Name: 离体 在3D打印生物反应器中对大血管进行灌注培养 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: 了解如何使用3D打印生物反应器对血管进行离体灌注培养。EasyFlow系统经济实用，可模拟生理血流和脉动压力，维持细胞活性，适用于血管修复机制研究及干细胞与生物材料疗法测试。

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作者谨此感谢萨里大学兽医学院兽医病理学中心提供的组织学服务。我们还要感谢英国皮尔布赖特研究所（Pirbright Institute，Pirbright，UK）的 L. Dixon 博士、A. Reis 博士和 M. Henstock 博士在动物组织获取方面给予的支持，以及萨里大学生物化学科学系特别是技术团队的持续支持。RSM 获得了萨里大学博士学院学生奖学金的资助，DM 和 PC 获得了国家动物实验替代、优化与减少中心（National Centre for the Replacement, Refinement &amp;#38; 减少科研中动物使用（资助编号：NC/R001006/1 和 NC/T001216/1）。

本方案描述了一种由两个 EasyFlow（生物反应器）插件组成的系统组装与使用方法：其中一个代表反应室（C），内含灌注的动脉样本，另一个作为培养基储液槽（R）（图1 和 图2A）。颈动脉取自英国皮尔布赖特研究所（The Pirbright Institute）饲养的4至6周龄雄性和雌性仔猪（6-12 kg）。动物实验严格遵循英国内政部《动物（科学程序）法案》（1986年）（ASPA）的规定，并经皮尔布赖特研究所动物福利与伦理审查委员会（AWERB）批准。动物饲养符合《繁殖动物饲养与护理操作规范》的要求。所有实验操作均由持有个人许可证且在项目许可证PPL70/8852下经过培训并具备资质的人员执行。仔猪的安乐死依照ASPA规定的“第一类方法”实施。
1. 插件制备
<ol>
	<li>使用提供的3D模型（补充文件1）通过3D打印技术制造插入件。 
	注意：3D建模可方便地对设计进行修改，以适应新的应用需求。也可采用其他材料或其他制造技术来生产插入件。由于其内部结构复杂，选择性激光烧结和立体光刻是合适的替代方法15。聚酰胺12（PA12；参见材料表）是一种理想的候选材料，因其在液体保持性和耐受反复热灭菌循环方面表现出优异性能16。</li>
	<li>使用补充文件2中提供的设计，通过激光切割技术制造硅胶垫圈和聚碳酸酯垫片17。 
	​注意：激光切割易于外包，且是一种成本低廉的制造方法。垫片可由不锈钢制成，以提供更耐用的部件，适用于反复使用。所有其他组件均为市售产品。表1列出了所需材料的完整清单，相关产品的商业信息详见材料表。</li>
</ol>
2. 设备灭菌、组装和预处理
<ol>
	<li>按照表1中的说明对所有组件进行灭菌。</li>
	<li>在层流条件下，组装两个已制备的插入件（步骤1），如图1A所示。</li>
	<li>按照以下步骤，参照图2组装灌注系统：
	<ol>
		<li>将两个相连的三通阀连接至储液器的R1端口（培养基交换端口）。</li>
		<li>使用带单向阀的管路（单向阀管路）将上述出口连接至蠕动泵泵头。</li>
		<li>使用带单向阀的系统管路将泵头连接至反应室的C4端口。 
		注：该支路可选择性地配备压力传感器，以实现持续监测。</li>
		<li>将反应室端口C1连接至软壁管路，再将该管路连接至阻力通道（内径较小）。 
		注：阻力管路的长度将显著影响系统内的压力。应进一步研究以确保获得适当的灌注条件。</li>
		<li>使用系统管路延伸阻力通道，形成回流通道，并通过连接至储液器R5端口闭合管腔循环回路（图2C）。</li>
		<li>通过使用系统管路将反应室C3端口连接至储液器R3端口，建立溢流通道。</li>
		<li>通过R2端口连接通气滤器。</li>
		<li>将含有空气和培养基的注射器连接至反应室C6端口，以构建压力缓冲装置。 
		注：合适的气液比例取决于所需的压力缓冲效果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过培养基交换端口和储液器，使用灌注培养基（DMEM高糖培养基[DMEM] + 10% [v/v] 胎牛血清[FBS] + 1% [v/v] 青霉素-链霉素 + 1% [v/v] 两性霉素B + 30% [v/v] 葡聚糖；见材料表）对系统进行预灌注。 
	​注：系统预灌注可降低系统内气泡滞留的风险，并检测潜在泄漏。推荐培养基体积约为100–120 mL。实际使用体积取决于实验所用管路的死体积。</li>
</ol>
3. 样品采集与制备
<ol>
	<li>采集左右两侧颈总动脉，尽量减少对动脉组织的直接操作13。</li>
	<li>将组织置于冷运输培养基中（DMEM + 20% [v/v] FBS + 2% [v/v] 青霉素-链霉素 + 1% [v/v] 两性霉素B，参见材料表）进行转移。</li>
