即利用少量材料快速分析多种来源的糖类分子。MAPP 借助了过去三十年中已开发并表征的大量糖类识别分子探针（GRMPs）12,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32。MAPP 的发展是一个不断迭代的过程，该技术持续得到改进和优化。目前已有大量文献报道了 MAPP 在各类天然及工业系统中的应用，其中糖类分子发挥着核心作用5,6,9,10,21,33,34,35,36,37,38,39。本文将介绍 MAPP 当前的技术现状。

<table><tbody><tr><td>1,3:1,4-&amp;beta;-D-葡聚糖，地衣聚糖（冰岛苔藓）</td><td>Megazyme</td><td>P-LICHN</td><td></td></tr><tr><td>1,4-&amp;beta;-D-甘露聚糖</td><td>Megazyme</td><td>P-MANCB</td><td></td></tr><tr><td>384孔微孔板</td><td>Greiner Bio-One</td><td>M1686</td><td></td></tr><tr><td>5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐（BCIP）</td><td>Melford</td><td>B74100-1.0</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Sigma</td><td>270725</td><td></td></tr><tr><td>碱性磷酸酶标记的AffiniPure山羊抗小鼠IgG（H+L）</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-055-003</td><td></td></tr><tr><td>碱性磷酸酶标记的AffiniPure山羊抗大鼠IgG（H+L）</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>112-055-003</td><td></td></tr><tr><td>碱性磷酸酶标记的AffiniPure兔抗His标签抗体</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>300-055-240</td><td></td></tr><tr><td>阿拉伯木聚糖（小麦）</td><td>Megazyme</td><td>P-WAXYL</td><td></td></tr><tr><td>Array-Pro 分析软件</td><td>Media Cybernetics</td><td>版本 6.3</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Bacillus &lt;/em&gt;sp. Cellulase 5A (BCel5A)</td><td>NZYTech</td><td>CZ0564</td><td></td></tr><tr><td>BAM 抗体</td><td>SeaProbes</td><td>多种</td><td></td></tr><tr><td>黑色绘图墨水（印度墨水）</td><td>Winsor &amp; Newton</td><td>GWD030</td><td></td></tr><tr><td>碳水化合物结合模块</td><td>NZYTech</td><td>多种</td><td></td></tr><tr><td>CCRC 抗体</td><td>CarboSource</td><td>多种</td><td></td></tr><tr><td>CDTA</td><td>Sigma</td><td>319945</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma</td><td>PHR1552</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma</td><td>1.11727</td><td></td></tr><tr><td>半乳聚糖（马铃薯）</td><td>Megazyme</td><td>P-GALPOT</td><td></td></tr><tr><td>半乳甘露聚糖（角豆）</td><td>Megazyme</td><td>P-GALML</td><td></td></tr><tr><td>甘油溶液</td><td>Sigma</td><td>49781-5L</td><td></td></tr><tr><td>黄芪胶（豆科植物）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1128</td><td></td></tr><tr><td>INCh 抗体</td><td>INRA</td><td>多种</td><td></td></tr><tr><td>LM 和 JIM 抗体</td><td>PlantProbes</td><td>多种</td><td></td></tr><tr><td>Marathon Argus 微阵列打印机</td><td>ArrayJet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>单克隆抗体</td><td>Biosupplies Australia</td><td>多种</td><td></td></tr><tr><td>NaBH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>452882</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>硝基蓝四氮唑（NBT）</td><td>Melford</td><td>N66000-1.0</td><td></td></tr><tr><td>硝酸纤维素膜</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88018</td><td></td></tr><tr><td>果胶（甲酯化程度 46%）</td><td>Danisco</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>ProClin 200</td><td>Sigma</td><td>48171-U</td><td></td></tr><tr><td>鼠李半乳糖醛酸聚糖（大豆果胶纤维）</td><td>Megazyme</td><td>P-RHAGN</td><td></td></tr><tr><td>旋转混合器</td><td>Fisher Scientific</td><td>88-861-050</td><td></td></tr><tr><td>旋转/摇床振荡器</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>脱脂奶粉</td><td>Marvel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心过滤器</td><td>Costar Spin-X</td><td>8160</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢珠</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>Qiagen</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>93362</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-250ML</td><td></td></tr><tr><td>吐温 20</td><td>Sigma</td><td>P9416-100ML</td><td></td></tr><tr><td>木聚糖（山毛榉木）</td><td>Megazyme</td><td>P-XYLNBE</td><td></td></tr><tr><td>木葡聚糖（罗望子）</td><td>Megazyme</td><td>P-XYGLN</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-葡聚糖（燕麦）</td><td>Megazyme</td><td>P-BGOM</td><td></td></tr></tbody></table>

