Name: 基于磁性荧光珠的PDL1-Vaxx肽疫苗诱导的PD-1/PD-L1相互作用抗体阻断的双报告流分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: 了解基于磁性荧光珠的双报告流分析技术，用于检测PDL1-Vaxx肽疫苗诱导的抗体对PD-1/PD-L1相互作用的阻断效果。该方法为癌症免疫治疗研究提供了可靠的评估工具。

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作者感谢美国德克萨斯州奥斯汀市Luminex Corporation公司的Sherry Dunbar博士（PhD，MBA）提供的研究支持，以及美国佛罗里达州巴拿马城Biomedical Publishing Solutions公司的Matthew Silverman博士（mattsilver@yahoo.com）在科学内容和写作方面的协助。本研究获得了美国国立卫生研究院（R21 CA13508 和 R01 CA84356）以及澳大利亚悉尼Imugene有限公司（OSU 900600、GR110567 和 GR124326）的资助。

Flow Analysis of PDL1-Vaxx Antibody Blockade Using Magnetic Fluorescent Beads

<ol><li>Kaumaya, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-cell+epitope+peptide+cancer+vaccines%3A+a+new+paradigm+for+combination+immunotherapies+with+novel+checkpoint+peptide+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Oncology%22%5BJournal%5D)">B-cell epitope peptide cancer vaccines: a new paradigm for combination immunotherapies with novel checkpoint peptide vaccine.</a> Future Oncology. 16 (23), 1767-1791 (2020).</li>
<li>Pandey, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revolutionization+in+cancer+therapeutics+via+targeting+major+immune+checkpoints+PD-1%2C+PD-L1+and+CTLA-4%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceuticals%22%5BJournal%5D)">Revolutionization in cancer therapeutics via targeting major immune checkpoints PD-1, PD-L1 and CTLA-4.</a> Pharmaceuticals. 15 (3), 335(2022).</li>
<li>Guo, L., Overholser, J., Good, A. J., Ede, N. J., Kaumaya, P. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+studies+of+a+novel+human+PD-1+B-cell+peptide+cancer+vaccine+PD1-Vaxx+from+BALB%2Fc+mice+to+beagle+dogs+and+to+non-human+primates+%28cynomolgus+monkeys%29%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Preclinical studies of a novel human PD-1 B-cell peptide cancer vaccine PD1-Vaxx from BALB/c mice to beagle dogs and to non-human primates (cynomolgus monkeys).</a> Frontiers in Oncology. 12, 826566(2022).</li>
<li>Brahmer, J. R., Hammers, H., Lipson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nivolumab%3A+Targeting+PD-1+to+bolster+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Oncology%22%5BJournal%5D)">Nivolumab: Targeting PD-1 to bolster antitumor immunity.</a> Future Oncology. 11 (9), 1307-1326 (2015).</li>
<li>Shah, N. J., Kelly, W. J., Liu, S. V., Choquette, K., Spira, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Product+review+on+the+Anti-PD-L1+antibody+atezolizumab%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Vaccines+%26+Immunotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Product review on the Anti-PD-L1 antibody atezolizumab.</a> Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (2), 269-276 (2018).</li>
<li>Postow, M. A., Sidlow, R., Hellmann, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune-related+adverse+events+associated+with+immune+checkpoint+blockade%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immune-related adverse events associated with immune checkpoint blockade.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (2), 158-168 (2018).</li>
<li>Kaumaya, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+paradigm+shift%3A+Cancer+therapy+with+peptide-based+B-cell+epitopes+and+peptide+immunotherapeutics+targeting+multiple+solid+tumor+types%3A+Emerging+concepts+and+validation+of+combination+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Vaccines+%26+Immunotherapeutics%22%5BJournal%5D)">A paradigm shift: Cancer therapy with peptide-based B-cell epitopes and peptide immunotherapeutics targeting multiple solid tumor types: Emerging concepts and validation of combination immunotherapy.</a> Human Vaccines & Immunotherapeutics. 11 (6), 1368-1386 (2015).</li>
<li>Guo, L., Kaumaya, P. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+prototype+checkpoint+inhibitor+B-cell+epitope+vaccine+%28PD1-Vaxx%29+en+route+to+human+Phase+1+clinical+trial+in+Australia+and+USA%3A+Exploiting+future+novel+synergistic+vaccine+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">First prototype checkpoint inhibitor B-cell epitope vaccine (PD1-Vaxx) en route to human Phase 1 clinical trial in Australia and USA: Exploiting future novel synergistic vaccine combinations.</a> British Journal of Cancer. 125 (2), 152-154 (2021).</li>
<li>Dakappagari, N. K., Douglas, D. B., Triozzi, P. L., Stevens, V. C., Kaumaya, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+mammary+tumors+with+a+chimeric+HER-2+B-cell+epitope+peptide+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Prevention of mammary tumors with a chimeric HER-2 B-cell epitope peptide vaccine.</a> Cancer Research. 60 (14), 3782-3789 (2000).</li>