	<li>在超净工作台内，用手术刀片去除多余的结缔组织并修剪组织两端。用冷运输培养基清洗组织两次。</li>
	<li>将组织置于运输培养基中，在摇床上至少震荡30分钟，以充分清洗。</li>
	<li>使用两个带齿鲁尔接头将动脉的无分支段连接至生物反应器系统，并用血管固定环（血管硅胶结扎带；表1）固定到位。 
	注意：血管固定环可提供适当的张力和回缩力，以牢固固定血管。椭圆形结构可防止组织损伤。</li>
	<li>轻柔地使培养基流经动脉，以确认管腔通畅。</li>
	<li>将动脉固定在定制插件上后，用灌注培养基（步骤2.4）填充反应腔。最后，轻柔地向管腔循环回路中加入培养基，以排除系统中残留的空气。</li>
	<li>将反应腔与先前组装好的灌注系统（第2节）连接，完成循环。 
	​注意：建议通过免疫组织化学对处理后的组织进行质量检查。这有助于识别因制备过程中操作过度而导致的任何损伤。</li>
</ol>
4. 灌注培养与换液
<ol>
	<li>将灌注系统置于含5% CO2的37 °C培养箱中，然后连接至蠕动泵（见材料表）</li>
	<li>连接任何其他可选（非必需）的采集系统，例如压力传感器（见材料表）。</li>
	<li>以约10–15 mL/min的低流速持续运行系统过夜，使其达到平衡。 
	注意：需进行初步实验以确定泵的设置参数、培养基流速、系统压力以及最佳的压力阻尼器/夹具设置，以确保满足适当的实验条件。</li>
	<li>次日，逐步增加流速（在当前系统中，每小时增加1 rpm，相当于每小时增加约2.5 mL/min），直至达到最终流速（35 mL/min）。定期监测系统是否存在泄漏。 
	注意：为根据蠕动泵转速准确计算流速，用户必须首先对泵进行充分校准18。根据公式（1），可通过给定时间内（t）分配的体积（V）计算体积流速（Q）。为估算流速（<img alt="静力平衡 ΣFx=0 示意图；说明基本物理原理和受力分析系统。" src="/files/ftp_upload/65465/65465eq03.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 3">），可使用先前计算的流速（Q）和血管横截面积（A），如公式（2）所述。 
	<img alt="电流公式 Q=v/t，电子学和物理学研究中的相关公式。" src="/files/ftp_upload/65465/65465eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 1">    （1） 
	<img alt="流体动力学公式：Q=v*A；流速计算公式示意图。" src="/files/ftp_upload/65465/65465eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 2">    （2）</li>
	<li>每3天更换50%的培养基（约50 mL），将装有新鲜培养基的注射器连接至靠近泵端的培养基更换口，将空注射器连接至靠近储液器端的更换口以收集废液（图2）。 
	注意：使用两个三通阀作为培养基更换口，可实现在更换培养基期间灌注系统的连续运行。</li>
	<li>实验结束时，使用无菌手术剪剪除与生物反应器连接的两端，从反应室中取出组织样本。</li>
	<li>拆卸、清洗并灭菌系统，以供后续使用。</li>
</ol>
5. 样品分析
<ol>
	<li>将收获的样品在4%多聚甲醛（PFA）中固定过夜，于 4 °C.</li>
	<li>将组织包埋于最佳切割温度（OCT；参见 材料清单)19 浸入液氮冷却的异戊烷中速冻。</li>
	<li>使用冷冻切片机获取厚度为3-5 mm的冷冻切片。</li>
	<li>进行免疫组织化学（苏木精和伊红 [H&E]）染色&amp;E]) 和/或免疫荧光。遵循标准的免疫荧光实验步骤：
	<ol>
		<li>在室温下用含20% [v/v] 小牛血清的磷酸盐缓冲液（PBS；参见 材料表).</li>
		<li>在4℃下孵育切片过夜 4 °C 使用 PBS 按 1:50 稀释的兔抗 CD31 一抗（见 材料表).</li>
		<li>用 PBS 洗涤三次，每次 5 分钟。</li>
		<li>37 °C孵育1小时 37 °C 使用荧光标记的山羊抗兔二抗，按1:200比例用PBS稀释，以及直接偶联荧光染料的α-平滑肌肌动蛋白（SMA）抗体，按1:200比例用PBS稀释（参见 材料列表).</li>
		<li>用 PBS 洗涤三次，每次 5 分钟。</li>
		<li>用 PBS 按 1:1,000 稀释 DAPI，室温避光孵育 10 分钟以染色细胞核。</li>
		<li>用0.1%（w/v）苏丹黑孵育（参见 材料列表在室温下用70%（v/v）乙醇处理10分钟，以降低组织自发荧光。</li>
		<li>用大量去离子水清洗组织。将切片用封片介质封片。</li>
		<li>使用共聚焦激光扫描显微镜对样品进行成像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

