Name: 一种分离线粒体接触位点的改进方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-16T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: 学习分离线粒体接触位点的改进方法，用于研究线粒体膜结构与脂质转运机制。本方法通过温和超声处理酵母线粒体，结合密度梯度离心技术，成功分离MICOS复合物及CQD1形成的新型接触位点，为理解线粒体嵴形态发生与细胞活力调控提供重要实验基础。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

M.E.H. 感谢德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，DFG）提供的经费支持，项目编号为 413985647。作者们感谢慕尼黑路德维希-马克西米利安大学的 Michael Kiebler 博士&#160;给予的慷慨且广泛的支持。我们感谢 Walter Neupert 在科学上的指导、有益的讨论以及持续的启发。&#160;J.F. 感谢慕尼黑生命科学研究生院（LSM）提供的支持。

1. 缓冲液与贮存液
<ol>
	<li>用去离子水配制 1 M 3-吗啉丙磺酸（MOPS）溶液，pH 7.4。4 °C 保存。</li>
	<li>用去离子水配制 500 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）溶液，pH 8.0。室温保存。</li>
	<li>用去离子水配制 2.4 M 山梨醇溶液。高压灭菌后室温保存。</li>
	<li>用去离子水配制 2.5 M 蔗糖溶液。高压灭菌后室温保存。</li>
	<li>用异丙醇配制 200 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF）溶液。−20 °C 保存。 
	警告：PMSF 吞食后有毒，可引起严重皮肤灼伤和眼睛损伤。避免吸入粉尘，操作时须佩戴防护手套和护目镜。</li>
	<li>用去离子水配制 72% 三氯乙酸（TCA）溶液。4 °C 保存。 
	警告：TCA 可能引起呼吸道刺激、严重皮肤灼伤和眼睛损伤。避免吸入粉尘，操作时须佩戴防护手套和护目镜。</li>
	<li>配制 SM 缓冲液：20 mM MOPS 和 0.6 M 山梨醇，pH 7.4。</li>
	<li>配制膨胀缓冲液：20 mM MOPS、0.5 mM EDTA、1 mM PMSF 和蛋白酶抑制剂混合物，pH 7.4。</li>
	<li>配制蔗糖梯度缓冲液：在 20 mM MOPS 和 0.5 mM EDTA（pH 7.4）中分别配制 0.8 M、0.96 M、1.02 M、1.13 M 和 1.3 M 蔗糖溶液。 
	注意：所有缓冲液均可在 4 °C 保存；但建议将含蔗糖的缓冲液保存在 −20 °C，以防止真菌生长。蛋白酶抑制剂需在使用前新鲜加入。</li>
</ol>
2. 亚线粒体囊泡的制备
<ol>
	<li>根据已建立的方案34,35新鲜制备粗酵母线粒体。 
	注意：本实验所用线粒体来源于 Saccharomyces cerevisiae。无需制备不含其他细胞器的梯度纯线粒体。</li>
	<li>用移液器将10 mg新鲜制备的线粒体重悬于1.6 mL SM缓冲液（4 °C）中（图2，步骤1）。</li>
	<li>将线粒体悬液转移至预冷的100 mL锥形瓶中。</li>
	<li>用20 mL玻璃移液器缓慢加入16 mL膨胀缓冲液。加液过程中在冰上持续轻柔搅拌。该渗透处理可使水分进入基质腔。线粒体内膜的膨胀将导致外膜破裂，但两层膜仍会在接触位点处保持连接9（图2，步骤2）。</li>
	<li>在冰上持续轻柔搅拌孵育样品30 min。</li>
	<li>用5 mL玻璃移液器缓慢加入5 mL 2.5 M蔗糖溶液，使样品中蔗糖浓度升至约0.55 M。该渗透处理可引起基质水分外流36。内膜收缩旨在最大化其与外膜残余片段之间的距离，从而降低经超声处理后形成内膜与外膜人工杂合囊泡的可能性（图2，步骤3）。</li>
	<li>在冰上轻柔搅拌孵育样品15 min。</li>
	<li>对线粒体进行超声处理，以生成亚线粒体膜囊泡（图2，步骤4）。
	<ol>
		<li>将线粒体悬液转移至预冷的玫瑰花式细胞室中。</li>
		<li>在冰浴中冷却玫瑰花式细胞室的同时，以10%振幅超声处理线粒体悬液30 s。</li>
		<li>将悬液在冰浴中静置30 s。</li>
		<li>重复步骤2.8.2和步骤2.8.3共三次。 
		注意：超声条件将因所用超声仪不同而有所差异。需针对不同仪器进行优化。过强的超声处理将导致由线粒体内膜和外膜组成的人工囊泡形成。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 分离线粒体亚结构囊泡
<ol>
	<li>在 4 °C 条件下，以 20,000 × g 离心 20 分钟，将生成的囊泡与未破裂的完整线粒体分离。完整的线粒体会形成沉淀，而囊泡则保留在上清液中。</li>