<li>Dakappagari, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+HER-2%2Fneu+B-cell+epitope+peptide+vaccine+designed+to+incorporate+two+native+disulfide+bonds+enhances+tumor+cell+binding+and+antitumor+activities%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Conformational HER-2/neu B-cell epitope peptide vaccine designed to incorporate two native disulfide bonds enhances tumor cell binding and antitumor activities.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (1), 54-63 (2005).</li>
<li>Kaumaya, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I+active+immunotherapy+with+combination+of+two+chimeric%2C+human+epidermal+growth+factor+receptor+2%2C+B-cell+epitopes+fused+to+a+promiscuous+Tcell+epitope+in+patients+with+metastatic+and%2For+recurrent+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Phase I active immunotherapy with combination of two chimeric, human epidermal growth factor receptor 2, B-cell epitopes fused to a promiscuous Tcell epitope in patients with metastatic and/or recurrent solid tumors.</a> Journal of Clinical Oncology. 27 (31), 5270-5277 (2009).</li>
<li>Bekaii-Saab, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I+immunotherapy+trial+with+two+chimeric+HER-2+B-cell+peptide+vaccines+emulsified+in+montanide+ISA+720VG+and+Nor-MDP+adjuvant+in+patients+with+advanced+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Phase I immunotherapy trial with two chimeric HER-2 B-cell peptide vaccines emulsified in montanide ISA 720VG and Nor-MDP adjuvant in patients with advanced solid tumors.</a> Clinical Cancer Research. 25 (12), 3495-3507 (2019).</li>
<li>Kaumaya, P. T. P., Guo, L., Overholser, J., Penichet, M. L., Bekaii-Saab, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+and+antitumor+efficacy+of+a+novel+human+PD-1+B-cell+vaccine+%28PD1-Vaxx%29+and+combination+immunotherapy+with+dual+trastuzumab%2Fpertuzumab-like+HER-2+B-cell+epitope+vaccines+%28B-Vaxx%29+in+a+syngeneic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity and antitumor efficacy of a novel human PD-1 B-cell vaccine (PD1-Vaxx) and combination immunotherapy with dual trastuzumab/pertuzumab-like HER-2 B-cell epitope vaccines (B-Vaxx) in a syngeneic mouse model.</a> Oncoimmunology. 9 (1), 1818437(2020).</li>
<li>Guo, L., Overholser, J., Darby, H., Ede, N. J., Kaumaya, P. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+newly+discovered+PD-L1+B_cell+epitope+peptide+vaccine+%28PDL1-Vaxx%29+exhibits+potent+immune+responses+and+effective+anti-tumor+immunity+in+multiple+syngeneic+mice+models+and+%28synergizes%29+in+combination+with+a+dual+HER-2+B-cell+vaccine+%28B-Vaxx%29%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">A newly discovered PD-L1 B_cell epitope peptide vaccine (PDL1-Vaxx) exhibits potent immune responses and effective anti-tumor immunity in multiple syngeneic mice models and (synergizes) in combination with a dual HER-2 B-cell vaccine (B-Vaxx).</a> Oncoimmunology. 11 (1), 2127691(2022).</li>
<li>Angeloni, S., Das, S., De Jager, W., Dunbar, S. Luminex Corporation. The xMAP® Cookbook, 5th edition. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://info.luminexcorp.com/en-us/research/download-the-xmap-cookbook?utm_referrr=https%3A%2F%2Fwww.luminexcorp.com%2F">https://info.luminexcorp.com/en-us/research/download-the-xmap-cookbook?utm_referrr=https%3A%2F%2Fwww.luminexcorp.com%2F</a> (2022).</li>
<li>MagPlex® Microspheres Documentation. Product information sheet. Luminex Corporation. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/#overview">https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/#overview</a> (2014).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Estimation+of+cell+number+by+hemocytometry+counting%22">Estimation of cell number by hemocytometry counting</a>. 2019 (11), Cold Spring Harbor Protocols. (2019).</li>
<li>Gibbs, J., Vessels, M., Rothenberg, M. Selecting the Detection System - Colorimetric, Fluorescent, Luminescent Methods for ELISA Assays. Corning Inc. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.corning.com/catalog/cls/documents/application-notes/CLS-DD-AN-458.pdf">https://www.corning.com/catalog/cls/documents/application-notes/CLS-DD-AN-458.pdf</a> (2019).</li>
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Pravin T.P. Kaumaya 是 Imugene 公司的顾问。