A Novel 3D Printed Bioreactor for Ex Vivo Culture of Blood Vessels in Perfusion

<ol><li>Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Fleming, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+atherosusceptible+endothelium%3A+Endothelial+phenotypes+in+complex+haemodynamic+shear+stress+regions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">The atherosusceptible endothelium: Endothelial phenotypes in complex haemodynamic shear stress regions in vivo.</a> Cardiovascular Research. 99 (2), 315-327 (2013).</li>
<li>Gugliandolo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoylethanolamide+and+Polydatin+combination+reduces+inflammation+and+oxidative+stress+in+vascular+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%22%5BJournal%5D)">Palmitoylethanolamide and Polydatin combination reduces inflammation and oxidative stress in vascular injury.</a> Pharmacological Research. 123, 83-92 (2017).</li>
<li>Anselmino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catheter+ablation+of+atrial+fibrillation+in+patients+with+left+ventricular+systolic+dysfunction%3A+A+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%2C+Arrhythmia%2C+and+Electrophysiology%22%5BJournal%5D)">Catheter ablation of atrial fibrillation in patients with left ventricular systolic dysfunction: A systematic review and meta-analysis.</a> Circulation, Arrhythmia, and Electrophysiology. 7 (6), 1011-1018 (2014).</li>
<li>Viola, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcutaneous+delivery+of+monoclonal+antibodies%3A+How+do+we+get+there%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Subcutaneous delivery of monoclonal antibodies: How do we get there.</a> Journal of Controlled Release. 286, 301-314 (2018).</li>
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<li>Rouwkema, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+platforms+for+tissue+engineering%3A+Implications+for+basic+research+and+clinical+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vitro platforms for tissue engineering: Implications for basic research and clinical translation.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (8), e164-167 (2011).</li>
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<li>Håkansson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individualized+tissue-engineered+veins+as+vascular+grafts%3A+A+proof+of+concept+study+in+pig%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Individualized tissue-engineered veins as vascular grafts: A proof of concept study in pig.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 15 (10), 818-830 (2021).</li>
<li>Saucy, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+pulsatile+perfusion+of+human+saphenous+veins+induces+intimal+hyperplasia+and+increased+levels+of+the+plasminogen+activator+inhibitor+1%5BTitle%5D)+AND+%22European+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Ex vivo pulsatile perfusion of human saphenous veins induces intimal hyperplasia and increased levels of the plasminogen activator inhibitor 1.</a> European Surgical Research. 45 (1), 50-59 (2010).</li>
<li>Tosun, Z., McFetridge, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+cardiac+pulse+frequencies+modulates+vSMC+phenotype+switching+during+vascular+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Engineering+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Variation in cardiac pulse frequencies modulates vSMC phenotype switching during vascular remodeling.</a> Cardiovascular Engineering and Technology. 6 (1), 59-70 (2015).</li>
<li>Matos, R. S., Maselli, D., McVey, J. H., Heiss, C., Campagnolo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+printed+bioreactor+enabling+the+pulsatile+culture+of+native+and+angioplastied+large+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">3D printed bioreactor enabling the pulsatile culture of native and angioplastied large arteries.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 9, 864580(2022).</li>
<li>Neff, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+smooth+muscle+enhances+functionality+of+tissue-engineered+blood+vessels+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Vascular smooth muscle enhances functionality of tissue-engineered blood vessels in vivo.</a> Journal of Vascular Surgery. 53 (2), 426-434 (2011).</li>
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<li>McKeen, L. W. Chapter 6 - Polyamides (Nylons). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMcKeen%2C+LW+%22The+Effect+of+Creep+and+Other+Time+Related+Factors+on+Plastics+and+Elastomers+%28Second+Edition%29%22">The Effect of Creep and Other Time Related Factors on Plastics and Elastomers (Second Edition)</a>. McKeen, L. W. , William Andrew Publishing. 197-262 (2012).</li>
<li>Moradi, M., Mehrabi, O., Azdast, T., Benyounis, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+low+power+CO2+laser+cutting+process+for+injection+molded+polycarbonate%29%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+%26+Laser+Technology%22%5BJournal%5D)">Enhancement of low power CO2 laser cutting process for injection molded polycarbonate).</a> Optics & Laser Technology. 96, 208-218 (2017).</li>
<li>Ghasem, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGhasem%2C+N+%22Computer+Methods+in+Chemical+Engineering%22">Computer Methods in Chemical Engineering</a>. , CRC Press. (2021).</li>
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<li>Engebretson, B., Mussett, Z. R., Sikavitsas, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+varying+frequency+and+duration+of+mechanical+stimulation+on+a+tissue-engineered+tendon+construct%5BTitle%5D)+AND+%22Connective+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">The effects of varying frequency and duration of mechanical stimulation on a tissue-engineered tendon construct.</a> Connective Tissue Research. 59 (2), 167-177 (2018).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

