Name: 经瞳孔引导下视网膜下移植物的视网膜下移植物经巩膜移植视网膜变性小鼠模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T12:55:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: 了解经瞳孔引导下经巩膜视网膜下细胞移植技术，用于视网膜变性小鼠模型的精准递送。该方法通过直接可视化实现低并发症率，促进光感受器存活与整合，为基因治疗等应用提供安全平台。

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本研究由以下基金资助：NEI R01EY033103（MSS）、盲症防治基金会（MSS）、舒尔斯基基金会（MSS）、约瑟夫·阿尔伯特·赫基米安基金（MSS）、朱丽叶 RP 视觉基金会（YVL）、防止失明研究基金会（向约翰斯·霍普金斯大学威尔默眼科研究所和贝勒医学院卡伦眼科研究所提供的无限制资助）。我们感谢约翰斯·霍普金斯大学医学院的 Malia Edwards 博士慷慨提供显微镜操作培训。

所有动物实验均依照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》（NIH 出版物 No. 8023，1978 年修订版）以及视力与眼科研究中动物使用 ARVO 声明的规定进行。所有操作程序均经约翰斯·霍普金斯大学动物护理与使用委员会批准（批准号：M021M459）。
1. 动物
<ol>
	<li>使用 Rho::EGFP 小鼠（P3-P6 日龄）作为视网膜细胞悬液的供体。 
	注：该品系由贝勒医学院 T. Wensel 博士惠赠。</li>
	<li>使用 OPN1LW-EGFP/NRL-/- 小鼠14（P3 日龄）作为视网膜片的供体。</li>
	<li>使用成年视网膜变性且具有免疫缺陷的 Rd1/NS 小鼠（性别不限）作为受体。</li>
	<li>将所有小鼠饲养在 12 小时光照/12 小时黑暗循环条件下，根据需要提供水和食物。</li>
</ol>
2. 收集神经视网膜（图1）
注意：以下所有步骤均在无菌条件下进行。研究工具和产品的供应商信息见材料表。
<ol>
	<li>供体小鼠准备：使用过量二氧化碳处死供体小鼠，并通过颈椎脱位确认动物死亡。</li>
	<li>分离小鼠眼球。按以下步骤操作：
	<ol>
		<li>使用显微剪小心剪开幼鼠眼睑，暴露眼球。</li>
		<li>用平头镊夹住视神经，用另一把镊子将眼球拉出。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分离神经视网膜 
	注意：此步骤需在解剖显微镜下进行。
	<ol>
		<li>使用25 G无菌针头在角膜中央刺一个小孔。</li>
		<li>通过该小孔将角膜切开至一半，并将切口延伸至巩膜和视网膜色素上皮（RPE），随后去除巩膜和RPE。</li>
		<li>使用显微齿镊轻轻去除晶状体和玻璃体，以分离神经视网膜。</li>
		<li>根据需要，继续进行第3节以制备供体视网膜细胞悬液，或进行第4节以制备供体视网膜片。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 制备供体视网膜悬液 (图1)
<ol>
	<li>将神经视网膜置于 Papain 溶液中，37 °C 孵育 20–30 分钟，直至未观察到细胞团块。 
	注意：每 10 分钟轻轻吹打细胞混合物 15 次。</li>
	<li>按照 Papain 解离试剂盒的制造商说明收集单细胞。</li>
</ol>
4. 准备受体视网膜片 (图1)
注意：此步骤在第 2 部分之后进行，并在解剖显微镜下操作。
<ol>
	<li>将分离的神经视网膜杯放入含有预冷无菌 PBS 的 35 mm 培养皿中。</li>
	<li>使用显微剪将神经视网膜杯剪成多个视网膜片（约 1 mm × 2 mm）。</li>
</ol>
5. 准备受体小鼠
<ol>
	<li>通过腹腔注射氯胺酮（100 mg/kg 体重）和盐酸赛拉嗪（20 mg/kg 体重）使受体小鼠麻醉。</li>
	<li>通过确认角膜反射和痛觉反射消失、呼吸规律来判断手术麻醉深度。</li>
	<li>通过尾部夹捏或足底反射无反应来评估麻醉深度。</li>
	<li>手术过程中应始终重新检查麻醉深度，若动物对疼痛有反应，应及时调整麻醉深度。将小鼠置于预热的手术台上，以防止低体温。</li>