检查点相关癌症免疫治疗的目的是破坏检查点蛋白与其在肿瘤存活和进展中起重要作用的配体之间的相互作用2。该研究团队正在积极开发新型PD-1和PD-L1疫苗，以诱导产生靶向并阻断PD-1/PD-L1检查点的抗体反应3,8,13,14。此前，研究人员采用两种不同形式的酶联免疫吸附试验（ELISA）来评估抗PDL1肽抗体对重组PD-1/PD-L1相互作用的抑制效果14。（1）在第一种方法中，将rhPD-L1包被于微孔板上，随后加入经抗PDL1疫苗候选物诱导产生的稀释抗体。通过添加生物素标记的rhPD-1，并利用链霉亲和素-辣根过氧化物酶偶联物及比色底物定量其与固定化rhPD-L1的结合情况，从而评估抗体对重组PD-1/PD-L1相互作用的抑制程度。我们将此定义为直接阻断试验。（2）在第二种方法中，将PD-1包被于微孔板上。将生物素标记的rhPD-L1分别与各抗PDL1候选疫苗诱导的多克隆抗体在独立的反应管中预先孵育。随后将rhPD-L1/抗PDL1混合物加入含有固定化rhPD-1的孔板中并使其发生反应。在可能存在阻断作用的PDL1-Vaxx诱导抗体存在下，任何与固定化rhPD-1发生反应的rhPD-L1均通过后续加入链霉亲和素-HRP及比色底物进行孵育后检测。我们将此定义为反向阻断试验。
抗PDL1肽抗体通过逆转阻断重组PD-1/PD-L1相互作用，显示出对抗信号（即PD-1/PD-L1阻断）的抑制作用，且该抑制呈抗体浓度依赖性14，而直接阻断方法未获得一致的结果（未显示）。为验证ELISA结果并研究在液相中PD-1/PD-L1相互作用的阻断情况，开发了基于微球的双报告基因阻断检测法，该方法避免了将重组蛋白固定于孔底可能带来的空间位阻或结合表位可及性问题。微球分析结果与采用逆转阻断法的ELISA阻断结果直接相关（图2）。此外，相较于比色法ELISA，基于荧光的免疫检测具有更高的检测灵敏度和更宽的动态范围18；并且，多重微球检测技术可在单个反应体系中同时进行两种独立的免疫检测。用于将微球与rhPD-1共价偶联的磺基-NHS和EDC可能造成了直接阻断与逆转阻断检测之间的性能差异，以及ELISA与Luminex微球法重组PD-1/PD-L1相互作用检测之间观察到的灵敏度差异。有必要进一步在化学和分子水平上深入研究导致这些差异的潜在机制。
ELISA14 和基于微球的检测均表明，PDL1-Vaxx 诱导产生的抗 PD-L1 抗体能够抑制 PD-1/PD-L1 检查点复合物的形成。基于多肽的 PDL1-Vaxx 可成功诱导产生能够阻断 PD-1/PD-L1 相互作用的抗 PD-L1 抗体。该策略可能成为治疗癌症的一种新型治疗手段，这一观点已得到临床前动物研究的支持3,13,14。计划开展的临床试验将评估 PDL1-Vaxx 在癌症患者中用于检查点免疫治疗及疾病控制的有效性。