离体血管灌注系统为在受控条件下研究血管细胞在其原生组织中的功能和行为提供了一个独特的平台，有助于解析诸如损伤后血管重塑等复杂过程22。然而，大多数已报道的生物反应器均为基于定制组件的自制系统，通常难以被他人重复23。尽管存在一些商业化的替代方案，但其设计灵活性不足，且成本相对较高24。
我们开发了一种替代系统，该系统提供了一个简便、经济且可重复的平台，可利用开源的3D打印技术进行制造13。本文介绍了该系统的构建方法，以使终端用户能够实现可重复的应用。该系统可施加生理和病理条件下的压力（40–180 mmHg）、流速（6–30 mL/min），并可结合模拟血液黏度的培养基，产生不同程度的剪切应力。
可重复性是科学过程中的一个基本方面，因为它使研究人员能够验证他人的发现，并在此基础上进一步深化对血管疾病的理解。此外，能够促进研究团队之间合作的工具对于推动科学知识的发展至关重要。EasyFlow 正是这类开源且易于获取的解决方案的一个范例，可由从事血管科学领域及更广泛范围项目的实验室轻松制作和采用。
我们报道，该装置培养可维持动脉组织活力至少7天，并可用于模拟血管疾病的特定阶段。利用该系统，可模拟生理性的血流速度和压力条件13。重要的是，由于该系统的制造成本低且运行所需培养基体积少，这种灌注培养具有较高的成本效益。
该3D设计还可适用于新的应用，并可测试用于打印的新材料。即使在当前形式下，通过改变接头的长度或鲁尔接头的内径，也能轻松调整样品容纳空间以适应不同尺寸的样品。需要注意的是，由于该装置具有模块化特性且尺寸小巧，因此可在多种实验设置中使用（图5），并可应用于多重培养，即多个样品可在各自独立的生物反应器中同时暴露于不同条件下。
预计未来该系统的应用将得到拓展，以支持培养不同来源（例如，不同物种）和不同性质（例如，静脉、淋巴管）的血管，甚至可能应用于其他中空组织（例如，气管、肠道）的培养。特别是研究表明，在持续灌注条件下培养组织工程支架有助于细胞在构建物内的均匀分布以及所形成组织的成熟25,26。此外，与静态方法相比，采用灌注方式接种血管移植物有助于实现更均匀的血管腔细胞化27。基于此，我们预期该系统可应用于组织工程领域，以帮助应对当前面临的挑战，推动未来可重复制备的合成血管替代物的研发28。
本文所述方案包含若干对流体培养成功至关重要的关键步骤。建立并监测适当的流动条件并非易事，每次新系统搭建完成后均需进行此项工作，以确保培养条件符合生理状态。流动和压力通过压力传感器和超声成像进行监测。另一个关键点是在培养开始时确保组织具有活性且结构完整。这需要使用新鲜的组织来源并进行小心操作，可通过组织学分析加以验证。此外，每次实验开始前都必须进行故障排查，以识别任何可能的细菌污染或培养基泄漏来源。
需要强调的是，尽管所述灌注系统能够提供生理性的压力和流量条件，却无法完全模拟所记录的复杂压力波动模式 体内这一局限性源于使用了蠕动泵，可通过采用更专业的设备来模拟复杂的血流动力学条件以解决。此外，生物反应器中的血管培养也无法满足涉及免疫系统或与其他器官相互作用至关重要的研究需求。
总之，本文介绍了一种可模拟生理血流动力学环境的简易3D打印灌注系统，该系统有望促进 离体 血管培养。其在定制化和长期培养应用方面的潜力，使其成为深入理解生理及病理条件下这些复杂生物系统的重要工具。