	<li>术前5分钟使用1%（wt/vol）托吡卡胺滴眼液散大受体瞳孔。充分散大的瞳孔有助于在手术显微镜下经瞳孔观察。</li>
	<li>使用聚维酮碘对术侧小鼠眼睛及周围眼组织进行消毒，再用无菌PBS冲洗。</li>
	<li>在小鼠眼部滴加0.5%盐酸丙帕他卡因以进行镇痛。</li>
</ol>
6. 视网膜下移植视网膜移植物（图2）
注意：以下所有步骤均在无菌条件下进行。手术器械经过高压灭菌（使用器械托盘保护器械尖端，并将微量注射器的推杆取出，以防其在管腔内卡住）。研究工具和产品的供应商信息见下文 材料表.
<ol>
	<li>前房穿刺术：使用胰岛素针穿刺角膜周边部进入前房，使房水被动流出，以防止移植过程中眼内压（IOP）升高。 
	注意：穿刺成功的标志是房水从角膜穿刺孔中流出。</li>
	<li>在角膜表面滴加一滴透明质酸钠，并放置一个直径为5 mm的玻璃盖玻片，以便在手术显微镜下经瞳孔观察眼底结构。</li>
	<li>根据实验需要，使用有齿镊轻压眼球上方或下方巩膜壁，向经瞳孔视野中心方向按压，以暴露注射位点（位于角膜缘后1 mm处）。</li>
	<li>使用微注射针垂直穿刺巩膜。</li>
	<li>小心地将针头方向旋转至切线方向，以便完全穿透巩膜-脉络膜-视网膜色素上皮（RPE）复合体，进入视网膜下腔。</li>
	<li>将针头沿切线方向插入，到达最终注射位点。 
	注意：通过经瞳孔视觉引导确认针尖斜面完全到位。以浅层视网膜血管作为解剖参照，精确定位针头在视网膜下腔的位置。</li>
	<li>注射视网膜移植物 
	注意：若注射器中预先含有少量气泡，有助于验证供体细胞是否准确位于视网膜下腔。视网膜下注射引起的IOP升高会增加供体细胞反流的风险。
	<ol>
		<li>如果角膜变得混浊24,25，提示IOP升高，应将针头保留在视网膜下腔至少3分钟，直至角膜恢复透明，表明IOP已充分降低。 
		注意：在极少数情况下，IOP可能需要更长时间才能恢复正常，建议持续保留针头位置，直至角膜透明度恢复，即使所需时间为8–10分钟。应在手术显微镜下密切观察，避免损伤视网膜结构。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用显微有齿镊夹住注射孔边缘，迅速撤出针头。 
	注意：视网膜细胞悬液成功递送至视网膜下腔的标志是形成稳定的隆起（bleb）；而视网膜片状移植物成功递送的标志是在视网膜下腔可见白色片状物。</li>
	<li>用人工泪液清洁眼部手术区域，必要时涂抹眼膏。</li>
	<li>术后处理
	<ol>
		<li>将移植后的小鼠置于预热（37 °C）的清洁恢复笼中，并密切监测其是否出现痛苦表现。</li>
		<li>若小鼠出现痛苦表现，可在手术眼局部滴加0.5%盐酸丙帕卡因2–3次。</li>
		<li>待小鼠完全清醒并能自主活动后，将其放回饲养笼。若小鼠难以触及饲料盒，可在笼内放置少量饲料颗粒和凝胶杯。 
		注意：在麻醉未完全消退前，应保持眼表湿润，以预防白内障形成。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 多模态共聚焦扫描激光眼底成像（cSLO）
<ol>
	<li>移植后两个月，通过腹腔注射氯胺酮（100 mg/kg 体重）和盐酸赛拉嗪（20 mg/kg 体重）对受体 Rd1/NS 小鼠（n=5）进行麻醉，以进行成像。</li>
	<li>使用 1%（wt/vol）托吡卡胺滴眼液散瞳。</li>
	<li>使用共聚焦扫描激光检眼镜 cSLO 系统22 进行标准的 55° 多模态成像。</li>
	<li>采用 30 帧 ART 平均技术获取 MR 和 SD-OCT 图像。</li>
</ol>
8. 组织学染色
<ol>
	<li>按照先前报道的方法制备移植了Rd1/NS小鼠视网膜的冷冻切片14。</li>
	<li>使用含5%山羊血清和1% Triton X-100的PBS溶液对移植视网膜的冷冻切片进行封闭和通透处理。</li>
	<li>在4 °C条件下，将样品与一抗孵育过夜，随后用PBS缓冲液洗涤（每次5分钟，共3次）。一抗包括：羊抗GFP-FITC（1:200）、兔抗recoverin（1:1000）和兔抗S-opsin（1:500）。</li>
	<li>将样品与二抗（羊抗兔Cy3，1:500）孵育，并用DAPI复染。 
	注意：一抗和二抗的供应商列于材料表中。</li>
</ol>