	<li>浓缩囊泡混合物。
	<ol>
		<li>将上清液转移至新的超速离心管中。</li>
		<li>使用配备 0.8 mm × 120 mm 套管的 1 mL 注射器，在管底加入 0.3 mL 的 2.5 M 蔗糖溶液作为垫层。</li>
		<li>在 4 °C 条件下以 118,000 × g 离心 100 分钟。 
		注：此处使用最大半径为 153.1 mm 的摆动转头。离心条件与所用转头密切相关，若使用其他转头，需相应调整离心参数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>离心后，囊泡将出现在蔗糖垫层的顶部，呈圆盘状。弃去约 90% 的上清液。通过上下吹打，将剩余缓冲液（包括 2.5 M 蔗糖）中的浓缩囊泡重悬，从而收集囊泡。将悬液转移至预冷的 Dounce 匀浆器中。</li>
	<li>使用聚四氟乙烯材质的 Potter 匀浆器，至少进行 10 次匀浆操作。</li>
	<li>制备蔗糖梯度。
	<ol>
		<li>制备 11 mL 的五步阶梯梯度（各层分别为 1.3 M、1.13 M、1.02 M、0.96 M 和 0.8 M 蔗糖，溶于 20 mM MOPS 和 0.5 mM EDTA，pH 7.4），每层体积为 2.2 mL。 
		注：建议使用折光仪测量并调整蔗糖浓度；但若无此设备，也可省略。取 10 µL 缓冲液加至折光仪上，测定相应的折射率。蔗糖浓度的计算公式如下： 
		<img alt="光学实验中蔗糖浓度分析的折射率方程" src="/files/ftp_upload/65444/65444eq01v2.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 1"> 
		1.3333 代表水的折射率。0.048403 是从水溶液中摩尔折射率与蔗糖浓度的线性关系中获得的蔗糖特异性换算系数37。</li>
		<li>将最高浓度的蔗糖溶液加入离心管中，并将离心管置于 −20 °C。待该层完全冻结后再加入下一层，依此操作直至加完最后一层，将制备好的梯度保存于 −20 °C。 
		注：实验开始前，需将冻结的梯度转移至 4 °C 使其充分解冻，此过程约需 3 小时。本实验所用离心转头为容量 13.2 mL 的摆动转头。若使用其他转头，需相应调整各梯度层的体积。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用折光仪测定样品的蔗糖浓度。若无折光仪，可假设蔗糖浓度为 2 M。该假设浓度将作为下一步操作的依据。</li>
	<li>通过加入适量的 20 mM MOPS、0.5 mM EDTA、1 mM PMSF 和蛋白酶抑制剂混合物（pH 7.4），将蔗糖浓度调整至 0.6 M。若蔗糖浓度未实测而按 2 M 估算，则建议在调整后检测浓度是否足够低。取少量样品（约 50 µL）加至含 200 µL 0.8 M 蔗糖的试管上层。样品应停留在 0.8 M 蔗糖溶液的上方，不发生下沉。</li>
	<li>将样品（约 1 mL）小心加至蔗糖梯度上方（保留 10% 作为后续对照）。加样时需小心操作，避免扰动梯度（图 2，步骤 5）。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 200,000 × g 离心 12 小时，以分离囊泡。若条件允许，应设置离心机为慢加速和慢减速模式，以避免扰动梯度（图 2，步骤 6）。 
	注：此处使用最大半径为 153.1 mm 的摆动转头。离心条件与所用转头密切相关，若使用其他转头，需相应调整离心参数。</li>
	<li>使用 1 mL 移液器自上而下以 700 µL 为一份收集梯度，共可收集 17 份，以获得足够的分辨率。</li>
</ol>
4. 线粒体亚微粒泡的分析
<ol>
	<li>通过将各组分依次进行两次三氯乙酸（TCA）沉淀38，浓缩蛋白质，以制备 SDS-PAGE 样品。
	<ol>
		<li>向各个组分中加入 200 µL 72% 的 TCA，混匀至溶液均匀。冰上孵育 30 分钟，然后在 20,000 × g、4 °C 条件下离心 20 分钟，收集沉淀的蛋白质。弃去上清液，加入 500 µL 28% TCA 溶液，充分混匀后重复离心步骤。</li>
		<li>用 1 mL 预冷至 −20°C 的丙酮洗涤沉淀，于 20,000 × g、4 °C 离心 10 分钟。弃去上清液，让沉淀在空气中自然干燥。将沉淀重悬于 60 µL SDS 样品缓冲液中，并在 95 °C 孵育 5 分钟。 
		注：第一次 TCA 沉淀后，尤其在高密度组分中会残留大量蔗糖。额外的 TCA 沉淀步骤可去除这些蔗糖。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>取每种组分各 20 µL 进行 SDS-PAGE39 及免疫印迹分析40,41,42,43。</li>
</ol>

