Name: 基于细胞的自噬相关 4B 半胱氨酸肽酶抑制剂的药物筛选 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T12:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: 了解基于荧光素酶报告基因的高通量筛选技术，用于检测ATG4B半胱氨酸蛋白酶活性并发现新型小分子抑制剂。该方法为癌症和神经退行性疾病的治疗研究提供了重要基础。

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本工作获得了英国医学研究理事会（MRC）对MRC-UCL大学单位资助项目（项目编号MC_U12266B）、MRC痴呆平台资助项目（英国项目编号MR/M02492X/1）、胰腺癌英国基金会（Pancreatic Cancer UK，资助编号2018RIF_15）以及UCL治疗加速支持计划的资助，其中UCL治疗加速支持计划的资金来源于MRC“概念验证信心”2020年UCL项目（MC/PC/19054）。编码ActinLC3dNGLUC的质粒（pMOWS-ActinLC3dNGLUC）由Robin Ketteler博士（柏林医学院人类医学系）提供。

注意：实验流程如图1所示。有关本方案中使用的所有材料、试剂和设备的详细信息，请参见材料表。
1. 逆转录病毒的制备
注意：编码 ActinLC3dNGLUC 的质粒为 pMOWS-ActinLC3dNGLUC20。为获得高滴度病毒，应使用低代次细胞（理想情况下低于 P20）。
<ol>
	<li>在含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素（P/S）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养HEK293T细胞，于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中培养，直至细胞融合度达到80%–90%后再进行转染接种。</li>
	<li>转染前一天，将细胞以每孔1 × 106个细胞的密度接种于6孔板中，每孔加入2 mL完全培养基。将培养板置于含5% CO2的湿化培养箱中过夜培养。 
	注意：若使用基于脂质体的转染试剂，请遵循制造商说明书。本方案描述的是非脂质体类转染试剂的使用方法。开始转染前，将DNA转染试剂、DNA和培养基平衡至室温（约15分钟）。</li>
	<li>每项转染实验中，向1.5 mL微量离心管中加入200 µL无血清培养基。在每根管中加入以下量的质粒：1,000 ng pMOWS-ActinLC3dNGLUC；900 ng GagPol；100 ng VSV-G。 
	注意：此处列出的质粒用量和培养基体积适用于12孔板。若使用其他类型的培养板，请调整培养基体积和质粒用量，使最终浓度达到：转移质粒5 ng/µL、包装质粒4.5 ng/µL、包膜质粒0.5 ng/µL。可使用任何含有gag和pol表达基因的包装质粒，以及任何含有VSV-G表达基因的包膜质粒。</li>
	<li>将DNA转染试剂小瓶涡旋振荡30秒。用移液器吸取4 µL转染试剂直接加入含稀释DNA的培养基中。通过轻轻倾斜管壁的方式轻柔混匀。 
	注意：移液枪头不要接触塑料管内壁。禁止上下吹打或涡旋振荡。</li>
	<li>室温孵育反应体系15分钟。</li>
	<li>在孵育期间，从6孔板中吸弃旧培养基，并每孔更换2 mL新鲜无血清培养基。</li>
	<li>将每种转染复合物逐滴加入对应孔中。</li>
	<li>轻轻摇动或旋转培养板，确保液体均匀覆盖整个孔底表面。</li>
	<li>将培养板置于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中过夜孵育。</li>
	<li>24小时后，吸弃旧培养基，每孔加入2 mL新鲜完全培养基，并将细胞放回含5% CO2的湿化培养箱中继续培养72小时。</li>
	<li>72小时后，收集上清液至50 mL锥形管中，在4 °C条件下以4,000 × g离心10分钟，以去除死细胞和碎片。如需进一步纯化，使用60 mL大注射器将上清液通过0.20 µm滤器过滤。立即分装成每管300 µL的单次使用量，并于-80 °C保存。 
	&#8203;注意：避免反复冻融，以保持产物最高活性。</li>
</ol>
2. 逆转录病毒转导
<ol>
	<li>转导细胞前一天，在12孔板中以中等密度接种靶细胞（PANC1细胞接种量为每孔1 × 105个细胞），每孔加入1 mL含10% FBS和1% P/S的培养基。将培养板置于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中过夜培养。 
	注意：最佳细胞密度需预先确定，因为不同细胞类型的贴壁能力不同。理想情况下，应选择能够达到40%-50%汇合度的细胞密度。</li>
	<li>每次使用前，从-80 °C冰箱中取出冷冻的逆转病毒分装液，在冰上解冻。 
	注意：未用完的分装液不得再次冷冻。</li>
	<li>在50 mL锥形管中，将病毒上清液与polybrene混合，使polybrene终浓度为8 µg/mL。 
	注意：以下体积适用于最终每孔体积为500 µL的12孔板转导实验。病毒上清液的最终体积可通过在polybrene存在下测试一系列病毒稀释度来估算。根据目的基因表达水平的需求以及所用容器的大小，可采用更高或更低的稀释度。</li>