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</ol>

MSS 曾是 Revision Therapeutics、Johnson &amp; Johnson、Third Rock Ventures、Bayer Healthcare、Novartis Pharmaceuticals、W. L. Gore &amp; Associates、Deerfield、Trinity Partners、Kala Pharmaceuticals 和 Acucela 的带薪顾问。MSS 收到 Bayer 提供的资助研究支持。这些安排已由约翰斯·霍普金斯大学根据其利益冲突政策进行审查并批准。KVL 被列为科罗拉多大学专利申请的发明人。MSS 和 YVL 被列为约翰斯·霍普金斯大学专利申请的发明人。

由于小鼠眼睛体积较小，小鼠的视网膜下移植在技术上具有挑战性。在本研究中，我们开发了一种简单且可重复的小鼠受体视网膜下移植平台。该平台能够一致地保护供体细胞的存活率，实现成功的视网膜下递送，并确保较低的并发症发生率。
本文所述的视网膜下移植技术基于经巩膜途径，即注射针穿透眼球壁的外层结构（巩膜-脉络膜-视网膜色素上皮复合体）。与经角膜19，20 和经玻璃体21，26，27&#160;途径相比，经巩膜途径可直接进入视网膜下腔，无需穿透眼前段结构和神经视网膜，从而实现无创移植，并降低供体细胞从穿刺孔反流的风险。经巩膜途径的一个挑战在于确保针尖在到达最终递送部位之前沿视网膜下腔推进，同时避免对邻近的视网膜色素上皮层和脉络膜造成潜在扰动。在缺乏直接视觉引导的情况下，通过传统的经巩膜途径实现上述目标具有较大难度28，29。在本研究中，我们开发了一种经瞳孔视觉引导平台，结合手术显微镜与视网膜外部照明，以促进小鼠模型中的视网膜下移植。该平台可提供受体眼底的实时可视化，使操作者能够追踪手术过程及受体视网膜的状态。例如，通过经瞳孔观察，针尖在穿透巩膜-脉络膜-视网膜色素上皮复合体后呈现出相对明亮的反射，即可简单验证穿刺成功。更重要的是，在经瞳孔视觉引导下，操作者可根据针尖与受体视网膜解剖结构（如视网膜血管和视盘）之间的相对位置，精确调节注射的角度和深度。此外，采用该技术进行精确的物质递送，可最大限度地减少视网膜色素上皮和脉络膜的损伤以及其他手术并发症。事实上，我们发现借助经瞳孔可视化技术，通过避免在视网膜血管附近进行操作，可显著减少出血的发生。
供体细胞反流是注射后手术失败的主要原因之一29,30。促进供体细胞反流的因素有多种。受体眼内因注射供体细胞混合物导致的眼内压（IOP）升高，是促使细胞从眼内反流的重要因素。本方案在手术开始时通过前房穿刺降低受体眼内压，并在从玻璃体腔拔出玻璃体穿刺针之前，使房水自然流出，从而实现眼内压的自发降低。第二个因素是受体眼球内未闭合的注射通道。为防止移植物经注射通道反流，我们采用小规格的微注射针（34G）穿透眼球壁以形成自闭合通道，并在拔针时使用带齿显微镊夹住外部通道开口边缘。在传统移植手术中，反流的移植物很难被观察到，因其可能发生迅速或快速弥散。当盖玻片施加后，透明质酸钠几乎总是从角膜滑落，覆盖大部分角膜缘及巩膜，包括巩膜切口部位。细胞注射后，位于巩膜切口处的透明质酸钠有助于减缓反流物质的整体流动（如果存在），并使其在手术显微镜下更易于被观察到。此外，通过追踪细胞悬液下视网膜隆起的稳定性以及视网膜片在眼内的位置是否保持不变，也可验证是否存在反流，这对于缺乏光学相干断层扫描（OCT）设备的实验室尤为有用。
