基于GMP级可溶性多孔微载体的大规模细胞生产

过去二十年间，细胞与基因治疗行业经历了指数级扩张。然而，在实验室研究与工业化规模生产之间仍存在巨大的技术鸿沟。为符合监管政策要求，并满足细胞与基因治疗（CGT）行业对绿色生产的需要，自动化封闭系统已被广泛采用以生产细胞治疗产品。

对于贴壁细胞，使用微载体在可放大的搅拌罐式生物反应器中进行培养是一种有前景的方法。然而，传统的商业化微载体存在不足之处。通过胰酶消化收获细胞并利用尺寸筛分去除微载体的方法不仅效率低下且操作困难，还会影响细胞质量并引发安全性问题。

本研究中，我们基于符合GMP标准的3D TableTrix可溶性微载体，在自动化且封闭的系统中成功实现了大规模细胞生产。在九天内通过两阶段扩增获得了超过110亿个人源间充质干细胞。我们还展示了HEK293T细胞和Vero细胞的高密度培养，两种细胞的密度均达到每毫升一千万个以上。

这种先进的生物制造平台能够以自动化且封闭的方式有效地扩增和完全收获贴壁细胞。我们的方案为提高CGT产品工业化生产中的生产效率和优化质量控制提供了机会。首先，使用生物反应器控制器对pH探针进行两点校准。

然后组装生物反应器罐体，根据制造商的说明将不锈钢管、搅拌桨等部件安装到顶板上。按照制造商的指导，将即用型培养一次性耗材套件连接至顶板上相应的不锈钢部件、管道和接口处。罐体组装完成后，依照制造商说明对组装完整的罐体进行气密性检测。

将装有耗材套件的容器在15 PSI、121摄氏度条件下高压灭菌60分钟。待容器冷却至室温后，将温度探头插入温度探头管中，并将控制器上的监测仪、pH探头和溶氧探头的电缆分别连接至容器对应的部件。将加热垫紧密缠绕在容器外壁。

登录生物反应器控制器的系统，并根据制造商的说明将参数输入系统。将培养基瓶上的出口管与装有10克预灭菌W01微载体用于MSC的瓶子上的C-flex进液管焊接连接。从储液袋中将500毫升培养基泵入W01微载体瓶中。

从搅拌罐式生物反应器容器中，停止温度、pH 和溶氧控制，暂时关闭生物反应器控制器，并将容器中的全部 PBS 完全排入废液瓶中。将一次性过滤模块焊接至 10 升一次性储液袋的接口上。过滤并将完全无血清的 MSC 培养基转移至储液袋中。

将PUMP1的转速设置为300 RPM，并从进料袋向反应器中泵入一升培养基。停止泵运行，然后按照制造商的说明重新启动温度、pH值和溶解氧（DO）的监测。密封并断开连接进料袋与进料管的管路。

将分散的微载体瓶上的管子与进料管焊接，然后将瓶中的全部内容物泵入反应容器中。接着，用无血清培养基重悬2.5 × 10⁸个hMSCs，并转移至之前盛有微载体悬浮液的空瓶中。向瓶中添加无血清培养基，使总体积达到500 mL，并混匀细胞悬液。

将瓶中的全部内容物泵入容器中。密封后断开连接瓶与进料管的管路，然后将进料袋重新焊接回去。调节控制器上的搅拌参数，启动细胞接种至微载体的过程。

建立自动化的培养基补充和换液程序。将一次性取样袋焊接在取样管上，并在预定的时间点收集样品。在细胞收获时，于控制器上将搅拌速度设为零，使微载体沉降，随后将上清液转移至补料程序中，保留约一升的培养悬液在反应器内。

将含有50毫升新鲜配制的消化液的袋子与500毫升HBSS连接进行稀释，并通过进料管将全部溶液泵入反应容器中。设定搅拌速度为40至45 RPM，以溶解微载体。待微载体在40至60分钟内完全溶解后，将一次性三升储存袋连接至收获管，并将细胞悬液完全泵出。

在细胞收获期间启动细胞处理系统，并根据制造商的说明将一次性细胞处理试剂盒安装到仪器上。将细胞悬液袋、洗涤缓冲液袋和培养基袋焊接至试剂盒。输入操作参数，然后启动自动洗涤和重悬过程。

根据细胞处理系统指示，从离心室收集细胞样品用于细胞密度计算。计数后，使用完全无血清培养基将细胞密度重新调整至每毫升2 × 10⁶个细胞。在15升生物反应器中进行细胞配制时，使用配制缓冲液重悬收获的细胞。

将重悬的细胞250毫升焊接至细胞灌装系统。将一次性灌装与完成耗材套件安装到细胞灌装系统上，并在细胞重悬前，按照制造商说明开启预冷却系统。根据系统操作说明，设置每袋灌装30毫升，每组共20袋。

将新的一组20个冷冻保存袋焊接至一次性填充与完成耗材套件，并重复填充与完成操作，直至所有细胞分装完毕。对于人源间充质干细胞（hMSCs），累计实现了128倍的扩增，细胞活力保持在90%以上。葡萄糖摄取量与细胞扩增呈负相关，表明其代谢特征与健康细胞生长相关。 freshly harvested MSCs 保留典型的表型标志物，阳性标志物表达率超过95%，阴性标志物表达率低于2%。

冻存细胞在解冻并重新接种至二维培养瓶后，表现出良好的贴附性、正常的扩增能力以及典型的纺锤形形态和螺旋状生长。此外，这些细胞仍保持向成骨、成脂和成软骨谱系分化的能力。该平台也可用于培养其他贴壁依赖性细胞，例如 HEK293T 和 Vero 细胞。

在15升生物反应器中完成微珠到微珠的转移过程后，HEK293T细胞达到的最高细胞浓度为1.68 × 10⁷ 个细胞/毫升，而Vero细胞的浓度达到1.08 × 10⁷ 个细胞/毫升。两种细胞类型均保持了较高的活力。