血管壁处于一种反应性的稳态，这种状态既保证了对外部刺激（如压力变化、血管收缩剂）的响应能力，又维持了一个持续的非激活表面，以防止血液凝固和炎性细胞浸润1。在应对与年龄和生活方式相关的刺激以及直接损伤时，血管壁会启动重塑过程，例如再狭窄和动脉粥样硬化，这些过程是缺血性卒中和心肌梗死等常见心血管疾病（CVDs）的重要诱因2。尽管已有经皮血管重建和支架植入等介入治疗手段用于处理进展期的血管疾病，但这些方法本身可能引发进一步的血管损伤，常导致病情复发。此外，目前可用的预防性和早期干预手段十分有限。深入理解维持血管壁稳态以及驱动其功能障碍的机制，是开发新型治疗方法的核心3。
尽管分子生物学和组织工程学不断发展并取得进步，动物实验仍然是血管生物学研究中的关键组成部分。体内动物实验极大地增进了人们对血管稳态与病理机制的理解；然而，这些实验成本高昂、通量相对较低，并带来重大的伦理问题。此外，小型动物对人类血管生理的代表性较差，而大型动物实验则更加昂贵，并引发更多的伦理考量4,5。随着全球人口迅速老龄化，对药物和医疗解决方案的需求日益增长，使用动物模型的弊端愈发凸显，影响了研究成果在临床诊疗中的可重复性、可靠性和可转化性6。
体外系统为研究基本机制提供了简化的平台，但无法重现整个组织的复杂性、细胞与细胞外基质之间的相互作用以及机械力，而这些因素在血管疾病的发生发展中起着关键作用7。
在人工控制环境中对完整组织进行的ex vivo研究可在模拟in vivo复杂性的同时，实现相对高通量的分析8。由于能够精确控制培养条件和环境，ex vivo模型支持多种复杂的实验研究，为减少血管生物学研究中动物实验的使用提供了合适的替代方案。静态血管环培养虽提供了有价值的见解，但未能纳入关键的血流动力学因素9。事实上，ex vivo条件下对血管系统的研究面临特定挑战，这些挑战与作用于血管壁内细胞的多种动态力学因素密切相关。管腔内流动、湍流、剪切应力、压力以及管壁形变等刺激因素均显著影响组织的病理生理过程10,11,12。
灌注生物反应器对于研究血管稳态以及对损伤或血流动力学变化的重塑至关重要13。此外，灌注培养可用于提高组织工程血管（TEBVs）的成熟度和耐久性，为血管移植物提供合适的替代方案14。
市面上可购得的灌注生物反应器在灵活性和适应性方面存在局限，且价格昂贵。许多实验室自主开发的生物反应器由于描述不充分以及特制组件难以获取，导致在其他实验室中难以复制7,8,9,10,11,12。为克服这些限制，我们近期开发了一种新型生物反应器（EasyFlow），其生产成本低，可容纳多种组织，并能相对简便地进行修改以适应不同的研究需求13。该装置的插入件采用3D打印技术制造，可像盖子一样安装在标准的50 mL离心管上。其模块化设计和3D打印制造方式使其在不同实验室之间具有良好的可及性和可重复性，同时也易于根据不同的科学需求进行调整。本方案描述了该生物反应器系统在动脉灌注条件下的组装与基本操作流程。