尽管移植的视网膜片中存活了大量光感受器细胞，但无法检测到明显的细胞排列方向或视网膜片的取向。虽然向大型动物递送三维视网膜片的技术已有报道26,31,32，但在小鼠中，由于其视网膜下腔空间有限，且缺乏术中视网膜成像能力，因此在术中以及术后早期（当小鼠恢复活动能力时，移植的细胞或组织片可能变得不稳定）维持组织片方向十分困难。
我们介绍一种经巩膜的手术平台，该平台采用直接经瞳孔视觉引导，用于小鼠受体的视网膜下移植。该平台可实现高精度注射，并显著降低手术并发症的发生率。该平台能够精确递送已知剂量的细胞，学习曲线相对平缓，除适用于基因治疗等不同治疗剂的视网膜内或玻璃体内注射外，还可实现视网膜下递送。

光感受器细胞和视网膜色素上皮（RPE）细胞的移植为年龄相关性黄斑变性（AMD）、Stargardt病和视网膜色素变性（RP）等视网膜变性疾病提供了潜在的治疗方案1,2,3,4,5,6,7。为了补充或替换变性视网膜中受损的光感受器和RPE细胞，视网膜下腔因其宿主光感受器与RPE细胞的层状解剖结构而成为理想的移植靶区。尽管RPE细胞的视网膜下移植手术在大型动物中已有较为成熟的技术8,9,10，并在临床试验中得到应用11,12,13，但光感受器细胞移植研究仍面临诸多挑战，包括转基因大型动物模型的稀缺以及对神经元移植过程中突触形成的深层机制理解有限等问题。经基因修饰的小鼠模型，特别是具有多种视网膜变性突变类型的小鼠，为研究移植背景下的分子机制以及推动临床前有效细胞替代疗法的开发提供了有力工具14,15,16,17,18。
与大型动物（如猪、猴）的眼睛相对较大而晶状体较小不同，小鼠眼睛体积小且晶状体较大，使其成为较难的手术操作目标，尤其是在视网膜下移植中，物理空间受限和直接可视性有限是核心挑战。
根据注射途径的不同，目前的方法可分为三大类。第一，经角膜途径，即针头穿过角膜进入玻璃体腔，再进入视网膜下腔19,20。该方法可实现有效的视网膜下递送，但可能对眼前段结构（如角膜、虹膜、晶状体）造成损伤，这一主要风险可能严重影响后续的in vivo分析。第二，经玻璃体途径，即针头通过睫状体平坦部进入玻璃体腔，再进入视网膜下腔21。该方法在人类和大型动物中广泛应用。然而，在啮齿类动物中存在晶状体损伤的潜在风险，因为其晶状体在玻璃体腔中所占相对体积较大。值得注意的是，经角膜和经玻璃体两种方法均需穿透神经视网膜才能到达视网膜下腔，这会造成宿主视网膜的损伤，并增加供体细胞通过穿刺孔反流的风险。第三，经巩膜途径22,23，即针头穿透巩膜-脉络膜-RPE复合体后直接进入视网膜下腔。该方法可减少对眼前段结构和玻璃体腔的潜在创伤。然而，由于无法直接观察宿主眼底，手术失败情况较为常见，包括视网膜穿孔、RPE脱离以及脉络膜出血等。
在此，我们开发了一种经巩膜手术平台，通过直接经瞳孔视觉引导，用于小鼠受体的视网膜下移植。移植前对供体视网膜片和细胞悬液的活性进行了验证。成功将供体细胞递送至视网膜变性小鼠模型的视网膜下腔得到了证实。仅观察到极少数手术相关并发症。此外，移植的视网膜移植物中的光感受器细胞在移植后两个月内存活，并显示出进一步成熟为&#34;成年&#34;杆状细胞和锥状细胞的证据。