	<li>吸去12孔板中的旧培养基，每孔加入500 µL上述混合液。将细胞置于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中与病毒上清液共孵育过夜。 
	注意：保留两个孔加入完全培养基（不含病毒上清液），作为筛选对照。</li>
	<li>将含病毒的培养基更换为新鲜的完全生长培养基（每孔1 mL），将细胞重新放回37 °C、5% CO2的湿化培养箱中继续培养48小时。</li>
</ol>
3. 混合群体的筛选与维持
<ol>
	<li>将生长培养基更换为筛选培养基（含终浓度为 1 µg/mL 嘌呤霉素的完全生长培养基）。监测细胞生长情况，每 2–3 天更换一次筛选培养基。当细胞达到汇合时，扩增至 6 孔板，随后扩增至直径为 10 cm 的组织培养皿中。</li>
	<li>将细胞在筛选培养基中维持培养，时间至少应达到对照组（未转导）细胞完全死亡所需的时间。 
	注意：为获得成功结果，建议在启动实验项目前预先确定嘌呤霉素的最佳浓度。为此，应绘制嘌呤霉素杀灭曲线，以确定在 3 至 10 天内完全杀灭未转导细胞所需的最低浓度。</li>
	<li>当细胞能够在筛选培养基中稳定生长后，将其在完全生长培养基中扩增，并分装冻存备用，以供后续实验项目使用。 
	注意：记录细胞传代次数，避免使用来自冻存管且传代次数超过五代的混合细胞群体。在进行检测前应定期检查支原体污染情况。理想情况下，每次检测前均应使用新鲜批次的细胞，以获得最强的荧光素酶信号。</li>
	<li>将细胞维持在筛选培养基中，并接种足够数量的细胞，使其在检测前一天达到所需的密度。</li>
</ol>
4. 化合物添加
注意：Selleckchem 小分子文库包含约 4,000 种化合物，分装于 50 块 96 孔板中，每板按 8 行 × 10 列排列，储存浓度为 10 mM，溶剂为二甲基亚砜（DMSO）。
<ol>
	<li>将30 µL化合物分装至与纳升级声波液体分配器兼容的源板的相应孔中。使用384孔聚丙烯板（384PP板）。保持这些板密封，并于-20 °C保存。 
	注意：此处所述筛选方案每天总共进行10块检测板；每孔终浓度固定为10 µM，并孵育24小时。</li>
	<li>在室温下解冻化合物文库板。 
	注意：确保培养板完全解冻并平衡至室温。培养板上的温度梯度可能影响液体处理。</li>
	<li>使用纳升级声波液体分配器将50 nL/孔加入384孔检测板中。 
	注意：确保程序中选择的源板和目的板与本步骤所用的板一致。</li>
	<li>在电子表格中创建一个分配程序。</li>
	<li>打开软件。</li>
	<li>新建一个实验方案。从 实验方案 标签，选择以下选项： 样品板布局格式, 384PP; 样品板类型，384PP_DMSO2；以及 目标板类型, CellCarrier-384 Ultra PN (图2A).</li>
	<li>下 拣选列表，选择 导入 选项 (图2B) 以导入包含分配程序的电子表格（图 2C).</li>
	<li>选择 运行实验方案 选项 (图 2D），核对显示的信息是否正确，然后单击 运行.</li>
	<li>在名为的新窗口中 运行状态 (图 2E），点击 开始 并按照提示窗口中显示的步骤操作（图2F，G).</li>
</ol>
5. 细胞接种
<ol>
	<li>从细胞培养瓶或细胞培养培养皿中用胰蛋白酶消化细胞，并通过添加含FBS的培养基中和胰蛋白酶。</li>
	<li>将细胞悬液转移至50 mL锥形管中，在室温下以390 × g 离心5分钟。随后，小心吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于10 mL完全培养基中。</li>
	<li>进行细胞计数。</li>
	<li>在230 mL完全培养基中制备含有4.6 × 107 个细胞的细胞悬液。 
	注意：此体积和细胞密度适用于10块384孔检测板，另加两块384孔板的死体积。</li>
	<li>将50 µL细胞悬液加入第4步准备好的384孔检测板的每一孔中。 
	注意：细胞接种可手动操作，也可使用大量分液器完成。</li>
	<li>将细胞置于37 °C、5% CO2 的湿润培养箱中培养24小时。</li>
</ol>
6. 收集细胞上清液
注意：此处使用的液体处理机器人平台配备有96通道移液臂，用于液体操作。若无液体处理自动化设备，可通过使用多通道移液器将本方案调整为低通量形式。
<ol>
	<li>按照图3所示配置实验室自动化工作站的甲板布局。</li>
	<li>将一次性96头吸头架放置在位置P1 （图3A）。 
	注意：每个96头吸头架由八个一次性吸头排组成。当使用多通道机械臂操作96头吸头时，384孔板被分为四个象限。因此，每个吸头架足以将两块检测板中的上清液转移至两块空的实心黑色384孔板中。每完成两块板的运行后，必须更换整个吸头架。</li>
	<li>将检测板放置在位置P2 和P4 （图3A）。</li>
	<li>将空的实心黑色384孔板放置在位置P3 和P5 （图3A）。 
	注意：该灵活且功能强大的机器人平台已针对本检测进行了适配，并编写了专用程序（图3B）。</li>
	<li>从位置P1获取吸头。</li>
	<li>从位置P2的板中吸取10 µL上清液，并转移至位置P3的空实心黑色板中。 
	注意：吸头应置于孔内适当深度，以吸取上清液，同时避免扰动孔底的细胞单层。</li>