用于高通量聚糖分析的微阵列聚合物谱型分析（mapp）

Microarray Polymer Profiling (MAPP) for High-Throughput Glycan Analysis

微阵列聚合物谱型分析（MAPP）是一种稳健且可重复的方法，可系统性地确定多种生物样品中聚糖和糖缀合物的组成及相对丰度，这些样品包括植物和藻类组织、食品材料以及人类、动物和微生物样品。微阵列技术为该方法的有效性提供了基础，通过提供微型化、高通量的筛选平台，仅需少量分析物即可同时表征聚糖与高度特异性的聚糖靶向分子探针之间的数千种相互作用。组成性聚糖通过化学和酶法进行分级分离，随后从样品中依次提取并直接固定在硝酸纤维素膜上。聚糖的组成通过特异性识别聚糖的分子探针与已提取并打印的分子之间的结合来确定。MAPP 方法可与传统的聚糖分析技术（如单糖和连接分析以及质谱法）相互补充。然而，聚糖识别分子探针能够提供有关聚糖结构构型的信息，有助于阐明其生物学相互作用和功能角色。

采用MAPP方法测定多种农业生物质废弃物中的聚糖组成，这些废弃物包括几种泰国北部品种的芒果皮、Coffea arabica 咖啡果果肉及咖啡豆加工废料，以及泰国黑蒜（Allium sativum var. ophioscorodon）的根、茎和叶片组织。多种植物来源的多糖已被用作食品工业中的功能性成分42,43。因此，本实验旨在推断这些丰富但目前尚未充分利用的农工业废弃物是否可作为高附加值纯多糖的潜在来源。
AIR材料通常用于制备用于聚糖分析的样品44。使用AIR具有多个优势：通过溶剂处理可有效去除内源性CAZymes、代谢物、小分子糖类、脂质和色素，从而富集多糖和结构蛋白34。此外，制备AIR是一种快速且有效提高样品保存期限的方法，因其具有热稳定性，可保存数年。
采用 CDTA、NaOH 和纤维素酶依次从植物 AIR 材料中提取出三种混合的组成糖类组分。CDTA 可螯合 Ca2+ 离子，从而去除通过 Ca2+ 交联的去酯化果胶，这些果胶存在于植物细胞壁中45。碱性条件主要通过破坏半纤维素与纤维素微纤丝之间的氢键以及酯键的皂化作用，释放出甘露聚糖、木聚糖和 β-葡聚糖等半纤维素，同时也可破坏木质素与半纤维素之间的连接46。使用来自 Bacillus spp. 的重组内切-1,4-β-葡聚糖酶降解结构纤维素微纤丝中的无定形区域，从而释放出与细胞壁内纤维素结合的残余糖类47。尽管该方法能有效将糖类分为上述三大类组分，但需注意的是，这些样品并非完全纯净；由于提取方法本身的特性，若样品中存在半纤维素，则不可避免地会在 CDTA 和纤维素酶提取组分中不同程度地被提取并检测到。同样地，若样品中含有果胶，也将在 NaOH 提取组分中被检测到。
使用一种非接触式压电微阵列打印机器人将提取的聚糖组分固定在硝酸纤维素膜上 通过 非共价结合11，形成300个相同的微阵列。定义的糖类标准品（表1）也被包含在打印的微阵列中作为阳性对照（图5）。所选糖类标准品的MAPP结合谱型与先前报道的表位特异性一致。例如，LM21对多种甘露聚糖多糖（半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖）表现出强结合，而LM22仅对半乳甘露聚糖表现出弱结合25同样，LM19 优先结合去酯化的同型半乳糖醛酸聚糖48 LM15 与罗望子种子木葡聚糖结合23.
通过将特异性识别聚糖的单克隆抗体（表2）与点样提取物结合，检测了16种非纤维素植物细胞壁多糖特征性表位的相对丰度（图6）。大多数提取的聚糖在碱性NaOH组分中被检测到。在所有测试的芒果品种果皮中，均检测到针对木聚糖/阿拉伯木聚糖的单克隆抗体LM10和LM11有强结合信号。在大蒜样品中，LM10和LM11优先结合根组织提取物（大蒜R），而在叶组织提取物（大蒜L）中仅表现出微弱结合。代表部分甲酯化或非酯化同型半乳糖醛酸聚糖的LM19，在部分芒果品种提取物（Aokrong和Talabnak）中表现出强结合，但在其他品种（Chokanan、Mamkamdang、Mahachanok和Nga）中结合微弱或无法检测。此外，LM19仅结合咖啡果皮组分，而不结合此前被认为含有半纯化咖啡果胶的咖啡豆加工废弃物（未发表数据）。
<img alt="匀浆过程流程图；使用CDTA、NaOH、纤维素酶提取糖链；微阵列分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65443/65443fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：MAPP方法的主要实验步骤。（A）样品被匀浆处理形成细粉。（B）对匀浆后的样品进行处理以分离其酸不溶性残渣（AIRs）。（C）使用定制的提取程序依次提取其中的组成糖链。（D）根据板布局，将提取的糖链组分、墨水和GSB转移至384孔板中，用于打印到硝酸纤维素膜上。（E）打印后的微阵列与选定的糖链识别分子探针（GRMPs）进行孵育。（F）定量并分析GRMPs与打印糖链组分的结合信号，随后以热图形式展示数据。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65443/65443fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="编织图案图表；带有符号的彩色网格，行A-P，列1-24；针法序列。