<table><tbody><tr><td>人工泪液</td><td>CareAll</td><td>P31447-04</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片（直径5mm）</td><td>Deckglaser</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗GFP（FITC）</td><td>Abcam</td><td>Ab6662</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔Cy3&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A10520</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素注射器（30G）</td><td>Easy Touch</td><td>08496-3015-11</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>VETone Zetamine</td><td>AH2017J</td><td></td></tr><tr><td>活死细胞染色试剂盒（Live Dead Viability Kit）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>显微剪刀</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8503</td><td></td></tr><tr><td>显微平口镊</td><td>ASICO</td><td>AE-4360</td><td></td></tr><tr><td>显微有齿镊</td><td>World Precision Instruments</td><td>555041FT</td><td></td></tr><tr><td>显微注射针头（26G）</td><td>Hamilton</td><td>7804-03</td><td></td></tr><tr><td>显微注射针头（34G）</td><td>Hamilton</td><td>207434</td><td></td></tr><tr><td>显微注射器</td><td>Hamilton</td><td>7633-01</td><td></td></tr><tr><td>木瓜蛋白酶解离试剂盒（Papain dissociation kit）</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LK003150</td><td></td></tr><tr><td>培养皿（35 mm）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FB012920</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘（10%）</td><td>Betadine Solution</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>盐酸丙帕卡因（0.5%）</td><td>Keeler</td><td>AX0500</td><td></td></tr><tr><td>兔抗recoverin抗体</td><td>Millipore</td><td>Ab5585</td><td></td></tr><tr><td>兔抗S-视蛋白抗体</td><td>Millipore</td><td>Ab5407</td><td></td></tr><tr><td>透明质酸钠</td><td>Johnson &amp;amp; Johnson Vision&amp;nbsp;</td><td>10-2400-11</td><td></td></tr><tr><td>无菌棉签</td><td>Puritan</td><td>25-806 2PC</td><td></td></tr><tr><td>无菌针头（25G）</td><td>BD PrecisionGlide Needle</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>无菌手术巾</td><td>Dynarex</td><td>4410</td><td></td></tr><tr><td>手术材料/试剂</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>托吡卡胺滴眼液</td><td>Henry Schein</td><td>112-7192</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>AnaSed Injection</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

视网膜变性小鼠模型中经瞳孔引导的经巩膜下视网膜下移植术

Transpupillary-Guided Trans-Scleral Transplantation of Subretinal Grafts in a Retinal Degeneration Mouse Model