在免疫系统的T细胞、B细胞及细胞内检查点中，信号通路调控着免疫活动。某些癌细胞通过激活检查点靶点来抑制免疫功能，从而保护自身免受免疫攻击，并促进肿瘤的存活与增殖。肿瘤免疫治疗中的检查点抑制疗法利用抗体靶向并阻断这些信号检查点，进而恢复免疫系统对肿瘤的抑制功能1,2,3。目前高效的抗癌治疗包括靶向程序性死亡蛋白1（PD-1）的单克隆抗体纳武利尤单抗4，以及靶向程序性死亡配体1（PD-L1）的阿替利珠单抗5。该策略在癌症患者治疗中已显示出显著的临床疗效。然而，当前检查点抑制策略的临床应用受到不良反应和治疗耐药性的限制，尤其是在单药治疗中更为明显6。因此，亟需将免疫治疗与毒性更低且更有效的治疗策略联合应用于癌症治疗1,3,6。
在过去30年中，Kaumaya博士的实验室开发了多肽癌症疫苗及相关多肽模拟剂用于癌症治疗，其中部分疫苗已进入正在进行的临床试验1,2,7,8,9,10,11,12,13,14。例如，在临床试验中，联合HER-2免疫治疗的B-Vaxx在治疗转移性和/或复发性实体瘤患者方面显示出临床获益12。该实验室最新的癌症疫苗为PD1-Vaxx2,13和PDL1-Vaxx14，在临床前研究中表现出显著优势，尤其在联合治疗中效果突出。PD1-Vaxx已在美国和澳大利亚完成了剂量递增的临床试验。PD1-Vaxx将于2023年5月启动的1b期临床试验中与阿替利珠单抗（atezolizumab）联合使用。本报告重点评估PDL1-Vaxx诱导的抗体阻断PD-1/PD-L1相互作用的能力。
PDL1-Vaxx 癌症疫苗是一种新型的 B 细胞肽表位疫苗，其中 PD-L1 的氨基酸 130-147 通过 GPSL 肽连接子与广谱 T 细胞麻疹病毒融合（MVF）肽相连。via。临床前研究表明，PDL1-Vaxx 在多种动物模型中具有高度免疫原性，可有效刺激抗肿瘤抗体的产生，延长生存期，并减轻肿瘤负荷14。针对 PD-L1 肽段产生的抗体能够成功阻断 PD1/PD-L1 相互作用，从而发挥抗肿瘤活性。本报告介绍了一种基于磁珠、采用双报告系统在流式细胞仪上检测 PDL1-Vaxx 诱导抗体对 PD1/PD-L1 复合物形成阻断作用的检测方法。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;缓冲液&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>激活缓冲液：0.1 M NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，pH 6.2</td><td>默克/西格玛</td><td>S3139</td><td></td></tr><tr><td>检测/洗涤缓冲液：PBS-TBN（1× PBS，pH 7.4，含 0.1% BSA、0.05% (v/v) Tween-20 和 0.05% NaN₃）&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>默克/西格玛</td><td>P3563（PBS+Tween20）、A7888（牛血清白蛋白）、S8032（叠氮化钠）</td><td></td></tr><tr><td>偶联缓冲液：50 mM 2-吗啉乙磺酸（MES），pH 5.0</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>M2933</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;偶联试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐（EDC）</td><td>赛默飞世尔科技公司（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）</td><td>77149</td><td></td></tr><tr><td>xMAP 抗体偶联试剂盒（如需要），包含：</td><td>Luminex Corp.&amp;nbsp; （美国德克萨斯州奥斯汀）</td><td>40-50016</td><td></td></tr><tr><td>EDC，10 mg&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sNHS 溶液，250 &amp;micro;L</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>活化/偶联缓冲液：0.1 M 2-吗啉乙磺酸（MES），pH 6.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>洗涤缓冲液：1x PBS，pH 7.4，含 0.1% BSA、0.05% (v/v) Tween-20 和 0.05% NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; (PBS-TBN)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>磺基-NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）</td><td>赛默飞世尔科技公司（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）</td><td>24510</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;仪器设备与辅助实验耗材&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>xMAP INTELLIFLEX（双报告分子仪器）</td><td>Luminex Corp.&amp;nbsp; （美国德克萨斯州奥斯汀）</td><td>INTELLIFLEX-DRSE-RUO</td><td></td></tr><tr><td>低蛋白吸附圆底96孔板</td><td>赛默飞世尔科技公司（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）</td><td>07-200-761</td><td></td></tr><tr><td>Luminex 磁性板分离器（或同类产品）&amp;nbsp;</td><td>Luminex Corp.&amp;nbsp; （美国德克萨斯州奥斯汀）</td><td>CN-0269-01</td><td></td></tr><tr><td>Luminex 磁力管分离器（或同类产品）</td><td>Luminex Corp.&amp;nbsp; （美国德克萨斯州奥斯汀）</td><td>CN-0288-01</td><td></td></tr><tr><td>MagPlex 微球（磁性、荧光、6.5-&amp;micro;微米级直径珠粒</td><td>Luminex Corp.&amp;nbsp; （美国德克萨斯州奥斯汀）</td><td>MC-1****（根据微珠标签不同而变化）</td><td></td></tr><tr><td>蛋白质低吸附微量离心管</td><td>赛默飞世尔科技公司（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）</td><td>022431081</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;多肽，抗体 &amp;和检测试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>阿特珠单抗（人源化抗PD-L1 IgG1单克隆抗体），阳性对照</td><td>Genentech/Roche（美国加利福尼亚州旧金山）</td><td>n/a（处方药）</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记的重组人PDL1&amp;nbsp;</td><td>Sino Biological（宾夕法尼亚州韦恩）</td><td>10084-H49H-B</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421标记的驴抗人IgG</td><td>杰克逊免疫研究实验室公司（美国宾夕法尼亚州韦斯特格罗夫）</td><td>709-675-149</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 标记的驴抗兔 IgG</td><td>杰克逊免疫研究实验室公司（美国宾夕法尼亚州韦斯特格罗夫）</td><td>711-675-152</td><td></td></tr><tr><td>重组人 PD-1（多聚组氨酸标签）</td><td>Acro Biosystems（美国特拉华州纽瓦克）</td><td>PD1-H5256&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素偶联R-藻红蛋白（SAPE）</td><td>安捷伦（美国加利福尼亚州圣克拉拉）</td><td>PJRS34-1</td><td></td></tr><tr><td>曲妥珠单抗（Herceptin，人源化抗HER2单克隆抗体），阴性对照</td><td>Genentech/Roche（美国加利福尼亚州旧金山）</td><td>n/a（处方药）</td><td></td></tr></tbody></table>