	<li>在位置P6（图3A）的废料处丢弃吸头。</li>
	<li>对位置P2板中剩余的各孔重复步骤6.5–6.7，然后重复相同步骤，将位置P4的上清液转移至位置P5。 
	注意：务必收集上清液并准确分配至空的实心黑色板中的对应孔（图3C、D）。由于分泌的dNGLUC在细胞培养基中非常稳定，板可密封后在避光条件下于4 °C保存最多7天。</li>
</ol>
7. 荧光素酶检测
注意：报告基因中使用的 dNGLUC 具有闪光型动力学特征，信号衰减迅速。由于加入底物（腔肠素）后发光信号会快速衰减，因此应设置酶标仪对上清液中的发光信号进行测量；向孔中注入底物后，应在数秒内立即读取该孔的信号。基于此原因，应使用具备发光检测功能并配备底物注射装置的酶标仪，以确保所有样本从注射到读数的时间间隔保持一致。酶标仪的具体设置参数见图4。
<ol>
	<li>用酸化甲醇（1 mL 甲醇中加入 10 µL 3 M HCl）配制 1 mg/mL 的天然腔肠素储备液。 
	注意：请遵循当地实验室关于甲醇操作的健康与安全指南，避免皮肤接触。在开始检测前，需新鲜配制工作用底物溶液。</li>
	<li>启动注射泵（图 5A）。</li>
	<li>用去离子水冲洗管路（图 5B-D）。</li>
	<li>用甲醇冲洗管路。</li>
	<li>在冲洗管路的同时，通过将底物按 1:100 稀释来配制工作用底物溶液（对于一块 384 孔板，将 220 µL 底物储备液加入 21.8 mL 1× 磷酸盐缓冲液 [PBS] 中）。</li>
	<li>用底物工作液冲洗管路（图 5B-D）。</li>
	<li>将板放入读板仪中，并使用 图 4 中所述的设置开始测量。</li>
	<li>对所有检测板重复步骤 7.6–7.7。</li>
	<li>完成所有检测板的操作后，用甲醇冲洗管路。</li>
	<li>用去离子水冲洗管路。 
	&#8203;注意：此步骤结束后，可获得与细胞内 ATG4B 活性相关的原始荧光素酶数值。为对细胞数量进行归一化处理，需通过荧光显微镜计数每孔中的细胞数量，以完成后续步骤。</li>
</ol>
8. 细胞固定与染色
注意：此步骤可借助多通道移液器手动操作，或使用大量分液器完成。
<ol>
	<li>用4%多聚甲醛（溶于1× PBS）固定细胞15分钟。 
	注意：操作多聚甲醛时，请遵循实验室当地健康与安全指南，避免接触皮肤。如有可能，应在安全柜中进行此步骤。</li>
	<li>用1× PBS洗涤三次。</li>
	<li>用Hoechst 33342以1:5,000比例溶于1× PBS中染色细胞核，孵育15分钟。</li>
	<li>用1× PBS洗涤三次。</li>
</ol>
9. 图像采集
注意：使用自动化显微镜进行图像采集。作为确定细胞数量的替代方法，也可测定细胞内荧光素酶活性。关于归一化处理是采用细胞数量还是细胞内荧光素酶活性，各有优缺点，下文将对此进行讨论。我们发现，测定细胞数量比测定细胞内荧光素酶活性侵入性更小，且结果变异度更低。
<ol>
	<li>启动显微镜操作软件（图6）。</li>
	<li>在 设置 选项卡中，选择正确的预定义板类型。如果板类型未预设，请手动输入板的尺寸。</li>
	<li>通过点击 弹出 和 加载 选项将板载入显微镜。</li>
	<li>然后，选择 20倍空气物镜（数值孔径 [NA]：0.4）。 
	注意：确保物镜的 环状调节圈 设置为正确值，以便针对不同类型的板实现准确对焦。</li>
	<li>在 通道选择 下，选择 Hoechst 33342。 
	注意：时间、激光功率和焦面高度的通道设置需根据所使用的板类型进行优化。</li>
	<li>在 定义布局 中，从板中选择所有孔，并从每个孔中选择四个视野。</li>
	<li>在 在线任务 中，选择相应的文件夹以将数据传输至分析软件。</li>
</ol>
10. 图像分析
注意：可使用任意图像分析软件对所获取图像中的细胞核进行分割和计数。此处，我们介绍使用一种特定在线软件的操作步骤，该软件兼容多种自动显微镜文件格式。
<ol>
	<li>启动图像分析软件。</li>
	<li>转到 图像分析 选项卡以开始图像分割（图 7A）。</li>
	<li>在 输入图像 选项卡中，点击 + 号以添加新的构建模块（图 7A）。</li>
	<li>从列表中选择 寻找细胞核 选项（图 7A），并选择 Hoechst 33342 作为 通道 选项（图 7B）。</li>
	<li>在图像上目视检查已分割的对象，并选择最准确的分割方法。 
	注意：在本实验中，我们使用了方法 C（图 7C）。每种方法选项均包含可调节的子类别，以获得尽可能最佳的分割效果。</li>
	<li>然后，点击 定义结果 选项卡（图 7C），并选择 标准输出 作为 方法 选项。</li>
	<li>在子类别中，选择 细胞核-对象数量 和 对象计数（图 7C）。</li>
	<li>使用 将分析保存到磁盘 或 将分析保存到数据库 选项保存分析流程。</li>
	<li>在 批量分析 选项卡下，从树状结构中选择待分析的数据。</li>
	<li>在 方法 下，选择在步骤 10.8 中保存的分析流程。 
	注意：也可以从该引用软件外部上传脚本文件，或上传已保存至数据库的现有分析。</li>
	<li>点击 运行分析 以开始分析（图 7D）。此工作流程结束后将生成两个数据集：来自上清液的原始荧光素酶值以及每个孔中的细胞数量。使用这两个数据集将荧光素酶值归一化为每细胞数值。</li>
</ol>