光感受器细胞和视网膜色素的移植&#160;视网膜色素上皮（RPE）细胞为视网膜退行性疾病提供了潜在的治疗方案。由于小鼠眼球容积较小，手术操作空间有限，将治疗性供体细胞移植至小鼠视网膜下腔具有较大挑战性。我们开发了一种经巩膜手术移植平台，结合直接经瞳孔视觉引导，以促进外源性细胞在小鼠受体中的视网膜下递送。该平台已使用来自富杆细胞区域的视网膜细胞悬液及三维视网膜片层进行测试 Rho::EGFP 小鼠和视锥细胞富集的 OPN1LW-EGFP;NRL-/- 小鼠。活/死细胞染色显示两种供体细胞的细胞死亡率均较低。视网膜移植物成功递送至视网膜变性小鼠模型的视网膜下腔， Rd1/NS，通过多模态共聚焦扫描激光眼底成像（cSLO）检测，手术并发症最少。移植后两个月，组织学染色显示视网膜移植物在视网膜下腔已成熟为“成体”视杆细胞和视锥细胞，表现为Rho::EGFP、S-视蛋白及OPN1LW:EGFP的强表达。本文提供了一种可在小鼠受体中实现高精度、低并发症率的视网膜下腔递送手术平台。该技术具有操作精准、学习曲线较短的优点。此外，该技术不仅可用于视网膜下细胞移植研究，还可应用于其他眼内治疗研究，包括基因治疗。