Isolation of Mitochondrial Contact Sites

作者声明不存在利益冲突。

线粒体亚组分分离是一项具有多个高度复杂步骤的实验。因此，我们旨在进一步改进并在一定程度上简化我们已建立的方法32。此前面临的挑战主要包括需要使用复杂且高度专业化的设备，这些设备往往是自行搭建的装置，同时该方法还存在耗时长、能耗高的问题。为此，我们尝试去除用于制备和收集线性梯度的泵和自行搭建装置，转而采用阶梯梯度。重要的是，我们发现，至少在按照本文所述方法制备时，梯度在离心过程中会自然转变为线性梯度，因此该替代方案是可行的。该方法具有以下优势：（i）无需梯度混合器，从而减少了所需设备；（ii）节省实验当天的时间，因为梯度可预先制备；（iii）按照所述方法（包括在逐层叠加前将各梯度组分预先冷冻）制备时，具有高度可重复性（图3）。这些梯度亦可在−20°C长期保存。此外，本方法建议的沉降梯度加样方式也比类似方法中所述需将囊泡混合物置于梯度下方的加样方式更为简便9,32。浮力梯度加样需要使用带有长针头的注射器穿过已制备好的梯...

线粒体在真核生物中执行多种不同功能，其中最为人熟知的是通过氧化磷酸化产生ATP。其他功能包括铁硫簇的合成、脂质合成，以及在高等真核生物中参与Ca2+信号传导和诱导细胞凋亡1,2,3,4。这些功能与其复杂的超微结构密不可分。
线粒体的超微结构最初通过电子显微镜观察得以描述5。研究表明，线粒体是结构相当复杂的细胞器，由两层膜组成：线粒体外膜和线粒体内膜。这两层膜形成了两个水相区室：膜间隙和基质。线粒体内膜还可进一步分为不同的区域。内边界膜紧邻外膜，而嵴则形成向内凹陷的结构。所谓的嵴连接（crista junctions）将内边界膜与嵴相连（图1）。此外，渗透压收缩的线粒体电子显微照片显示，存在一些位点，其线粒体膜紧密连接6,7。这些被称为接触位点（contact sites）的结构由跨越两层膜的蛋白质复合物构成（图1）。这些相互作用位点被认为对细胞存活至关重要，因其在调控线粒体动态变化与遗传、以及细胞质与基质之间代谢物和信号传递过程中具有重要作用8。
线粒体内膜中的MICOS复合物可能是目前研究最深入且功能最多样的膜接触位点形成复合物。MICOS于2011年在酵母中被首次描述，由六个亚基组成9,10,11Mic60、Mic27、Mic26、Mic19、Mic12 和 Mic10。这些蛋白形成一个定位于嵴连接处的约 1.5 MDa 的复合物9,10,11删除任一核心亚基（Mic10 或 Mic60）均会导致该复合物的缺失9,11，这表明这两个亚基对于MICOS的稳定性至关重要。有趣的是，MICOS不仅形成一个，而是与多种线粒体外膜蛋白及复合物形成多个接触位点：包括TOM复合物11,12，TOB/SAM复合物9,12,13,14,15,16Fzo1-Ugo1 复合物9, Por110，OM4510，和 Miro17这强烈表明MICOS复合物参与了多种线粒体过程，例如蛋白质导入、磷脂代谢以及线粒体超微结构的形成。18后一种功能可能是其主要功能&#160;MICOS，由于通过缺失MICOS复合物诱导 MIC10&#160;或 MIC60&#160;导致线粒体超微结构异常，几乎完全缺乏规则的嵴。相反，出现大量与内边界膜无连接的内部膜性囊泡并发生积聚19, 20重要的是，MICOS 在从酵母到人类的进化过程中，其结构和功能均高度保守。&#160;人类21MICOS 亚基突变与严重人类疾病之间的关联也凸显了其对高等真核生物的重要性22,23尽管MICOS具有高度多功能性，但根据我们未发表的观察结果，必然还存在其他接触位点。事实上，已鉴定出多个其他接触位点，例如线粒体融合装置Mgm1-Ugo1/Fzo1。24,25,26&#160;或参与线粒体特异性磷脂心磷脂生物合成的 Mdm31-Por127最近，我们改进了该方法，由此在鉴定MICOS的基础上，进一步将Cqd1鉴定为一种新型膜接触位点的组成部分，该位点与外膜复合物Por1-Om14相互作用形成28有趣的是，这一接触位点似乎还参与多种过程，如线粒体膜稳态、磷脂代谢以及辅酶Q的分布28,29.
此处，我们采用了一种此前描述过的线粒体分级分离方法的改进版本9,30,31,32,33。线粒体经渗透处理后，其外膜被破坏，基质空间发生收缩，仅在膜接触位点处使内外膜保持紧密相邻。通过温和超声处理，可由此生成仅包含线粒体外膜、或仅包含线粒体内膜、或含有双膜接触位点的囊泡。由于线粒体内膜的蛋白与脂质比例远高于外膜，因此线粒体内膜囊泡的密度高于线粒体外膜囊泡。利用这一密度差异，可通过蔗糖密度梯度离心法分离不同膜来源的囊泡。因此，线粒体外膜囊泡聚集于低浓度蔗糖区域，而线粒体内膜囊泡则富集于高浓度蔗糖区域。含有膜接触位点的囊泡则集中于中等浓度蔗糖区域（图2）。以下实验方案详细描述了这一改进方法，与我们此前建立的方法32相比，该方法所需专用设备更少，耗时更短，能耗更低，为鉴定潜在的膜接触位点蛋白提供了有力工具。