基于磁性荧光微球的双报告系统流式分析pdl1-vaxx多肽疫苗诱导的抗体对pd-1/pd-l1相互作用的阻断效应

Magnetic Fluorescent Bead-Based Dual-Reporter Flow Analysis of PDL1-Vaxx Peptide Vaccine-Induced Antibody Blockade of the PD-1/PD-L1 Interaction

检查点受体（PD-1、PD-L1 和 CTLA-4）的单克隆抗体抑制在治疗癌症患者的临床试验中已显示出显著疗效，并已成为现代癌症免疫治疗的主要手段。然而，仅有一部分患者对检查点单克隆抗体免疫治疗产生应答。因此，迫切需要开发新的癌症治疗策略。一种新型B细胞肽表位PDL1（程序性死亡配体1）癌症疫苗已被研制出来，该疫苗将氨基酸130-147与MVF肽相连&#34;非特异性的&#34; T细胞麻疹病毒融合蛋白 通过 一种GPSL连接子。临床前测试表明，该PDL1疫苗（PDL1-Vaxx）可在动物体内有效激发高度免疫原性的抗体。接种PDL1-Vaxx的动物在多种动物癌症模型中表现出肿瘤负荷降低和生存期延长。作用机制研究表明，疫苗诱导的抗体可抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡，并阻断PD-1/PD-L1相互作用。本文介绍了一种基于磁珠的检测方法，该方法采用双报告系统流式分析技术，用于评估PD-1/PD-L1相互作用及其被针对PDL1-Vaxx产生的抗PDL1抗体所阻断的情况。