<table><tbody><tr><td>EasyFlow</td><td>-</td><td>-</td><td>由 Protolabs 通过多射流熔融技术 3D 打印</td></tr><tr><td>PA12 - 3D 打印</td><td>Protolabs</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>Heidolph</td><td>&amp;nbsp;PD5201</td><td></td></tr><tr><td>培养基成分：</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>两性霉素 B 溶液，250 µg/mL，溶于去离子水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942-20ML</td><td></td></tr><tr><td>右旋糖酐&amp;nbsp;来自 Leuconostoc spp.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8802-25ML</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基 - 高糖，含 4500 mg/L 葡萄糖、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠和碳酸氢钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>免疫染色材料：</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>LEICA</td><td>CM3050 S</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-10MG</td><td></td></tr><tr><td>山羊血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023-10ML</td><td></td></tr><tr><td>山羊 &amp;alpha;-兔 Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen&amp;nbsp;eBioscience Fluoromount G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-187-88</td><td></td></tr><tr><td>MX35 Premier + 切片机刀片</td><td>Thermo Scientific</td><td>3052835</td><td></td></tr><tr><td>最佳冷冻温度化合物 - OCT</td><td>Agar Scientific</td><td>AGR1180</td><td></td></tr><tr><td>兔 &amp;alpha;-CD31 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td></td></tr><tr><td>苏丹黑 B</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-203760</td><td></td></tr><tr><td>X72 SuperFrost Plus 黏附载玻片，25×75×1 mm，白色，90&amp;deg; 磨边，磨砂区 20 mm，每盒 72 片</td><td>Fisher Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-平滑肌肌动蛋白 (SMA) Alexa Fluor&amp;reg; 647 标记抗体</td><td>R&amp;D Systems</td><td>IC1420R</td><td></td></tr><tr><td>用于激光切割组件的材料：</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>透明塑料板，1250 mm × 610 mm × 1 mm（用于激光切割&amp;nbsp;垫圈）</td><td>RS Components</td><td>258-6590</td><td></td></tr><tr><td>RS PRO 半透明橡胶海绵板，600 mm × 600 mm × 1.5 mm（用于激光切割&amp;nbsp;硅胶密封件）</td><td>RS Components</td><td>840-5541</td><td></td></tr><tr><td>可选压力监测器：</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>压力传感器</td><td>Parker Hannifin</td><td>080-699PSX-3P-5</td><td></td></tr><tr><td>SciPres 压力监测仪</td><td>Parker Hannifin</td><td>206-200-M</td><td></td></tr><tr><td>预灭菌一次性塑料器皿：</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 µm 滤器</td><td>Sarstedt</td><td>70.1114.210</td><td></td></tr><tr><td>20 mL 无菌注射器</td><td>IMS Euro</td><td>40004</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Sarstedt - 62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>小型组件：</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>扎带</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex 适配接头，雌性鲁尔接头转软管接头</td><td>Cole-Parmer</td><td>WZ-30800-10</td><td>接头适配器</td></tr><tr><td>Masterflex&amp;nbsp;聚碳酸酯鲁尔接头</td><td>Cole-Parmer</td><td>AU-45504-84</td><td></td></tr><tr><td>尼龙微型单向阀</td><td>Cole-Parmer</td><td>98553-00</td><td></td></tr><tr><td>RS PRO 半透明橡胶海绵板，600 mm × 600 mm × 1.5 mm（用于激光切割&amp;nbsp;硅胶密封件）</td><td>RS Components</td><td>840-5541</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢 M2 六角螺母</td><td>RS Components</td><td>527-218</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢 M2 × 6 mm 螺钉</td><td>RS Components</td><td>418-7426</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢 M5 六角螺母</td><td>RS Components</td><td>189-585</td><td></td></tr><tr><td>外科血管环</td><td>血管硅胶结扎带，International Medical Supplies</td><td>&amp;nbsp;10-1003</td><td></td></tr><tr><td>三通阀</td><td>IMS Euro</td><td>&amp;nbsp;91000</td><td></td></tr><tr><td>外科器械</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖镊，GRAEFE，弯型，10 cm 货号：BD-07</td><td>International Medical Supplies</td><td>货号：BD-07</td><td></td></tr><tr><td>微型镊，斜角，0.3 mm，11 cm</td><td>International Medical Supplies</td><td>货号：BD-361</td><td></td></tr><tr><td>微型剪刀 Noyes，弯型，12 cm</td><td>International Medical Supplies</td><td>货号：FD-12</td><td></td></tr><tr><td>Troge 外科手术刀片 - 23 号 - 每盒 100 片</td><td>International Medical Supplies</td><td>63114</td><td></td></tr><tr><td>管路：</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 硅胶管（内径 1.6 mm，外径 4.7 mm）</td><td>Eppendorf</td><td>M0740-2396</td><td>系统管路</td></tr><tr><td>Masterflex&amp;nbsp;PharMed BPT 三停顿管</td><td>ISMATEC</td><td>95714-48</td><td>软壁管（用于夹具）</td></tr><tr><td>RS PRO 透明软管，内径 0.8 mm，硅胶材质</td><td>RS Components</td><td>667-8432</td><td>阻力管&amp;nbsp;（小内径）</td></tr><tr><td>食品级 Tygon 管（内径 4.8 mm，壁厚 1.6 mm）</td><td>Heidolph</td><td>525-30027-00-0</td><td>单向阀管</td></tr><tr><td>Verderflex 黄色软管，内径 6.4 mm，Verderprene 材质</td><td>RS Components</td><td>125-4042</td><td>泵用管</td></tr></tbody></table>