<table><tbody><tr><td>13.2 mL，开口超薄透明管，14 x 89 mm</td><td>Beckman Instruments, Germany</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>50 mL，开口厚壁聚碳酸酯开口管，29 x 104 mm</td><td>Beckman Instruments, Germany</td><td>363647</td><td></td></tr><tr><td>A-25.50 固定角转子-铝制，8 x 50 mL，25,000 rpm，75,600 × g</td><td>Beckman Instruments, Germany</td><td>363055</td><td></td></tr><tr><td>阿贝折射仪</td><td>Zeiss, Germany</td><td></td><td>已停产，&lt;br/&gt; 可使用任意阿贝折射仪</td></tr><tr><td>accu-jet pro 移液控制器</td><td>Brandtech, USA</td><td>BR26320</td><td>已停产，&lt;br/&gt; 任何移液控制器均可满足要求</td></tr><tr><td>1000 mL 烧杯</td><td>DWK Life Science, Germany</td><td>C118.1</td><td></td></tr><tr><td>Branson&amp;nbsp; Digital Sonifier W-250 D</td><td>Branson Ultrasonics, USA</td><td>FIS15-338-125</td><td></td></tr><tr><td>Branson 超声 3 mm 锥形微探头</td><td>Branson Ultrasonics, USA</td><td>101-148-062</td><td></td></tr><tr><td>Branson Ultrasonics 200 和 400 瓦超声仪：玫瑰花结冷却池</td><td>Branson Ultrasonics, USA</td><td>15-338-70</td><td></td></tr><tr><td>Avanti JXN-26 离心机</td><td>Beckman Instruments, Germany</td><td>B37912</td><td></td></tr><tr><td>Optima XPN-100 ultra 超速离心机</td><td>Beckman Instruments, Germany</td><td>8043-30-0031</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete 蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Roche, Switzerland</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>D-山梨醇</td><td>Roth, Germany</td><td>6213</td><td></td></tr><tr><td>EDTA（乙二胺四乙酸二钠盐二水合物）</td><td>Roth, Germany</td><td>8043</td><td></td></tr><tr><td>100 mL 锥形瓶</td><td>Roth, Germany</td><td>X747.1</td><td></td></tr><tr><td>刻度移液管，B 级，25:0，0.1</td><td>Hirschmann, Germany</td><td>1180170</td><td></td></tr><tr><td>刻度移液管，B 级，5:0，0.05</td><td>Hirschmann, Germany</td><td>1180153</td><td></td></tr><tr><td>冰浴装置</td><td>neoLab, Germany</td><td>&amp;nbsp;S12651</td><td></td></tr><tr><td>磁力搅拌器 RCT basic</td><td>IKA-Werke GmbH, Germany</td><td>Z645060GB-1EA</td><td></td></tr><tr><td>MOPS（3-(N-吗啉代)丙磺酸）</td><td>Gerbu, Germany</td><td>1081</td><td></td></tr><tr><td>MyPipetman Select P1000 移液器</td><td>Gilson, USA</td><td>FP10006S</td><td></td></tr><tr><td>MyPipetman