单拷贝基因座染色质纯化技术在 Saccharomyces cerevisiae 中的应用

真核细胞核内环境极为拥挤，许多生物过程同时发生。我们的研究旨在理解这些过程在基因组上是如何协调进行的，以避免可能导致基因组不稳定和人类疾病的严重事故。本方案使我们能够在基因组位点的天然状态下对其进行纯化，从而对分离得到的材料进行组成和功能表征，例如检测蛋白质-DNA相互作用。

该方案能够实现对目标基因座的高度富集，克服了目前基因座特异性染色质分离技术的诸多局限。所获得的材料未经交联处理，因此还可用于多种下游功能分析，例如体外转录或体外复制。

本方案使我们能够从酵母染色体中切除并纯化不同的复制起点，从而进行蛋白质组学分析，鉴定新的与复制起点相互作用的染色质因子，进而推动DNA复制领域的研究。该方案可利用纯化的起点材料开展体外复制研究，用于检测染色质状态、组蛋白修饰，并对内源染色体上的天然核小体模板进行结构分析，促进染色质研究。首先，从YPD平板中接种对照菌株和具有重组能力的酵母菌株至5毫升YPR培养基中，在30摄氏度、200 RPM条件下过夜培养。

接下来，将两毫升菌液接种到100毫升新鲜的YPR培养基中，于30摄氏度、200 RPM条件下过夜培养。对于每种菌株，将1,800毫升已灭菌的酵母蛋白胨培养基和200毫升已灭菌的20%棉子糖溶液分装至两个5升的锥形瓶中。将每种酵母菌株以600纳米处0.2的光密度接种至相应的培养基中，并在200 RPM条件下培养约6小时，或直至细胞达到1.0的所需光密度。

同时加入 200 毫升 2% 半乳糖和 110 微升酵母交配因子 alpha（YMFA），以将细胞阻滞在 G1 期，并孵育两小时。将细胞悬液转移至一升离心桶中，在 6,000 ×g 及 4°C 条件下离心 10 分钟。弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于 10 至 15 毫升蒸馏水中。

接下来，用接头塞密封一支25毫升注射器，并将其放入装有水的50毫升锥形管中。将细胞悬液转移至注射器组件中。用5毫升蒸馏水冲洗离心桶，以收集残留的细胞。

然后，在室温下以 2,397 ×g 离心 10 分钟，弃去上清液。接着将引诱塞从注射器中取出，将细胞挤入液氮中形成细胞“意大利面”。最后，将冷冻的细胞“意大利面”转移至 50 毫升锥形管中，并于 -80 °C 保存，直至后续使用。

使用商用咖啡研磨机，先将约30至50克干冰分两次研磨，每次30秒，以冷却研磨机。弃去研磨后的干冰粉末，将3克冷冻的酵母细胞“意大利面”与约30至50克干冰混合，放入已预冷的咖啡研磨机中。用Parafilm密封杯盖与研磨机之间的连接处。

将酵母细胞与干冰混合，每次研磨30秒，共研磨10次，每次间隔30秒。使用洁净干燥的刮勺将所得的酵母细胞干冰粉末转移至塑料烧杯中。待干冰完全挥发后，向酵母细胞粉末中加入2.25毫升含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的磁珠缓冲液（MB缓冲液）。

用力吹打细胞缓冲液混合物后，将细胞悬液转移至15毫升锥形管中。接着，取粗细胞提取物的0.1%样品用于DNA分析，0.05%样品用于蛋白质分析，并于-20摄氏度保存。将剩余的细胞悬液转移至低吸附性的2毫升反应管中，通过离心分离细胞碎片。

完成后，将所有上清液收集至一个15毫升的圆锥形离心管中。随后，分别取上清液的0.1%于-20摄氏度保存，用于DNA分析，另取上清液的0.05%于-20摄氏度保存，用于蛋白质分析。接下来，用500微升含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的冷MB缓冲液，在4摄氏度、20 RPM转速下旋转孵育5分钟，重复洗涤两次500微升的免疫球蛋白G偶联磁珠悬液。

将磁珠在 500 微升预冷的 MB 缓冲液中于 4 摄氏度、20 RPM 条件下旋转孵育 1 小时，然后使用磁力架从磁珠中去除上清液。将平衡后的磁珠悬液与先前获得并汇集至 15 毫升锥形管中的细胞裂解液混合。在 4 摄氏度、20 RPM 条件下孵育 2 小时后，将完整的磁珠-细胞裂解液悬浮液转移至低吸附反应管中。

使用磁力架将携带目标染色质环的磁珠从细胞裂解液中分离出来。将每管中的穿流液转移至新的15毫升锥形管中，并将部分样品在-20摄氏度保存，用于后续DNA和蛋白质分析。接着，将每个15毫升锥形管中的磁珠重悬于300微升预冷的MB缓冲液中，并将所有磁珠合并至一个反应管中。

在4°C、20 RPM转速条件下，使用含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的750微升冷MB缓冲液，每次10分钟，共洗涤5次。随后，用不含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的750微升冷MB缓冲液进行最后一次洗涤。将制备好的磁珠重悬于40微升不含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的冷MB缓冲液中。

通过将磁珠与两微升6x组氨酸标签重组烟草蚀纹病毒（tobacco etch virus）或TEV蛋白酶孵育，从用于纯化染色质单拷贝基因座的磁珠上释放LexA CBP染色质环复合物。使用磁力架将磁珠与最终洗脱液分离后，将含有切割后染色质环的洗脱液转移至新的1.5毫升反应管中。再次将试管置于磁力架上，以分离残留磁珠与最终洗脱液。

将珠子重悬于750微升冰冷的碳酸铵缓冲液中，取部分样品于-20摄氏度保存，用于DNA和蛋白质分析。从最终洗脱液中取出样品，于-20摄氏度保存，用于DNA和蛋白质分析。此外，从残留的珠子中取样。

开始变性洗脱：将磁珠用750微升冰冷的碳酸铵缓冲液在4摄氏度、20转/分钟的旋转条件下洗涤两次，每次20分钟。接着，向磁珠中加入500微升0.5摩尔的氢氧化铵，以提取结合的LexA染色质复合物，并在室温下孵育30分钟。使用磁力架将磁珠从悬液中分离，然后将洗脱液转移至低吸附反应管中。

将低吸附反应管在室温下孵育30分钟，然后使用磁力架从悬浮液中分离磁珠。完成后，将洗脱液转移至新的低吸附反应管中。用750微升去离子水重悬磁珠，并分别取样用于DNA和蛋白质分析。

最后，从最终洗脱液中获取用于DNA和蛋白质分析的样品。在该研究中，定量并比较了重组菌株中ARS316位点与对照位点PDC1的纯化效率。与PDC1相比，ARS316位点在流穿组分中的回收率较低。

尽管由于TEV蛋白酶切割不完全，部分染色质环仍结合在TEV磁珠上，但变性洗脱可实现80%至90%的ARS316位点回收率。考虑到酵母基因组的大小，与对照菌株相比，TEV磁珠及变性洗脱组分中ARS316分子的富集程度显著升高，而对照菌株在任何定量组分中均未显示ARS316位点的富集。TEV洗脱后，磁珠上仍保留较高比例的ARS316位点，原因是TEV切割效率未达到100%，导致部分染色质环仍结合在磁珠上。

然而，变性洗脱在重组菌株中显示出对 ARS316 位点 80% 至 90% 的回收率，考虑到酵母基因组的大小，这对应于 ARS316 分子的高程度富集。