体外 3d打印生物反应器中大血管的灌注培养

Ex Vivo Perfusion Culture of Large Blood Vessels in a 3D Printed Bioreactor

血管疾病是大多数心血管疾病（CVD）的基础，而心血管疾病至今仍是全球发病率和死亡率的首要原因。目前迫切需要有效的外科和药物干预手段来预防和治疗血管疾病。部分原因在于转化模型的缺乏，限制了人们对血管疾病中涉及的细胞和分子过程的理解。ex vivo 灌注培养生物反应器为在可控的动态环境中研究大型动物（包括人类）血管提供了一个理想的平台，结合了in vitro培养的便利性与活体组织的复杂性。然而，大多数生物反应器均为定制制造，因此难以推广使用，限制了实验结果的可重复性。本文介绍了一种可3D打印的系统，可在任何生物实验室中轻松制造和应用，并提供了详细的搭建方案，便于用户操作。这一创新且可重复的ex vivo灌注培养系统能够在生理条件下对血管进行长达7天的培养。我们预期，采用标准化的灌注生物反应器将有助于更深入地理解大型动物血管中的生理与病理过程，并加速新疗法的发现。

本研究建立了一种多功能且经济实惠的灌注系统（EasyFlow）13。该系统的3D打印设计有助于其他实验室采用，从而促进实验的可重复性。
所制备的灌注插件置于一个50 mL离心管中，形成一个隔离的环境。使用两个灌注插件可建立包含储液池和反应室的灌注回路，生物样本在其中孵育。随后将灌注系统连接至蠕动泵以及可选的采集系统（如压力传感器和超声设备），以监测培养条件（图2）。
收集并处理猪颈动脉样本，随后在灌注条件下培养7天。为确保培养前组织的质量，进行了预实验，分别在切除时、组织制备后以及灌注后对样本进行固定。采用内皮细胞（CD31）和平滑肌细胞（αSMA）标志物的荧光染色来评估组织完整性的维持情况。图3展示了保存良好与受损组织的示例，以供比较。图像表明在切除时轻柔操作组织至关重要，因为不当处理（过度拉伸、挤压等）可能导致内皮层在培养前即已丧失。结果还显示，逐步建立灌注条件对于避免管腔损伤具有重要意义。
在培养7天后，同时进行苏木精和伊红（H&amp;E）染色与免疫荧光（IF）染色，以显示血管壁内细胞形态及整体分布的维持情况（图4）。在装置中应用生理培养条件，可确保管腔内皮细胞覆盖的维持、中膜平滑肌细胞的有序排列，以及外膜中滋养血管的保存。
生物反应器系统的紧凑型模块化设计还支持多种系统配置。较小的配置包含一个生物反应器，适用于药理学和小体积研究（循环灌注20，总体积为50–70 mL）。为了延长培养时间并减少换液次数，采用单储液罐循环系统（如本方案所述）或连续供液系统更为理想，因为这些系统具有更大的循环培养基体积。可建立双循环21配置，用于探索刺激定位至关重要的实验条件。当前设备还可与更复杂的控制系统结合，实现对pH值和溶解氧等参数的精确反馈控制（图5）。
<img alt="显示去气泡组件的部件分解和流体管理横截面示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65465/65465fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：EasyFlow 组件示意图。（A）3D 渲染示意图，用于辅助灌注插件的组装。（B）提供详细示意图以帮助连接部位的组装。（C）反应空间的横截面视图，突出显示 EasyFlow 插件的关键组件以及组织与插件的连接方式。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65465/65465fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="生物反应器流体流动系统示意图，包含蠕动泵、压力探头和超声探头。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65465/65465fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：灌注系统组装的示意图。（A）包含所有关键组件的组装式灌注系统，展示了它们在三维渲染环境中的相对位置。并非所有组件均按比例绘制。（B）还提供了各个组件的等距视图。（C）展示了组装后灌注系统的俯视图，以帮助组装和连接不同组件。端口已按逆时针方向标注并编号，以便于识别灌注系统中的各个连接位点。该原则同样适用于储液池（R）和反应室（C）。连接两个腔室的各个通道也已命名，便于参考。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65465/65465fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显微镜图像，组织荧光显示用于结构分析的红色、绿色、蓝色染色模式。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65465/65465fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：处理过程中组织的维持。(A) 共聚焦图像显示收获时动脉的正常结构，(B) 清洗和处理后，以及(C) 灌注培养后，表明组织形态保持良好。(D) 由于处理过程中过度或不当操作，或(E) 由于应用非生理培养条件（例如，突然启动高流速）导致组织损伤的示例，显示管腔覆盖层减少以及中膜结构破坏。(F) 阴性对照表明染色的特异性。CD31：绿色；αSMA：红色；DAPI：蓝色。