该检测能够精确定量四种针对rhPD-L1疫苗肽段产生的多克隆抗体对PD-1/PD-L1相互作用的抑制作用，这些抗体正在被探索作为潜在的癌症治疗药物。图1展示了本检测的示意图。使用链霉亲和素-PE检测试剂通过报告通道1测量了结合到rhPD-1偶联磁珠上的生物素化rhPD-L1的量，以及四种PLD1-Vaxx诱导的候选抗体对该结合的抑制作用，该试剂可直接结合rhPD-L1（图2）。
四种多克隆抗PDL1肽抗体均在不同程度上阻断了可溶性人PD-L1（rhPD-L1）与固定在微球上的PD-1之间的相互作用。在最高测试浓度1,000 µg/mL时，不同抗PDL1肽抗体的抑制率范围为48%至74%。阳性对照单克隆抗体atezolizumab在最高测试浓度14 4 µg/mL时对PD-1/PD-L1相互作用的阻断率达到92%（图2）。与阴性对照抗体trastuzumab（预期不与PD-1/PD-L1系统发生相互作用）相比，所有实验性PDL1-Vaxx抗体均表现出浓度依赖性的rhPD-L1与rhPD-1偶联微珠结合抑制作用。
<img alt="PD-1/PD-L1 抑制曲线图，抗体浓度与抑制率的关系，抗体功效的数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65467/65467fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图2：通过新型基于荧光微球的免疫分析法检测抗PDL1肽抗体对rhPD-L1与磁珠偶联的rhPD-1相互作用的阻断效果。 将重组人PD-1（rhPD-1）偶联至磁性微球，然后将微球与预先与不同抗PDL1肽抗体孵育的生物素标记的rhPD-L1进行孵育。使用链霉亲和素-藻红蛋白（streptavidin-phycoerythrin）检测试剂结合生物素，从而评估可与PD-1结合的rhPD-L1的相对量。检测了兔源性抗PDL1肽疫苗多克隆抗体（anti-PDL1[36]、anti-PDL1[50]、anti-PDL1[95]和anti-PDL1[130]）的抑制活性，在最高测试浓度下显示出48%–74%的重组PD-1/PD-L1相互作用阻断率。以阿替利珠单抗（atezolizumab，另一种抗PDL1单克隆抗体）作为阳性对照，无关的商用单克隆抗体曲妥珠单抗（trastuzumab，抗HER2）作为阴性对照。本图改编自Guo等人的研究14。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65467/65467fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="抗PD-L1抗体结合率与浓度关系图，显示相对于对照组的MFI响应值。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65467/65467fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：不同PDL1-Vaxx诱导抗体与rhPD1包被的磁珠结合的rhPD-L1复合物的结合能力比较。 使用Brilliant violet 421标记的二抗检测抗体，比较不同兔多克隆抗PDL1肽抗体与rhPD-L1的结合能力 通过 rhPD-1包被的微球。BV421蓝色荧光信号在双报告系统仪器的报告通道2中记录，该信号与实验性抗PDL1肽抗体的相对结合效率相关。曲妥珠单抗（抗HER2）是一种靶向不同于PD-1/PD-L1通路的检查点的单克隆抗体，用作阴性对照。MFI表示每种条件下在两个重复反应孔中测量的微球中位荧光强度的平均值。该图改编自Guo等人的研究。14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65467/65467fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
使用另一种检测系统（BV421标记的抗兔IgG）在仪器的第二个报告通道上评估了四种实验性PDL1-Vaxx诱导候选抗体与rhPD-L1结合能力的相对强弱。结果表明，这四种多克隆抗PDL1肽抗体均能以浓度依赖的方式结合rhPD-L114（图3）。其中，抗PDL1(130)抗体在四种PDL1-Vaxx诱导的抗体候选物中显示出最高的rhPD-L1结合信号。

检查点抑制剂是开发抗癌疗法的重要靶点。本报告介绍了一种新型基于PDL1肽的癌症疫苗PDL1-Vaxx，该疫苗可诱导产生中和性多克隆抗体，阻断PD-1/PDL1复合物的形成。本研究还详细描述了用于分析该活性的荧光微球检测方法的开发与验证过程。