High-Throughput Screening Analysis for 4B Cysteine Peptidase Autophagy Inhibitor

<ol><li>Kocaturk, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+as+a+molecular+target+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Autophagy as a molecular target for cancer treatment.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences. 134, 116-137 (2019).</li>
<li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+ATG4+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Targeting ATG4 in cancer therapy.</a> Cancers. 11 (5), 649(2019).</li>
<li>Towers, C. G., Thorburn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+targeting+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Therapeutic targeting of autophagy.</a> EBioMedicine. 14, 15-23 (2016).</li>
<li>Agrotis, A., Ketteler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+ATG4B+as+drug+target+for+treatment+of+solid+tumours-the+knowns+and+the+unknowns%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">On ATG4B as drug target for treatment of solid tumours-the knowns and the unknowns.</a> Cells. 9 (1), 53(2019).</li>
<li>Levy, J. M. M., Towers, C. G., Thorburn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+autophagy+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting autophagy in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (9), 528-542 (2017).</li>
<li>Kimmelman, A. C., White, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+and+tumor+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Autophagy and tumor metabolism.</a> Cell Metabolism. 25 (5), 1037-1043 (2017).</li>
<li>Tran, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context-dependent+role+of+ATG4B+as+target+for+autophagy+inhibition+in+prostate+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Context-dependent role of ATG4B as target for autophagy inhibition in prostate cancer therapy.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (4), 726-731 (2013).</li>
<li>Pengo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+kinases+and+phosphatases+that+regulate+ATG4B+activity+by+siRNA+and+small+molecule+screening+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of kinases and phosphatases that regulate ATG4B activity by siRNA and small molecule screening in cells.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 148(2018).</li>
<li>Kauffman, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delipidation+of+mammalian+Atg8-family+proteins+by+each+of+the+four+ATG4+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Delipidation of mammalian Atg8-family proteins by each of the four ATG4 proteases.</a> Autophagy. 14 (6), 992-1010 (2018).</li>
<li>Tanida, I., Sou, Y. -S., Minematsu-Ikeguchi, N., Ueno, T., Kominami, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atg8L%2FApg8L+is+the+fourth+mammalian+modifier+of+mammalian+Atg8+conjugation+mediated+by+human+Atg4B%2C+Atg7+and+Atg3%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Atg8L/Apg8L is the fourth mammalian modifier of mammalian Atg8 conjugation mediated by human Atg4B, Atg7 and Atg3.</a> The FEBS Journal. 273 (11), 2553-2562 (2006).</li>
<li>Agrotis, A., Pengo, N., Burden, J. J., Ketteler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redundancy+of+human+ATG4+protease+isoforms+in+autophagy+and+LC3%2FGABARAP+processing+revealed+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Redundancy of human ATG4 protease isoforms in autophagy and LC3/GABARAP processing revealed in cells.</a> Autophagy. 15 (6), 976-997 (2019).</li>
