罗伊氏乳酸杆菌电穿孔和转化确认的方法DSM20016
2023年6月23日
在这里，我们提出了使用 罗伊氏利莫西乳杆菌 DSM20016的方案，详细介绍了生长、质粒转化、集落PCR、荧光报告蛋白测量和有限的质粒迷你制备，以及常见问题和故障排除。这些方案允许测量DSM20016中的报告蛋白，或者在没有报告基因的情况下 通过 集落PCR进行确认。
L.Reuteri，特别是菌株，DSM20016是一种健壮的、天然的人类肠道共生菌，在整个胃肠道中具有巨大的治疗递送和疾病检测前景。这项工作将有助于将DSM20016定位为这些应用的合成生物学底盘。乳酸杆菌没有特定的模式生物。
首选物种确实存在，但它们的选择通常偏向于特定的研究目标。细菌家族内的变异导致了碎片化的协议，其中一些协议的修改迭代可以追溯到出版物。对于刚开始的人来说，很难准确过滤什么是有用的，什么是没有用的。
确实存在一篇关于DSM20016转型的论文，但它不是现代的。存在其他乳酸杆菌家族成员的现代协议，但它们并不DSM20016。在这里，我们努力为DSM20016电穿孔提供一套易于使用、集中化、现代化、完整的实验方案。
与以前的DSM20016探索协议相比，该协议集提供了实质性的现代化，并阐明了一些悬而未决的线程，并强调了以前不太清晰的部分。该协议集也是完整的，专门针对DSM20016，其他非DSM20016协议并不完全兼容。我们的主要目标之一是使用微生物作为廉价的传感器和输送系统。
我们正在与肠道疾病专家合作，使用DSM20016来感知胃肠道的状况，并根据需要提供治疗。
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概述
本文介绍了与强健的人类肠道共生菌Limosilactobacillus reuteri DSM20016操作相关的实验方案，包括菌株培养、质粒转化、菌落PCR以及荧光报告蛋白的检测。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 合成生物学
- 胃肠道健康
背景
- Limosilactobacillus reuteri DSM20016 是一种天然的人类肠道共生菌。
- 该菌株在治疗递送和疾病检测方面展现出良好的应用前景。
- 该领域的实验方案通常较为零散且难以系统掌握。
- 研究目标可能影响细菌种类的选择。
研究目的
- 提供操作DSM20016的明确实验方案。
- 促进报告蛋白的检测及菌落PCR验证。
- 解决实验流程中常见的问题并提供故障排除方法。
使用的方法
- 罗伊氏粘液乳杆菌（Limosilactobacillus reuteri）DSM20016的培养。
- 质粒转化技术。
- 利用菌落PCR确认基因修饰。
- 荧光报告蛋白的检测。
主要结果
- 已建立成功的生长与转化实验方案。
- 菌落PCR证实了目标基因构建体的存在。
- 荧光报告蛋白得到了有效检测。
- 针对常见问题提供了故障排除指南。
结论
- 这些方案提高了 DSM20016 在研究中的可用性。
- 它们为未来的合成生物学应用奠定了基础。
- 清晰的指导有助于研究人员梳理零散的文献资料。
常见问题
行业应用价值
针对肠道靶向应用的合成生物学底盘开发，目前存在关键性技术空白，而针对 Limosilactobacillus reuteri DSM20016 的集中化、菌株特异性电穿孔与转化验证方案可有效填补这一缺口。标准化的操作流程减少了实验不确定性，有助于对共生微生物进行可重复的工程化改造，用于治疗性递送和疾病检测。这使得 DSM20016 成为面向胃肠道健康早期阶段生物制药研发的可靠平台。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 实现对DSM20016的稳健遗传操作，用于功能靶点研究。
- 通过明确关键共生菌株的转化可行性，支持生物学风险降低。
- 有助于在合成生物学流程中对菌株选择提供可预测的信心。
筛选与检测方法开发
- 提供经过验证的方案，用于制备可直接用于筛选的DSM20016底盘菌株。
- 标准化转化和报告基因检测方法，以获得可重复的检测结果。
- 在与疾病相关的系统中实现对工程化构建体的可靠评估。
转化与临床前研究
- 将工程化菌株DSM20016与靶向肠道治疗递送的转化目标相匹配。
- 支持从发现到胃肠道模型中临床前验证的连续性研究。
- 降低推进工程化共生菌进入转化研究的风险。
流程与工作流整合
这些方案整合了早期发现与检测方法开发的接口，能够实现从基因工程到DSM20016中功能筛选的高效推进。
- 发现生物学：在共生菌底盘中支持假设验证和通路工程。
- 筛选：为下游工作流程提供可重复的转化和定量报告基因检测结果。
- 分析：实现转化效率和报告基因表达的测量，用于比较分析。
- 转化研究：为工程菌株在与肠道相关情境中的临床前评估提供基础。
- 企业级复用：将DSM20016确立为合成生物学研发中可复用、标准化的平台。
运营与企业影响
- 科学价值：提高共生工程的预测可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：提供标准化、可重复且可扩展的菌株操作方案。
- 战略价值：优化早期肠道微生物组项目的决策流程，提升资本使用效率。
- 组合影响：实现对工程化微生物治疗产品的风险调整后优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备微生物遗传学和电穿孔技术方面的专业知识。
- 需要配备电穿孔设备和酶标仪等仪器。
- 要求跨团队在方案实施和故障排查方面进行标准化协作。
- 由于基因型差异，该方案可能需要针对其他乳酸菌目（Lactobacillales）菌株进行优化调整。
- 本方案的适用性仅限于DSM20016菌株，可能不适用于其他菌株。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:04
Preparing Limosilactobacillus reuteri DSM20016 Electrocompetent Cells for Electroporation
5:27
Measurement of the Acid‐Resistant Fluorescent Reporter Protein mCherry2
7:03
Confirmation of Plasmid Uptake via Colony PCR
8:45
Mini‐Prep Protocol for Limosilactobacillus reuteri and Confirmation of Plasmid Presence by PCR