基于磁性荧光微球的双报告系统流式分析PDL1-Vaxx多肽疫苗诱导的抗体对PD-1/PD-L1相互作用的阻断效应

通过单克隆抗体抑制检查点受体（PD-1、PD-L1 和 CTLA-4）在癌症治疗的临床试验中已显示出显著疗效。

由Pravin Kaumaya教授领导的项目致力于开发B细胞七肽疫苗，这类疫苗可用于增强免疫系统，以更有效地对抗癌症。我们相信，靶向免疫检查点的肽类疫苗甚至可以与其他疗法联合使用，以改善患者的治疗效果。我们希望在传统的微珠检测中测试我们抗PD-L1抗体的阻断能力，其中人重组PD-L1蛋白被结合到MagPlex微珠上。我们发现，一旦PD-L1与磁珠结合，其对PD-1配体的结合能力显著降低。这使得我们无法采用此途径进行阻断检测。当蛋白与磁珠结合后抑制了其与配体或抗体的结合时，可选择先将待测抗体在溶液中对目标蛋白进行预处理，随后再加入配体包被的磁珠至目标阻断剂混合物中。可以检测它们之间的相互作用。这可能是一种研究相同靶标-配体结合相互作用的不同途径。我们已开发出 B-Vaxx、PD1-Vaxx、PDL1-Vaxx 和 CTLA4-Vaxx 癌症疫苗。这些疫苗靶向HER2，而多种免疫检查点标志物参与了不同类型的癌症。B-Vaxx和PD1-Vaxx目前正在澳大利亚和美国进行临床试验。我们希望我们的免疫检查点疫苗能够使更多患者受益。在之前的微球实验中，我们发现PD-1与其配体PD-L1之间具有良好的相互作用。因此，我们在加入PD-1标记的MagPlex磁珠之前，重新设计了实验方案，先将抗PD-L1肽段抗体与生物素标记的PD-L1蛋白预先结合。这使我们能够检测这些抗体阻断PD-1与PD-L1相互作用的能力。我们将继续致力于联合免疫治疗的研究。让我们克服治疗耐药性。我们还希望探索更有效的联合疗法，以更好地抑制肿瘤生长、防止转移并延长患者的生存率。首先，将所有抗体配制成浓度为 2,000 微克/毫升的储备液。然后，针对每种抗体，标记相应稀释管及其浓度，并注明抗体名称。同时为每种抗体设置一个空白管，作为仅含PBS-TBN缓冲液的对照。接下来，向所有标记为500微克/毫升及以下浓度的抗体稀释管中加入75微升PBS-TBN缓冲液，包括仅含载体的对照管。每种抗体均取150微升储备液，加入标记为1,000微克/毫升的离心管中。为每种抗体建立完整的梯度稀释系列，需从1,000微克/毫升的管中转移75微升至系列中下一个较低浓度的管。随后，盖紧新配制的稀释管，并短暂涡旋混匀。然后，将25 µL稀释后的抗体加入96孔微孔板中指定的孔内，随后向每个反应孔中加入25 µL生物素标记的重组人PD-L1。用铝箔或塑料粘性封膜覆盖微孔板，并在600 RPM的振荡式微孔板摇床上室温孵育1小时。接着，用PBS-TBN将偶联了重组人PD-1的磁珠稀释至浓度为每毫升50,000个磁珠。从摇床中取出96孔微孔反应板，揭去粘性板封膜。向每孔加入50 µL重组人PD-1偶联微球混合液。用封板膜严密封闭，置于设定为600 RPM的轨道摇床上，室温避光孵育1小时。孵育后，小心移除粘性板密封膜。然后将板置于磁性板分离器上静置两分钟，以固定磁珠。确认磁铁与微量滴定板已牢固连接。将平板翻转并小心弃去上清液。为洗去磁珠上残留的反应试剂，将微孔板从磁板分离器上取下，每孔加入150 µL PBS-TBN。移除封板膜并按所示方法固定磁珠后，确认磁铁和微孔板已固定，然后弃去上清液。现在，向每个反应孔中加入 100 µL SAPE 工作液，并用移液器吹打重悬磁珠。密封反应板，在室温避光条件下孵育 1 小时，然后小心移除粘性板封膜。待磁珠被磁铁吸附固定，且磁铁与反应板稳固结合后，轻轻翻转反应板倒去上清液。为洗去磁珠上多余的SAPE，将微孔板从磁性板架上取下，向每孔加入150微升PBS-TBN以重悬磁珠。随后，将微孔板置于磁性分离板上静置两分钟，使磁珠固定。确认磁铁与微孔板已稳固后，将微孔板倒置并弃去上清液。随后，向各自的孔中加入 100 µL 稀释后的 Brilliant Violet 421 标记的抗人或抗兔免疫球蛋白 G。密封反应板，并在室温避光条件下孵育 1 小时。然后，固定磁珠并移除粘性板封膜。确认磁铁和微量滴定板已固定，然后弃去上清液。向每个孔中加入150 µL PBS-TBN以重悬磁珠，从而洗涤未结合的二抗。接着，将微量滴定板置于磁性板分离器上静置2分钟，使磁珠固定。确认磁铁与微量滴定板已牢固贴合，然后将板倒置并弃去上清液。在去除第四次也是最后一次洗涤缓冲液后，将微量滴定板从磁性板分离器中取出。使用移液器，每孔加入100 µL PBS-TBN重悬磁珠。最后，为了确定每个反应的中位荧光强度，在双报告系统流式分析仪上读取酶标板，设置吸取体积为50微升，最低微球计数为100个微球，超时设置为40秒，门控范围为7,000至17,000，操作模式为双报告模式。四种多克隆抗PD-L1肽抗体均阻断了重组人PD-L1与PD-1的相互作用。在最高测试浓度1,000微克/毫升时，不同抗PD-L1肽抗体的抑制率范围为48%至74%。阳性对照单克隆抗体阿替利珠单抗在最高测试浓度（每毫升4微克）下实现了92%的PD-1与PD-L1相互作用阻断。对PDL1-Vaxx诱导的候选抗体与重组人PD-L1的结合进行比较分析表明，四种多克隆抗PD-L1肽抗体均以浓度依赖的方式结合重组人PD-L1。在四种PDL1-Vaxx诱导的抗体候选物中，抗-PDL1(130)抗体显示出最高的重组人PD-L1结合信号。