比例尺：100 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65465/65465fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显微动脉组织分析；组织学与免疫荧光图像；细胞结构。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65465/65465fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：灌注培养前后组织的组织学评估。（A 和 B）在收获时对动脉组织进行组织学评估，（C 和 D）使用生物反应器系统培养 7 天后再次评估。（A 和 C）H&amp;E 染色显示动脉壁结构和组织得以保留。（B 和 D）相同组织的免疫荧光染色显示内皮覆盖、平滑肌细胞排列以及外膜中的血管滋养血管。CD31：绿色；SMA：红色；DAPI：蓝色。比例尺：100 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65465/65465fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="带有传感器、气体管路和用于灌注系统的 PID 控制器设置的生物反应器设计流程图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65465/65465fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：可能的灌注系统设置示意图。 灌注插件可支持多种不同的替代设置，以实现不同的实验研究。(A) 循环灌注系统可最大限度减少所需培养基的体积。(B) 恒流供给系统可为组织提供持续稳定的培养基供应。(C) 单储液罐循环系统（如本文所述）可为长期孵育提供更大体积的培养基，并包含用于气体交换和压力平衡的缓冲区。(D) 双循环系统可提供两个独立回路，分别向内侧（动脉内部）和外侧（反应空间）循环供液。(E) 动态灌注系统通过比例-积分-微分（PID）控制器实现连续气体和 pH 值控制。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65465/65465fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
表1：制备插入件的组件。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65465/65465_Table%201.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
补充文件1：用于3D打印制造的EasyFlow插件的3D模型。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65465/Supplementary%20File%201.stl" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件2：所构建装置的设计示意图、剖面图、打印件及密封组件。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65465/Supplementary%20File%202.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本方案介绍了新开发的3D打印生物反应器的组装与操作方法 离体 灌注条件下血管的培养。该系统设计易于被其他用户采用，具有实用性、经济性，并可适应不同的实验应用，如基础生物学和药理学研究。

体外 3D打印生物反应器中大血管的灌注培养

血管疾病是大多数心血管疾病（CVD）的基础，而心血管疾病至今仍是全球范围内发病率和死亡率的主要原因。有效的……

我们开发了一种简单、经济且可适应的生物反应器，用于体外培养血管。对血管施加生理性的流动和脉动压力可确保组织内的细胞保持活性。使用生物反应器（例如本文所述的类型）能够在体外培养血管，从而减少科研中对动物实验的依赖。在体外培养中，施加血流动力学力对于维持血管健康至关重要，而灌注式生物反应器是实现这种动态环境的理想解决方案。现有文献中描述的系统往往难以复制、成本高昂且不易改造。我们开发了一种名为 EasyFlow 的新型灌注系统。该系统生产成本低，可适配多种组织类型，且易于修改，研究人员可根据实验需求对其进行调整。该系统的制备基于三维模型，开源开放，可通过论文获取。此外，还可根据此三维模型进一步适应研究需求。目前，EasyFlow 正被用于测试血管修复机制，例如基于干细胞或生物材料的疗法。我们还计划利用该生物反应器诱导组织工程血管的成熟。

ex-vivo-perfusion-culture-large-blood-vessels-3d-printed

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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在三维流体芯片中模拟肺叶切除术后血管内皮糖萼——一种基于血管的器官芯片系统的构建方法

了解如何使用3D打印生物反应器对血管进行离体灌注培养。EasyFlow系统经济实用，可模拟生理血流和脉动压力，维持细胞活性，适用于血管修复机制研究及干细胞与生物材料疗法测试。

体外 3D打印生物反应器中大血管的灌注培养

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