Select P20 移液器</td><td>Gilson, USA</td><td>FP10003S</td><td></td></tr><tr><td>MyPipetman Select P200 移液器</td><td>Gilson, USA</td><td>FP10005S</td><td></td></tr><tr><td>Omnifix 1 mL 注射器</td><td>Braun, Germany</td><td>4022495251879</td><td></td></tr><tr><td>苯甲基磺酰氟（PMSF）</td><td>Serva, Germany</td><td>32395.03</td><td></td></tr><tr><td>STERICAN 套管针 21 Gx4 4/5 0.8x120 mm</td><td>Braun, Germany</td><td>4022495052414</td><td></td></tr><tr><td>搅拌子，15 mm</td><td>VWR, USA</td><td>442-0366</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Merck, Germany</td><td>S8501</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti 摆桶转子</td><td>Beckman Instruments, Germany</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>试管</td><td>Eppendorf, Germany</td><td>3810X</td><td></td></tr><tr><td>组织研磨器，Potter-Elvehjem 型，2 mL 玻璃容器</td><td>VWR, USA</td><td>432-0200</td><td></td></tr><tr><td>组织研磨器，Potter-Elvehjem 型，2 mL 带锯齿尖端的研杵</td><td>VWR, USA</td><td>432-0212</td><td></td></tr><tr><td>三氯乙酸（TCA）</td><td>Sigma Aldrich, Germany</td><td>33731</td><td>已停产，&lt;br/&gt; 任何 TCA 均可满足要求（CAS: 73-03-9）</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Roth, Germany</td><td>4855</td><td></td></tr></tbody></table>

一种改进的线粒体接触位点分离方法

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

线粒体几乎存在于所有真核细胞中，其功能远不止能量生成，还包括铁硫簇、脂质或蛋白质的合成，以及钙离子稳态调控等重要生物学过程。2+ 缓冲作用以及凋亡的诱导。同样，线粒体功能障碍会导致多种严重的人类疾病，如癌症、糖尿病和神经退行性疾病。为了执行这些功能，线粒体必须通过由两层膜构成的膜包膜与细胞其他部分进行通讯。因此，这两层膜必须持续相互作用。线粒体内膜与外膜之间的蛋白质性质的接触位点在这一过程中至关重要。迄今为止，已鉴定出多个此类接触位点。在本文所述的方法中 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 线粒体被用于分离接触位点，从而鉴定可能作为接触位点蛋白的候选分子。我们利用该方法鉴定了线粒体接触位点与嵴组织系统（MICOS）复合物，这是线粒体内膜中主要的接触位点形成复合物之一，从酵母到人类均保守存在。近期，我们进一步优化了该方法，鉴定出一种由Cqd1与Por1-Om14复合物组成的新接触位点。

分离线粒体的内膜和外膜相对容易。然而，含有膜接触位点的囊泡的制备与分离则困难得多。在我们看来，有两个步骤至关重要：超声处理条件和所使用的梯度。
通常认为，线性梯度相较于阶梯梯度具有更好的分辨率。然而，线性梯度的可重复制备较为繁琐，且需要特殊设备。因此，我们建立了一种生成阶梯梯度的方法，该方法中各个阶梯之间的差异相对较小（见步骤3.5）。我们推测，在离心过程中阶梯梯度会达到平衡，从而形成近乎线性的梯度。引人注目的是，使用折射仪测定离心后各组分的蔗糖浓度发现，经过200,000 × g 条件下12小时离心后，阶梯梯度确实几乎转变为线性梯度（图3）。
从这些代表性结果中可以明显看出温和超声处理的重要性。在温和超声条件下（图4A），线粒体外膜标志物 Tom40 富集于早期低密度组分（第4号组分），而在后续组分中几乎完全不存在；线粒体内膜标志物 Tim17 则集中于高密度组分（第17号组分）。相比之下...