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65443/65443fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：384孔板加样布局示例，用于样品、墨水和GSB的加载，每种提取的聚糖样品/标准品包含四个稀释度。 不同颜色表示使用不同提取试剂获得的样品，而不同色阶代表系列稀释。编码中的第一个数字代表样品编号，末尾数字代表稀释编号（D1表示第一稀释，D2表示第二稀释，依此类推）。例如，标记为“12D3”的孔代表第12号聚糖样品的第三稀释。孔板应划分为八个相同的区域，每个区域包含六列八行。第一块板的第一个区域应仅包含墨水和缓冲液，并参照示例板布局。随后根据板布局将提取的聚糖样品加载到后续的板区域中。不同的提取试剂不应加载到同一板区域中。如果样品数量不足以填满整个区域，则该区域中剩余的所有孔均应加入缓冲液；不得留有任何空孔。如果需要使用多块板，在所有样品加载完成后，下一个区域应包含三列交替的墨水和GSB——这可能不是第八个区域，具体取决于待打印样品的数量。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65443/65443fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="矩阵网格图；数字序列；教育数据表示；表格分析方法。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65443/65443fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：打印微阵列设计的示意图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65443/65443fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="凝胶电泳结果；垂直条带排列；DNA片段化分析；实验示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65443/65443fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：代表性微阵列图示。 （A）无结合信号。（B）结合信号被高背景信号掩盖。（C）因NBT/BCIP过饱和导致普遍的蓝色/紫色染色。（D）因底物浓度过高导致探针杂交缺陷。（E）因打印头不洁净导致打印缺陷。（F）仅在少数样品上出现强结合信号。（G）在多个样品上出现强结合信号。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65443/65443fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="多糖结合热图；示意图；探针与碳水化合物；结合强度颜色标尺。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65443/65443fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：单克隆抗体与已定义的糖链标准品的结合，用于验证打印和探针检测过程。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65443/65443fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="通过免疫标记热图分析植物细胞壁多糖结合；CDTA、NaOH、纤维素酶提取。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65443/65443fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图6：从农业生物质废弃物中提取的聚糖的MAPP分析。 样品包括咖啡果肉废弃物（咖啡果肉和咖啡果胶）、多种泰国芒果品种的果皮（AO，Aokrong；KO，Kam；RD，Rad；CH，Chokanan；MA，Mamkamdang；TL，Talabnak；MH，Mahachanok；NG，Nga）以及黑蒜的叶片（Garlic L）、茎（Garlic S）、鳞茎（Garlic BG）和根（Garlic R），提取方法采用CDTA、NaOH和纤维素酶（Bacillus spp. cellulase 5A）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65443/65443fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
表1：在MAPP分析中用作阳性对照的已定义商用多糖标准品。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65443/65443_Table%201.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表2：用于检测提取植物聚糖微阵列的聚糖特异性单克隆抗体。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65443/65443_Table%202.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>