<li>Nguyen, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atg8+family+LC3%2FGABARAP+proteins+are+crucial+for+autophagosome-lysosome+fusion+but+not+autophagosome+formation+during+PINK1%2FParkin+mitophagy+and+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome-lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation.</a> The Journal of Cell Biology. 215 (6), 857-874 (2016).</li>
<li>Ketteler, R., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATG4%3A+More+than+a+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">ATG4: More than a protease.</a> Trends in Cell Biology. 31 (7), 515-516 (2021).</li>
<li>Zhang, L., Li, J., Ouyang, L., Liu, B., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+roles+of+Atg4+proteases+from+autophagy+modulation+to+targeted+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Unraveling the roles of Atg4 proteases from autophagy modulation to targeted cancer therapy.</a> Cancer Letters. 373 (1), 19-26 (2016).</li>
<li>Fernández, ÁF., López-Otín, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+and+pathologic+relevance+of+autophagy+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The functional and pathologic relevance of autophagy proteases.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (1), 33-41 (2015).</li>
<li>Maruyama, T., Noda, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy-regulating+protease+Atg4%3A+structure%2C+function%2C+regulation+and+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Antibiotics%22%5BJournal%5D)">Autophagy-regulating protease Atg4: structure, function, regulation and inhibition.</a> The Journal of Antibiotics. 71 (1), 72-78 (2017).</li>
<li>Ketteler, R., Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+autophagy+by+luciferase+release+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Quantitation of autophagy by luciferase release assay.</a> Autophagy. 4 (6), 801-806 (2008).</li>
<li>Ketteler, R., Sun, Z., Kovacs, K. F., He, W. -W., Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pathway+sensor+for+genome-wide+screens+of+intracellular+proteolytic+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">A pathway sensor for genome-wide screens of intracellular proteolytic cleavage.</a> Genome Biology. 9 (4), 64(2008).</li>
<li>Luft, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Gaussia+luciferase+in+bicistronic+and+non-conventional+secretion+reporter+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs.</a> BMC Biochemistry. 15, 14(2014).</li>
<li>Ketteler, R., Glaser, S., Sandra, O., Martens, U. M., Klingmüller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+transgene+expression+in+primitive+hematopoietic+progenitor+cells+and+embryonic+stem+cells+efficiently+transduced+by+optimized+retroviral+hybrid+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Enhanced transgene expression in primitive hematopoietic progenitor cells and embryonic stem cells efficiently transduced by optimized retroviral hybrid vectors.</a> Gene Therapy. 9 (8), 477-487 (2002).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本方案描述了一种基于细胞的报告基因检测方法，用于鉴定ATG4B抑制剂。初筛阳性结果的确定依据是检测在β-肌动蛋白与dNGLUC之间表达LC3B全长开放阅读框的细胞经处理后产生的荧光素酶活性。该检测方法具有若干优势：灵敏度高、定量性强且为非侵入性，因其可在不裂解细胞的情况下检测dNGLUC。本文提供了构建稳定细胞系及进行初筛的详细实验方案。该方案中包含若干关键步骤。
首先，本方案中使用的PANC1细胞系具有较高的转染效率和较强的增殖能力。该筛选方法也可使用其他细胞系进行，但不同细胞系之间的转导效率可能存在差异。其次，应避免使用冻存传代次数超过五代的稳定细胞群体，因为报告基因的表达水平可能随时间推移而下降。第三，每次实验前应使用新鲜的细胞批次，以确保在不同实验中获得最大且一致的荧光素酶信号。第四，在接种细胞时，无论是手动操作还是使用批量分液器，细胞悬液都必须持续搅拌，以保证整个培养板中细胞密度均匀。第五，在收集孔中上清液时，移液吸头应置于孔内适当深度，以便吸出上清液的同时不扰动培养孔底部的细胞单层。最后，底物工作液应在实验当天配制。腔肠素对光极为敏感且易被氧化，已有文献报道其在配制后会...