线粒体接触位点是与线粒体内膜和外膜蛋白相互作用的蛋白质复合物。这些位点对于线粒体膜之间的通讯至关重要，从而也介导了细胞质与线粒体基质之间的交流。本文描述了一种用于鉴定可能属于此类特定蛋白质的候选分子的方法。

线粒体几乎存在于所有真核细胞中，其功能远不止能量生成，还包括例如……

我们的目标是理解线粒体接触位点的分子功能，这些位点介导线粒体内外两层膜之间的通讯。这实际上是理解线粒体生物发生功能以及细胞存活能力的前提。我们发现了一种由CQD1蛋白介导的新型线粒体内膜与外膜之间的接触位点，更重要的是，该位点形成了一个孔道结构。我们的数据表明，该位点可能在脂质（如磷脂酸）的导入过程中发挥作用。通过对 MICOS 复合物的鉴定，我们进一步加深了对线粒体膜结构如何形成的理解。这使我们能够建立一个工作模型，用以解释线粒体两种形态的嵴——片状嵴和管状嵴——的形成机制。过去，我们的研究是在酵母中进行的。然而，我们确信正确的线粒体结构对高等真核生物同样重要。因此，我们下一步的研究是分析线粒体结构元件在更复杂模型（如原代神经元）中的作用。首先，取10毫克新分离的粗制酵母线粒体，在4摄氏度下用移液器将其重悬于1.6毫升SM缓冲液中。然后将线粒体悬液转移至预冷的100毫升锥形瓶中。在冰上持续轻微搅拌的同时，用20毫升玻璃移液管缓慢加入16毫升膨胀缓冲液。将样品置于冰上，在持续轻柔搅拌下孵育30分钟。然后，使用5毫升玻璃移液管缓慢加入5毫升2.5摩尔蔗糖溶液，使内膜收缩。将样品置于冰上，在轻柔搅拌下继续孵育15分钟。为了制备亚线粒体膜小泡，将线粒体悬液转移至预冷的罗氏细胞中，并在冰浴条件下以10%的超声振幅对悬液进行30秒的超声处理。随后将悬液在冰浴中静置30秒。首先，取制备好的酵母亚线粒体小泡，于4°C、20,000 G条件下离心20分钟，以分离生成的小泡与残留的完整线粒体。完整的线粒体形成沉淀，而囊泡则保留在上清液中。接下来，将上清液转移至新的超速离心管中。使用配备套管的1毫升注射器，在管底加入0.3毫升2.5摩尔蔗糖溶液作为垫层，并在4摄氏度下以118,000 ×g离心100分钟。离心后，囊泡将作为一层圆盘状物质出现在蔗糖垫的顶部。弃去约90%的上清液。为收集浓缩的囊泡，用剩余的缓冲液（包括2.5摩尔的蔗糖）通过移液吹打重悬囊泡。将悬液转移至预冷的冰上Dounce匀浆器中，使用聚四氟乙烯研杵至少抽打10次以匀浆悬液。接着，制备11毫升的阶梯梯度，每层含2.2毫升蔗糖溶液。使用以下公式计算蔗糖浓度。将最高浓度的蔗糖溶液加入离心管中，并置于零下20摄氏度，直至该层完全冻结。使用折射仪测定样品的蔗糖浓度。若无折射仪，可假设蔗糖浓度为2摩尔。为了将蔗糖浓度调整至0.6摩尔，需在pH 7.4条件下加入适量的MOPS、EDTA、PMSF以及蛋白酶抑制剂混合物。将样品小心地加至蔗糖梯度上，避免扰动梯度。在200,000 ×g、4 °C条件下离心12小时以分离囊泡。如果可能，应设置较慢的加速度和减速度，以避免破坏梯度。随后使用1毫升移液器从上到下以700微升为一份收集梯度，共得到17份，以提供足够的分辨率。接下来，进行两次连续的三氯乙酸沉淀：向各份样品中分别加入200微升72%三氯乙酸，混匀直至溶液均匀。将各组分在冰上孵育30分钟，然后在4°C、20,000 G条件下离心20分钟，使沉淀的蛋白质形成沉淀。弃去上清液。加入500 µL 28%三氯乙酸溶液，充分混匀，重复离心步骤。最后，通过SDS-PAGE和免疫印迹分析各组分。此处展示了温和超声处理的重要性。线粒体外膜标志物Tom40富集于早期低密度组分中，而在后续组分中几乎不存在。线粒体膜内标志物 Tim17 主要富集于高密度组分中。相比之下，接触位点蛋白 Mic60 则积累在蔗糖浓度中等的组分中，表明不同膜囊泡已成功生成并实现后续分离。而采用更强烈的超声处理条件时，可在梯度离心的较低组分中检测到线粒体外膜标志物 Tom40。此外，在中等密度组分中也存在大量 Tim17。