微阵列聚合物分析（MAPP）是一种用于生物样本中糖类成分分析的高通量技术。

用于高通量聚糖分析的微阵列聚合物谱型分析（MAPP）

微阵列聚合物分析（MAPP）是一种稳健且可重复的方法，用于系统性地确定糖类的组成及相对丰度……

我们的研究聚焦于复杂聚糖在多种家庭、工业和商业系统中的存在、功能和结构。非接触式微阵列技术的进一步优化，以及我们快速获取碳水化合物结合模块序列信息的能力，正在提升我们打印和分析聚糖微阵列的水平。由于聚糖在结构上的异质性、复杂性以及生物合成过程中的变异性，其研究具有较大挑战性。许多聚糖分析方法需要将聚糖分解为其组成的单糖。MAPP 提供了一个多功能的聚糖分析平台，能够保留大量重要的三维结构信息。首先，使用机械组织研磨仪以 27 赫兹振荡预先制备的 AIR-CDTA 混合物 2 分钟，随后以 10 赫兹振荡 2 小时。接下来，在 4 摄氏度条件下，以 10,000 G 离心 10 分钟。将上清液转移至无菌的微量离心管中。最后，向残留的沉淀物中加入氢氧化钠和硼氢化钠的混合物。振荡并离心后，用蒸馏水将残余沉淀物洗涤2-3次。每毫克纤维素酶向沉淀物中加入30微升。然后将试管置于酶的最适温度的加热块中孵育16小时。将样品离心，并将上清液置于旋转摇床上保存。将所有储存的提取物在4摄氏度下以10,000 G离心10分钟。首先配制1:20的印度墨水与甘油系统缓冲液稀释液，然后在室温下以15,000 G离心10分钟。向384孔板的第一个区域加入40微升墨水溶液和甘油体系缓冲液。然后向所有稀释1孔中加入25微升甘油体系缓冲液，向所有稀释2、3和4孔中各加入40微升。向稀释1孔中加入25微升提取的糖链样品，以1:1的比例稀释样品。将每个样本进行四倍系列稀释：从稀释1孔中转移10微升至稀释2孔，然后使用移液器轻轻混匀。重复该步骤，将10微升样本从稀释2孔转移至稀释3孔。在对稀释4孔重复该步骤后，从此孔中弃去10微升，使所有孔的终体积均为40微升。向最终反应板中加入 40 微升墨水溶液和甘油体系缓冲液。然后用粘性封板膜覆盖反应板，在室温下以 3,000 G 离心 10 分钟。为将样品打印到硝酸纤维素膜上，需先用甘油体系缓冲液多次清洗打印头和毛细管。通过仅加载缓冲液的微孔板启动一次测试打印运行。要将仪器配置为直接从洁净的缓冲液储液槽中打印，请依次点击文件（File）和新建（New），然后选择打印运行（Print Run）。选择微孔板类型，并相应地调整玻片设置。接下来，在编辑点样属性设置之前，先更改微阵列设置。单击“概览”选项卡以查看板片。最后，在“选项”选项卡下，选择使用缓冲液并计算打印时间，然后分配文件保存位置以保存文件。保存位置后，点击“开始打印运行”以继续执行运行。在打印提取的糖链样品时，按之前的步骤对系统进行编程。在“选项”选项卡下，点击“使用源微孔板”。最后，保存为打印的微阵列生成的唯一网格文件，以用于下游分析。打印的微阵列中也包含了定义明确的聚糖标准品作为阳性对照。所获得的选定聚糖标准品的MAPP结合谱与先前报道的表位特异性一致。首先从硝酸纤维素膜上切下相同的打印微阵列，并将其放入适合杂交的容器中。为减少非特异性结合，向微阵列中加入MP-TBST封闭缓冲液，在旋转摇床上孵育1小时。孵育结束后，弃去缓冲液，更换为新鲜的MP-TBST缓冲液。将芯片置于旋转摇床中，与单克隆抗体和MP-TBST共同孵育2小时。孵育结束后，移除分子探针溶液，将芯片完全浸入干净的TBST中。立即用新鲜缓冲液替换原有缓冲液，以去除残留的探针溶液。将芯片置于旋转摇床上孵育5分钟。再次更换TBST缓冲液，并将芯片置于摇床上继续孵育5分钟。接下来，在旋转摇床上用碱性磷酸酶标记的抗体孵育芯片2小时。孵育完成后，将微阵列洗涤，然后加入硝基蓝四氮唑（NBT）和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐（BCIP）显色液，进行显色以检测抗体结合情况。将芯片浸入洁净的自来水中以终止反应。然后将芯片置于吸水纸之间，在室温下过夜干燥。通过将针对聚糖的单克隆抗体结合到印迹的提取物上，检测出16种非纤维素植物细胞壁多糖特异性表位的相对丰度。大多数提取的聚糖均在碱性氢氧化钠组分中被检测到。LM10 和 LM11 在所有测试芒果品种果皮中显示出对木聚糖和阿拉伯木聚糖的强结合信号。LM10 和 LM11 优先结合大蒜根组织提取物，而对叶片组织提取物的结合较弱。LM19 代表部分甲酯化或非酯化的同型半乳糖醛酸聚糖，与某些芒果品种提取物强烈结合，且仅与咖啡果肉组分结合。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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