自噬是一种保守的代谢过程，细胞通过溶酶体降解衰老、受损或不必要的细胞成分，从而维持细胞内稳态并应对各种应激via的溶酶体途径1,2,3。在某些病理生理条件下，该过程作为细胞应对营养和氧气缺乏的关键应答机制，通过回收营养物质和脂质，使细胞能够适应其代谢需求2,3,4。自噬还被确认为与多种疾病相关的细胞应激反应，包括神经退行性疾病、病原体感染以及多种癌症。自噬在癌症中的作用复杂，取决于肿瘤的类型、发展阶段和状态：它可通过自噬性降解受损细胞来抑制肿瘤发生，但在缺氧、营养缺乏和细胞毒性损伤等应激条件下，也可通过增强细胞存活能力促进晚期肿瘤的生存2,4,5,6。
多项研究表明，抑制自噬作为一种抗癌策略具有潜在益处。因此，抑制自噬体形成或其与溶酶体融合等关键步骤，可能是控制癌症的有效方法2,4,5,6。越来越多的证据表明，ATG4B 参与某些病理过程，并因其作为潜在抗癌靶点而受到关注2,3,4。例如，研究发现结直肠癌细胞和人表皮生长因子受体2（HER2）阳性乳腺癌细胞中的ATG4B表达水平显著高于相邻的正常细胞2,4。在前列腺癌细胞中，抑制ATG4B会导致不同细胞系对化疗和放疗的敏感性存在差异7。最近，强有力的证据表明胰腺导管腺癌（PDAC）对ATG4B抑制尤为敏感。例如，在一种基因工程小鼠模型中发现，ATG4B功能的间歇性缺失可减缓PDAC肿瘤的生长并延长生存期3,4。总体而言，ATG4B在某些癌症类型中高度过表达，与肿瘤进展相关，并与癌症治疗耐药性有关2,4,8。
哺乳动物中的ATG4半胱氨酸蛋白酶包含四个家族成员，即ATG4A-ATG4D。这些蛋白对LC3/GABARAP（ATG8）家族蛋白表现出一定的底物选择性。9,10,11 并且可能具有与蛋白酶活性无关的其他功能12,13此外，ATG4 还参与调控一种新型的翻译后修饰过程，即蛋白质的 ATG8-ylation11,12尽管ATG4B及其主要底物LC3B是目前研究最广泛的，但越来越多的研究表明，自噬相关蛋白4家族的各个亚家族成员在调控自噬及非自噬过程中均发挥着复杂的作用。这一观点进一步得到了调控ATG4B活性的复杂翻译后修饰网络的支持。 通过 磷酸化、乙酰化、糖基化和亚硝基化9,10,11,12,13.
目前已发表多种已知的ATG4B抑制剂2,4,14,15。尽管这些抑制剂适合作为研究工具，但其药效学特征、选择性或效力尚未达到成为临床前候选药物的要求4,16。总体而言，迫切需要鉴定出更具效力和选择性的化合物。通常，这些化合物在生化水平上对蛋白功能具有良好的抑制作用，但在基于细胞的检测中其效果较差。目前存在多种用于监测ATG4B活性的检测方法，包括生化方法和基于细胞的检测方法4。我们此前已开发出一种简单、基于发光信号、适用于高通量筛选的细胞内ATG4B活性检测方法8,17。该检测方法利用来自Gaussia princeps的稳定且在细胞外环境中具有活性的荧光素酶蛋白（GLUC），其释放可被ATG4B的蛋白水解活性诱导，并在细胞外被检测到18,19。
在此报告基因构建体中，dNGLUC 与细胞的肌动蛋白细胞骨架相连接。可在 β-肌动蛋白锚定序列与 dNGLUC 之间引入一种蛋白酶特异性连接序列，从而使 dNGLUC 的分泌依赖于该连接序列的切割。我们在 β-actin 与 dNGLUC 之间使用了 LC3B 的全长开放阅读框，以便能够监测 LC3B 的切割过程17,18,19。尽管 dNGLUC 的分泌机制尚不明确，但该系统特异性地用于监测 ATG4B 活性，不依赖于整体自噬过程（因其在 ATG5 敲除细胞中仍可发生），且该分泌过程由非经典机制介导，无需经典的信号肽4,18,19。我们已成功利用该报告系统筛选小分子化合物库和 siRNA 文库，并鉴定了 ATG4B 活性的新型调控因子，例如 Akt 蛋白激酶8。本文详细描述了在半自动化、高通量筛选模式下使用该荧光素酶报告系统的实验方案。

