使用狂犬病间接荧光抗体试验检测IgG和IgM抗体

免疫荧光试验（IFA）用于评估狂犬病感染期间的抗体反应，或评价疫苗诱导的免疫应答。该方法可用于确定样本中是否存在抗体，并区分存在的抗体同种型。中和抗体检测是狂犬病抗体检测的金标准，用于评估接受暴露前或暴露后预防接种者体内的抗体滴度。

尽管免疫荧光检测（IFA）的结果可能与中和抗体检测不同，但作为替代方法，它仍然能够提供有价值的信息。通常，用于检测狂犬病中和抗体的检测方法可评估免疫应答，但这些检测需要数天时间，并且依赖病毒和活细胞培养。

免疫荧光检测（IFA）可预先制备抗原载玻片用于检测，数小时内即可获得结果，而无需等待数天。在人狂犬病病例中使用IFA检测，有助于更深入地了解个体免疫系统对狂犬病感染的应答机制。不同病例之间存在显著差异，而该检测可在疾病发展过程中实时提供检测结果。

首先，穿戴个人防护装备，包括护目镜、外科口罩和非乳胶手套。用 EGM 培养基将 20 毫升小鼠神经母细胞瘤细胞或 BHK-21 细胞调整至浓度为 3.0 × 10⁵ 个细胞/毫升。将制备好的细胞保持低温，直至使用前。

接下来，用 EGM 稀释 CVS-11 病毒以进行制备。制备好的病毒须保持低温，直至使用。用 70% 乙醇清洁湿度载片室和聚四氟乙烯涂层的载玻片孔，然后在生物安全柜中静置晾干。

清洗后，向载玻片室中的吸水纸条加入蒸馏水，以确保整个操作过程中保持恒定的湿度。使用铅笔在每张载玻片上标记所需的识别信息，例如批号、日期和细胞类型。将标记好的载玻片放入载玻片室中保存。

然后使用重复移液器将50微升病毒稀释液加入显微镜载片上的各孔中。再向每孔加入50微升细胞稀释液，注意避免移液器吸头接触孔中已有的病毒而造成污染。随后，关闭湿室载片腔，并将其置于34至36摄氏度的湿式培养箱中。

接下来，从湿盒中取出载玻片，仔细吸除上清液。将载玻片置于盛有 PBS 的科铂林罐中洗涤 2 分钟，然后使其自然晾干。将载玻片放入盛有冷丙酮的科铂林罐中以固定样本。

将玻片置于经批准可用于易燃材料的20摄氏度冷冻箱中，至少冷冻一小时。待丙酮挥发且玻片干燥后，在玻片的孔中加入狂犬病直接荧光抗体结合物，并将玻片置于34至36摄氏度的湿化培养箱中孵育30分钟。随后将玻片在盛有PBS的考普兰染色缸中清洗两次，每次两分钟。

将载玻片空气干燥，并用含有 0.05 摩尔 Tris、0.15 摩尔氯化钠和 20% 甘油的封片剂封片。使用荧光显微镜在 200 倍放大下评估细胞感染性。接着，从培养箱和湿化室中取出其余的载玻片。

小心吸出每个孔中的上清液，然后将玻片放入盛有 PBS 的考普林瓶中，浸泡 1 至 2 分钟。让玻片在空气中干燥约 30 分钟，随后于 -80°C 保存备用。开始实验前，需对患者的血清或脑脊液样本进行稀释，以用于检测。

用含 0.05% 伊文思蓝的 PBS 稀释，配制所需结合物至适当的工作浓度。进行间接荧光抗体试验时，取出试验所需数量的已制备抗原载玻片。让载玻片解冻并完全干燥。

接下来，将载玻片放入盛有丙酮的考普林瓶中，并转移至经批准可用于易燃材料的20摄氏度冰箱中，放置2小时至过夜。随后，将载玻片从丙酮中取出，使其自然风干。现在，将载玻片放入生物安全柜内的湿化室盒中。

为保持湿度，在孵育 chamber 中加入经蒸馏水浸湿的吸水条。向预设的孔中分别加入 50 µL 的每种对照样品、样品稀释液或 PBS。将封闭的湿盒置于 37 °C、含 5% CO₂ 的湿化培养箱中孵育 30 分钟。

操作完成后，将湿度培养皿室从培养箱中取出，并转移至生物安全柜中。使用吸头小心吸取各孔中的上清液，注意不要扰动细胞单层。随后，用无菌滴管向每孔中加入一滴 PBS。

小心吸去 PBS，将每张载玻片转移至盛有 PBS 的考普林瓶中。随后，将载玻片放回湿盒中。向每个孔中加入 50 µL 适当的抗人抗体偶联物，在湿盒孵育箱中孵育 30 分钟。

孵育结束后，将湿盒转移至生物安全柜中。使用吸头吸取上清液。随后，用无菌滴管向每个孔中加入一滴 PBS。

移除 PBS 后，将玻片在盛有 PBS 的考普林瓶中清洗两次，总共 15 分钟。清洗完毕后，让玻片自然晾干，然后用封片剂封片。将玻片置于荧光显微镜下观察。

将样本从阴性到4+进行分级，阴性样本无荧光，4+样本呈现明亮的绿色荧光。根据样本显示1至2+级别的稀释倍数，确定样本的终点值。初次接种疫苗后，患者样本中观察到高水平的免疫球蛋白M和G。

接种疫苗约六个月后，患者样本中两种抗体的水平均显著降低，但免疫球蛋白 M 水平几乎完全下降。接种疫苗18个月后，患者样本中未检测到免疫球蛋白 M 抗体。免疫球蛋白 G 水平持续存在，并在从两周时间点初始下降后，保持与六个月时间点检测到的水平相似。