视网膜移植物成功递送至视网膜下腔并存活 体内. 
我们对视网膜下移植平台的性能进行了评估 Rd1/NS 移植时选用6-8周龄的受体小鼠，此时其视网膜因外核层（ONL）几乎完全退化而显著变薄。鉴于视网膜的脆弱性、视锥光感受器数量稀少，以及细胞悬液相较于视网膜片供体细胞活力相对较低，选用视锥细胞富集的小鼠作为OPN1LW-EGFP;NRL-/-)14 用作供体视网膜片的来源以及富集视杆细胞小鼠的来源（Rho::EGFP 作为细胞悬液的供体。利用我们的手术平台，成功将富集视锥细胞的视网膜片层和富集视杆细胞的细胞悬液递送至所有受体小鼠的视网膜下腔，注射后通过瞳孔透照观察到视网膜下隆起（subretinal bleb）及白色片状物，证实了移植成功。移植后两个月，采用多模态共聚焦扫描激光检眼镜（cSLO）成像对视网膜移植物的状态进行追踪观察。 体内横截面OCT扫描显示，所有受体小鼠的视网膜移植物在视网膜下腔内存活，并重建了外核层（ONL）图 3A）。红外成像在所有移植眼中均未检测到明显白内障图3B）。通过移植后两个月的多色反射成像检测，移植视网膜中极少发现其他手术并发症，包括出血（n = 1/10 眼）图 3C）。我们进行了组织学染色，以进一步评估视网膜移植物中光感受器细胞的存活情况及其成熟程度。在移植的视网膜片中，观察到大量表达OPN1LW:EGFP和S-视蛋白的视锥光感受器。同样，移植的视网膜细胞悬液中也显示出较高比例的Rec+ 感光细胞 在体，包括大量 Rho::EGFP+ 杆状物（图3D）。未移植的对照组小鼠表现出严重的外核层变性，仅存稀疏的残余视锥光感受器（Rec+）。在未移植的样本中未检测到EGFP信号 Rd1/NS 视网膜图3D).
<img alt="小鼠视网膜分离示意图；步骤：解剖、木瓜蛋白酶消化、视网膜细胞悬液制备。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65448/65448fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：供体视网膜片及细胞悬液制备示意图。 示意图展示了从供体 Rho::EGFP 小鼠获取视网膜细胞悬液和视网膜片的关键步骤。明场与荧光成像显示了来自 Rho::EGFP 小鼠的解离细胞及分离视网膜片的代表性图像。黄色虚线：切开边缘。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65448/65448fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="小鼠眼部操作；麻醉、瞳孔扩张、镇痛、消毒步骤示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65448/65448fig02v3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：Rd1/NS 小鼠视网膜片及细胞悬液的视网膜下移植操作流程。（A）受体小鼠准备工作的示意图。（B）关键手术步骤及相应图示，展示视网膜细胞悬液和视网膜片的视网膜下移植过程。手术步骤包括：1. 穿刺前房；2. 在角膜上滴加透明质酸钠，然后将盖玻片置于透明质酸钠之上，以利于经瞳孔观察；3. 穿透眼球壁外层（巩膜-脉络膜-RPE复合体）。图中右上角面板显示了穿刺针的角度；4. 插入注射针；5. 注射移植物。代表性图像分别展示了在两个独立受体小鼠中成功递送的视网膜细胞悬液和视网膜片。星号：视神经乳头；红色箭头：视网膜血管；白色箭头：穿刺针尖端；白色箭头：移植的视网膜悬液或视网膜片。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65448/65448fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="OCT 显示片状、悬浮状及未移植的视网膜；用于移植研究分析的显微成像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65448/65448fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：视网膜移植物成功递送至视网膜下腔及存活 体内. (A代表性 SD-OCT 图像显示了移植的视网膜片和细胞悬液在两位个体中的视网膜下分布情况 Rd1/NS 小鼠，分别。未移植 Rd1/NS 小鼠被采集作为对照。感兴趣区域（ROI）在红外（IR）眼底图像上以黄色虚线框标示。内层视网膜指定为视网膜神经节细胞层（RGC）、内丛状层（IPL）和内核层（INL）的层状结构。B) 移植后具有代表性的红外（IR）图像 Rd1/NS 小鼠散瞳后未见白内障。C移植与非移植区域的代表性多色反射（MR）图像 Rd1/NS 眼睛。移植的眼睛未出现明显手术并发症，包括出血。D移植组（片状和悬浮状）与非移植组（对照）的免疫组织化学（IHC）染色 Rd1/NS 小鼠。数据显示，在移植后两个月时，存在大量表达光感受器特异性标记物（Rec）、视杆细胞（Rho::EGFP）、L/M 视锥细胞（OPN1LW:EGFP）和 S 视锥细胞（S-opsin）的移植物来源光感受器。受体视网膜层状结构通过 DAPI 染色（蓝色）识别。视网膜移植物通过 EGFP 报告基因（绿色）识别。非移植小鼠视网膜显示外核层严重退化，仅存稀疏的残余视锥光感受器（Rec）+）。在未移植的样本中未检测到EGFP信号 Rd1/NS 视网膜。放大图像显示在右侧两个面板中。 缩写：RGC：视网膜神经节细胞层；INL：内核层；ONL：外核层。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65448/65448fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