<table><tbody><tr><td>50 &amp;micro;L 一次性吸头 - 无滤芯、纯净、嵌套式 8 层堆叠（被动堆叠）</td><td>Tecan</td><td>30038609</td><td>一次性 96 吸头架</td></tr><tr><td>BioTek MultiFlo</td><td>BioTek</td><td></td><td>批量分液器</td></tr><tr><td>腔肠素</td><td>圣克鲁兹生物技术公司（Santa Cruz Biotechnology）</td><td>sc-205904</td><td>底物</td></tr><tr><td>Columbus 图像分析软件</td><td>珀金埃尔默（Perkin Elmer）</td><td>版本 2.9.1</td><td>图像分析软件</td></tr><tr><td>DPBS (1x)</td><td>吉布科（Gibco）</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>适用于 Echo 的 384 孔聚丙烯微孔板，透明，非无菌</td><td>贝克曼库尔特（Beckman Coulter）</td><td>001-14555</td><td>384PP 板</td></tr><tr><td>EnVision II</td><td>珀金埃尔默（Perkin Elmer）</td><td></td><td>发光微孔板读板仪</td></tr><tr><td>Express pick 药物库（96 孔）-L3600-Z369949-100&amp;micro;L</td><td>Selleckchem</td><td>L3600</td><td>Selleckchem</td></tr><tr><td>FMK9A</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-100522</td><td></td></tr><tr><td>Greiner FLUOTRAC 200 384 孔板</td><td>Greiner Bio-One</td><td>781076</td><td>实心黑色 384 孔板</td></tr><tr><td>Harmony 成像软件</td><td>珀金埃尔默（Perkin Elmer）</td><td>版本 5.1</td><td>成像软件</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 三盐酸盐三水合物 - 水中 10 mg/mL 溶液</td><td>赛默飞世尔科技（ThermoFisher）</td><td>H3570</td><td>Hoechst 33342</td></tr><tr><td>Labcyte Echo 550 系列，配备 Echo Cherry Pick 软件</td><td>Labcyte/贝克曼库尔特（Beckman Coulter）</td><td></td><td>纳升级声波液体移液系统</td></tr><tr><td>Milli-Q 水</td><td></td><td></td><td>去离子水</td></tr><tr><td>Opera Phenix 高内涵筛选系统</td><td>珀金埃尔默（Perkin Elmer）</td><td></td><td>自动化显微镜</td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛 PBS 溶液</td><td>圣克鲁兹生物技术公司（Santa Cruz Biotechnology）</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>PhenoPlate 384 孔板，黑色，光学透明平底，组织培养处理，带盖</td><td>珀金埃尔默（Perkin Elmer）</td><td>6057300</td><td>CellCarrier-384 Ultra PN</td></tr><tr><td>pMOWS-ActinLC3dNGLUC</td><td></td><td></td><td>由 Robin Ketteler 博士（柏林医学科学学院人类医学系）提供</td></tr><tr><td>Polybrene 感染/转染试剂</td><td>默克（Merck）</td><td>TR-1003-G</td><td>polybrene</td></tr><tr><td>嘌呤霉素二盐酸盐，98%，赛默飞世尔化学品（Thermo Scientific Chemicals）</td><td>赛默飞世尔科技（ThermoFisher）</td><td>J61278.ME</td><td>嘌呤霉素</td></tr><tr><td>Tecan Freedom EVO 200 机器人</td><td>Tecan</td><td></td><td>液体处理机器人平台</td></tr><tr><td>X-tremeGENE HP DNA 转染试剂，罗氏（Roche）</td><td>默克（Merck）</td><td>6366244001</td><td>DNA 转染试剂</td></tr></tbody></table>

基于细胞的自噬相关4b半胱氨酸肽酶抑制剂药物筛选

Cell-Based Drug Screening for Inhibitors of Autophagy Related 4B Cysteine Peptidase

越来越多的证据表明，高水平的自噬流与肿瘤进展及癌症治疗耐药性相关。检测单个自噬蛋白是针对该通路开发治疗策略的前提。抑制自噬蛋白酶ATG4B已被证明可延长总体生存期，提示ATG4B可能是癌症治疗的一个潜在药物靶点。本实验室已开发出一种基于荧光素酶的特异性检测方法，用于监测细胞中ATG4B的活性。在该检测中，ATG4B的底物LC3B在其C末端融合了海洋桡足类Gaussia princeps来源的一种可分泌荧光素酶（GLUC）。该报告分子与肌动蛋白细胞骨架相连，因此在未被切割时保留在细胞质中。ATG4B介导的切割会导致GLUC通过非经典分泌途径释放，随后可通过收集细胞培养上清液来检测其含量，从而反映细胞内ATG4B的活性。本文介绍了将这种基于荧光素酶的检测方法应用于自动化高通量筛选的技术改进。我们详细描述了用于典型高通量分析细胞ATG4B活性的工作流程及优化条件。

在之前的一项研究中8，我们成功应用该检测方法筛选了小分子和siRNA文库，并鉴定了ATG4B的新调控因子。本文中，我们描述了该荧光素酶报告系统的实验方案及其在半自动化、高通量筛选模式下的代表性结果。图8展示了细胞核计数与发光信号原始数据分析的示例。图8A描绘了一次典型的发光检测结果：第1列显示了DMSO处理组的基础发光信号，第24列显示了加入10 µM ATG4B抑制剂FMK9A后的发光信号。同一块板的细胞核计数结果见图8B。每个化合物的原始数值均以中性对照组的平均值进行归一化处理，以获得ATG4B活性百分比和细胞存活率（图9A、B）。如预期所示，大多数化合物对ATG4B活性无显著影响，表现为接近阴性对照（DMSO—第1列）基础发光水平的数值。高通量筛选的质量评估指标Z'因子通过公式（1...