an-improved-method-to-isolate-mitochondrial-contact-sites

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

一种分离线粒体接触位点的改进方法

本文介绍了一种从哺乳动物组织活检样本中快速分离线粒体的方法。大鼠肝脏或骨骼肌样品使用商用组织解离仪进行匀浆，并通过尼龙滤网过滤实现差速分离线粒体。线粒体分离时间小于&lt;30分钟，而采用其他方法通常需要60至100分钟。...

通过组织解离与差速过滤快速分离与纯化用于移植的线粒体

本文介绍了一种通过免疫标记从啮齿类动物组织中分离的线粒体，并结合流式细胞术分析来检测和定量线粒体外膜蛋白的方法。该方法可进一步扩展用于评估线粒体亚群的功能特性。...

通过分离线粒体的流式细胞术对外膜蛋白进行免疫检测

比较样品间线粒体膜电位可提供有关细胞状态的重要信息。本文详细描述了分离线粒体以及利用荧光法检测其对抑制剂和解偶联剂反应的实验步骤。通过细胞培养和细胞应激动物模型的应用，展示了该实验方案的方法学特点及其应用价值。...

从培养细胞和小鼠组织中分离线粒体及其功能分析

经皮穿刺针活检获取的骨骼肌组织中分离线粒体的制备与呼吸测定评估

本文介绍了一种对先前报道方法的改进，该方法能够从小鼠骨骼肌的较小组织量中分离出高质量且高纯度的线粒体。该实验流程所获得的线粒体具有高度偶联性，在基于微孔板的呼吸测定实验中表现出良好的呼吸功能。...

从小鼠骨骼肌微量样本中分离线粒体用于高通量微孔板呼吸测定

由于线粒体仅占植物细胞的一小部分，因此需要对其进行纯化以开展多种研究。可通过匀浆处理，随后进行差速离心和密度梯度离心，从多种植物器官中分离得到高度纯化的线粒体组分。...

线粒体的分离与呼吸功能测定 拟南芥

本文介绍一种提取、分离和鉴定线粒体超复合体的方案，该方案最大限度地减少了去垢剂和考马斯亮蓝的使用。此方法在分辨率与酶活性保持之间实现了最佳平衡，同时降低了不稳定蛋白质-蛋白质相互作用丢失的风险。...

用于分离与分析线粒体呼吸链超复合物的混合型透明/蓝色天然电泳

我们提出了一种两步法高纯度线粒体分离方案，适用于蛋白质组水平的蛋白质鉴定与定量分析。该方案无需基因工程操作，因此适用于从任何原代细胞和组织中提取线粒体进行研究。...

无标记两步法分离线粒体以提升蛋白质发现与定量

本方案描述了一种在样品量有限的情况下分析呼吸链超级复合物的技术。...

从小型组织和细胞培养样品中分离线粒体用于线粒体超复合物分析

线粒体的生物能量学和代谢组学研究揭示了其在多种疾病中的多重作用，但这些细胞器的分离方法各不相同。本文详述的方法能够从多种组织来源中纯化出高质量的线粒体。其质量通过高分辨率呼吸测定法评估的呼吸控制比及其他指标来确定。...

从啮齿类动物心脏组织中稳健分离线粒体

学习分离线粒体接触位点的改进方法，用于研究线粒体膜结构与脂质转运机制。本方法通过温和超声处理酵母线粒体，结合密度梯度离心技术，成功分离MICOS复合物及CQD1形成的新型接触位点，为理解线粒体嵴形态发生与细胞活力调控提供重要实验基础。

一种改进的线粒体接触位点分离方法

探索更多视频