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癌症研究

基于磁性荧光珠的PDL1-Vaxx肽疫苗诱导的PD-1/PD-L1相互作用抗体阻断的双报告流分析

在本视频中，我们演示了一种利用包被了抗GFP抗体的磁珠，对GFP标记的野生型和突变型PD-1蛋白进行共免疫沉淀的技术。将磁珠结合的PD-1-GFP蛋白与可与PD-1相互作用的SHP2蛋白共同孵育，从而能够鉴定PD-1中在SHP2相互作用中起关键作用的特定结构基序。...

免疫沉淀实验研究转染细胞中酶受体相互作用

双分子荧光互补的流式细胞术分析为研究蛋白质-蛋白质相互作用提供了一种高通量的定量方法。该方法可用于绘制蛋白质结合位点图谱，以及筛选调控蛋白质-蛋白质相互作用的因素。...

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我们介绍了在小鼠疫苗接种模型中，利用纳米颗粒免疫后，通过整体动物成像和基于流式细胞术的技术来监测抗原特异性CD8+...

纳米颗粒疫苗接种后抗原特异性CD8+ T细胞应答的全动物成像与流式细胞术分析技术

本文介绍了一种共免疫沉淀及磁珠上酶活性检测的实验方案，可同时研究质膜受体特定蛋白结构域在酶募集和酶活性中的作用。...

研究受体与酶之间功能相互作用的共免疫沉淀实验

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采用一种用于基于微球的多重检测的流式分析系统，该系统提供双报告信号读出，用于开发多重血清学和抗体中和检测方法，可同时检测SARS-CoV-2的中和性IgG和IgM抗体。...

一种用于多重微球流式分析系统的快速、多重双报告基因IgG和IgM SARS-CoV-2中和检测方法

本方案描述了一种利用表面等离子共振技术检测PD-1/PD-L1抑制剂的阻断实验。该方法采用两步固定策略和定制的缓冲体系，精确测量响应单位，从而便于评估化合物或生物制剂的阻断率。此外，该方法还支持对PD-1/PD-L1抑制剂进行高通量筛选。...

利用表面等离子共振技术鉴定PD-1/PD-L1抑制剂

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利用触印细胞学技术从临床病理标本中简单快速获取高质量肿瘤DNA的方法

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