本文介绍了一种基于荧光素酶的报告基因检测方法的详细实验方案，该方法采用半自动化、高通量筛选模式。

基于细胞的自噬相关4B半胱氨酸肽酶抑制剂药物筛选

越来越多的证据表明，高水平的自噬流与肿瘤进展及癌症治疗耐药性相关。检测单个自噬相关蛋白……

我实验室研究的主要目标是理解自噬的调控机制，特别是ATG4半胱氨酸蛋白酶的调控，并利用这些知识开发靶向该通路的小分子抑制剂，用于胰腺癌等疾病的治疗。我们采用高内涵、高通量筛选技术来鉴定药物靶点以及候选药物，并重点关注ATG4半胱氨酸蛋白酶家族，因为我们认为它是多种癌症的理想药物靶点。目前我们已对ATG4家族成员进行了较长时间的研究。我们对该蛋白家族及其相关细胞功能障碍取得了重要发现。我们还鉴定了ATG4家族成员新的翻译后调控机制，目前正致力于开发针对ATG4家族的小分子抑制剂和激活剂，用于治疗癌症和神经退行性疾病等疾病。然而，目前可用于在细胞内监测ATG4蛋白酶活性的检测方法并不多。因此，我们是最早开发基于荧光素酶的检测方法以监测该活性的团队之一。我们的检测方法非常独特，因为它使用分泌型的，姑且称之为“片段”，因此无需对细胞进行授权，且可轻松将该方案适配于高通量筛选方法和实验室自动化系统。目前，我们已持续专注于ATG4B蛋白酶的研究相当一段时间。我们已构建了ATG4家族成员的敲除细胞系。我们鉴定了ATG4新的翻译后调控机制，最终还发现了若干能够抑制甚至激活ATG4B蛋白酶活性的小分子化合物。未来，我们希望继续深入研究ATG4家族成员的相关功能与机制。我们认为目前仍有许多未知领域有待探索。例如，这些蛋白质如何在神经元中调控自噬过程，目前尚完全不清楚。我们还希望将研究重点放在验证已鉴定出的这些小分子化合物上，并可能将激活剂应用于神经退行性疾病中。

cell-based-drug-screening-for-inhibitors-autophagy-related-4b

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

基于细胞的自噬相关 4B 半胱氨酸肽酶抑制剂的药物筛选

自噬是一种普遍存在的过程，使细胞能够降解并回收蛋白质和细胞器。我们采用先进的荧光显微技术，对自噬诱导过程中发生的微小但关键的物理变化进行可视化和定量分析，包括自噬体和溶酶体的形成与分布，以及它们融合形成自噬溶酶体的过程。...

利用先进的三维荧光显微镜对自噬进行定量分析

为了抑制病原体扩散，宿主细胞会重组其细胞骨架以区隔细菌并诱导自噬。使用 志贺氏菌 组织培养细胞感染过程中，宿主与病原体的相关决定因子被鉴定并表征。利用斑马鱼模型 志贺氏菌 感染，对所发现的分子和机制的作用进行研究 体内.

使用 Shigella flexneri 研究自噬-细胞骨架相互作用

本研究采用多光谱成像流式细胞术，结合分析功能，对3种自噬标志物的明场细节图像进行比较，并定量分析其共定位情况，同时进行LC3斑点计数，从而以客观、定量且具有统计学稳健性的方式检测自噬水平。...

利用多光谱成像流式细胞术通过检测LC3、p62和LAMP1共定位评估自噬流

本文介绍了两种基于抗体的蛋白质-蛋白质相互作用研究技术：免疫荧光和免疫沉淀。这些技术适用于研究蛋白质之间的物理相互作用，可用于发现细胞信号通路中的新组分，并有助于理解蛋白质的动态行为。<br...

自噬研究中蛋白质-蛋白质相互作用的研究

线粒体自噬是清除受损线粒体的过程，对于维持线粒体稳态和健康至关重要。本文介绍了一些在人类细胞、秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

体外 与 体内 检测人细胞、C. elegans 及小鼠中的线粒体自噬

本文介绍了一种在哺乳动物细胞中测量整体自噬捕获活性的简单且经过充分验证的实验方案。该方法基于定量分析可沉淀细胞组分中乳酸脱氢酶（LDH）所占的比例，并将其与细胞总LDH水平进行比较。...

乳酸脱氢酶封存检测——一种测定哺乳动物细胞大分子自噬封存活性的简单可靠方法

本文采用基于流式细胞术的检测方法，筛选影响T细胞受体信号传导的化学抑制剂文库，以鉴定抑制剂及其作用靶点。此处描述的方法还可扩展用于高通量筛选。...

T细胞受体信号通路中介分子的鉴定 通过 化学抑制剂文库的筛选

本文介绍了一种用于激酶抑制剂筛选的自组装人源蛋白质微阵列的详细制备方案。...

自组装人源蛋白微阵列中的激酶抑制剂筛选

本研究中，我们介绍了基于抑制剂和小干扰RNA的策略，用于干扰单纯疱疹病毒1型（HSV-1）感染的单核细胞来源树突状细胞中的自噬流。...

利用siRNA电穿孔技术调控单纯疱疹病毒1型感染的单核细胞来源树突状细胞中的自噬

本实验方案的目的是通过LC3免疫荧光染色及LC3点状结构定量分析，检测胰腺癌细胞和胰腺腺泡细胞中的自噬水平。...

利用LC3免疫荧光评估两种不同胰腺细胞模型中的自噬水平

了解基于荧光素酶报告基因的高通量筛选技术，用于检测ATG4B半胱氨酸蛋白酶活性并发现新型小分子抑制剂。该方法为癌症和神经退行性疾病的治疗研究提供了重要基础。

基于细胞的自噬相关4B半胱氨酸肽酶抑制剂药物筛选

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