本方案介绍了一种经瞳孔视觉引导的经巩膜入路，可安全、精确地向患有或不患有视网膜变性的受体小鼠递送视网膜下细胞移植物，且手术并发症发生率较低。

光感受器细胞和视网膜色素上皮（RPE）细胞的移植为视网膜变性疾病提供了一种潜在的治疗方法。

本研究的总体目标是开发一种经巩膜移植平台，并采用直接经瞳孔引导方式，以促进向小鼠受体的视网膜下腔递送细胞。所有动物实验均依照美国国立卫生研究院（NIH）实验动物使用指南进行。本研究中动物使用的声明已获约翰斯·霍普金斯大学动物护理与使用委员会批准。采用出生后第3至6天的EGFP小鼠作为视网膜细胞悬液的供体。出生后第3天的OPN1LW-EGFP/NRL小鼠作为视网膜片供体。免疫缺陷的成年视网膜变性Rd1/NS小鼠作为受体。用过量二氧化碳处死供体小鼠。为分离小鼠眼球，使用显微剪刀小心打开幼鼠眼睑，暴露眼球。包绕视神经，并用平头镊子将眼球轻轻拉出。眼球摘除后，使用25号针头在角膜中央切开一个小孔。通过该孔将角膜切成两半，并将切口延伸至巩膜和视网膜色素上皮（RPE）。然后去除巩膜和视网膜色素上皮（RPE）。接着使用显微有齿镊轻轻去除晶状体和玻璃体，以分离神经视网膜。为收集供体视网膜悬液，将神经视网膜在37°C的木瓜蛋白酶溶液中孵育20至30分钟，直至无法检测到细胞团块为止。按照Papain试剂盒的制造商说明收集单个细胞。为制备视网膜片，将分离的视网膜放入含有PBS的培养皿中，然后用显微剪刀轻轻将神经视网膜剪成多个视网膜片。通过腹腔注射氯胺酮和赛拉嗪使受体小鼠麻醉。确保达到手术麻醉水平，即动物失去眨眼反射和痛觉反射，但呼吸仍保持规律。通过夹尾或脚掌回缩反射来评估麻醉深度。在手术过程中重新检查麻醉深度。将小鼠置于预热的手术台上，以避免低体温。术前5分钟使用托吡卡胺滴眼液扩大受体瞳孔。充分散大的瞳孔有助于在手术显微镜下进行经瞳孔观察。在小鼠眼睛上滴一滴盐酸丙帕他卡因以进行镇痛。用碘对小鼠手术眼及周围眼组织进行消毒。然后用无菌 PBS 清洗眼睛。在周边角膜处制作隧道切口，进入眼内腔以降低眼内压。接着，在角膜表面滴加一滴透明质酸钠，并加盖一片玻璃盖玻片。现在可在手术显微镜下实现小鼠眼底的经瞳孔观察。使用有齿镊将眼球壁推向经瞳孔视野中心，以暴露注射位点。然后将显微注射针以垂直于眼球壁的方向部分刺入巩膜。视网膜表层血管可作为解剖学参照，用于确定针头在视网膜下腔的位置。随后注射视网膜移植物。注射器中预先装入的小气泡有助于验证供体细胞是否位于视网膜下腔。如果角膜变得浑浊，需将针头保留在视网膜下腔，直至角膜恢复透明，以使眼内压恢复正常。抓住注射孔边缘，迅速拔出针头。细胞悬液成功递送的标准是在视网膜下腔形成稳定的隆起。 视网膜片层的成功递送可通过观察到明显的白色片层来确认。将移植后的小鼠置于预热的清洁恢复笼中，并仔细监测其是否有任何痛苦迹象。若出现此类情况，可在手术眼局部滴加一滴盐酸丙帕卡因，重复两到三次。在小鼠完全清醒并能够自由活动后，将其放回饲养笼中。在笼子底部的凝胶杯内放置少量食物颗粒。如果小鼠难以接触到食槽中的食物。移植后两个月，进行多模态共聚焦扫描激光眼底显微成像以观察视网膜移植物的活体状态。频域光学相干断层扫描显示，视网膜移植物在视网膜下腔存活，并重建了所有受体小鼠的外核层。红外成像在所有移植小鼠中均未检测到明显白内障。通过多色反射成像技术，可明显检测到移植小鼠中其他手术并发症，包括出血。组织学染色显示，在移植的视网膜片中存在大量表达 OPN1LW:EGFP 和 S 视蛋白的视锥光感受器。同样，移植视网膜细胞悬液后，在体内观察到大量恢复呈阳性的光感受器，其中包括众多成熟的 EGFP 阳性视杆细胞。未移植小鼠的外核层出现严重退化，仅存少量表达恢复蛋白的视锥光感受器。然而，在未移植小鼠中未检测到EGP信号。本研究为小鼠受体的视网膜下移植提供了一种经巩膜手术平台，并采用直接经瞳孔视觉引导技术。该平台能够精确递送已知剂量的细胞。它相对易于掌握，除了可用于不同类型治疗剂（包括基因治疗）的视网膜内或玻璃体内注射外，还有助于实现视网膜下递送。

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