Name: 基于GMP级可溶性多孔微载体的大规模电池生产 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: 了解基于GMP级可溶性多孔微载体的大规模贴壁细胞生产技术。本方法采用全封闭自动化系统培养人间充质干细胞、HEK293T和Vero细胞，实现高效收获并满足细胞与基因治疗行业的质量与规模需求。

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本工作受到国家杰出青年科学基金（82125018）的资助。

Closed System Production of Adherent Cells Based on Dissolvable Microcarriers

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Y.D. 是科学顾问，H.X.、Y.Z.、L.G.、M.L.、Y.Y.、W.L. 和 X.Y. 是北京赛诺 Nich Biotechnology Co. Ltd. 的员工。其他作者对本文所述产品或公司无任何商业、所有权或财务利益。其余所有作者声明不存在竞争性利益。

免疫治疗和干细胞治疗均使用活细胞作为药物；然而，其最终产品不应像小分子或病毒那样进行纯化或灭菌。因此，在细胞生产过程中的化学制造与控制（CMC）环节，必须始终牢记并切实应用质量源于设计（QbD）原则。23一个完全封闭的细胞培养系统，以及相应的处理系统和灌装系统，优先被考虑用于满足相关要求。本研究中，我们介绍了一种利用基于GMP级可溶性多孔三维微载体的ACISCP平台进行hMSCs两级扩增的操作方案。一些研究人员已探索了使用生物反应器结合微载体扩增hMSCs的可行性。 体外，但大多数已报道的研究表明，规模扩大将导致hMSC产量下降，从6.1 × 105 细胞/mL，甚至12.5 × 105 细胞/mL，在100 mL工作体积中至2.7 × 105 2 L 工作体积中每毫升细胞数24,25,26尽管搅拌罐式生物反应器具有最高的...

过去二十年间，细胞与基因治疗（CGT）产业经历了指数级扩张。下一代药物的研发有望治疗并治愈多种难治性疾病1。自2017年首个获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准的CGT产品Kymriah问世以来，全球CGT相关的研究与开发持续快速发展，FDA收到的CGT类新药临床试验申请数量在2018年已增至500项2。据预测，到2030年，美国获批的CGT产品数量可能达到54至74种2。
尽管细胞与基因治疗（CGT）领域的研究与创新进展迅速令人振奋，但在实验室研究与能够以可承受的成本将这些有前景的药物提供给尽可能多患者的工业化规模生产之间，仍存在巨大的技术鸿沟。目前用于临床试验的工艺是在实验室中为小规模实验建立的，要实现CGT制造的改进与创新仍需付出巨大努力3。CGT产品种类繁多，其中大多数基于活细胞，包括同种异体、自体、工程化或天然细胞。这些活体药物比小分子药物或生物制剂复杂得多，因此大规模制造面临重大挑战4,5,6。在本研究中，我们展示了一种适用于三种广泛应用于CGT领域的贴壁依赖性细胞的大规模细胞生产方案。这些细胞包括已被用于细胞治疗的人类间充质干细胞/基质细胞（hMSCs），以及用于生产最终治疗用细胞产品所需病毒的HEK293T细胞和Vero细胞。贴壁依赖性细胞通常在平面培养系统中进行培养，该过程需要人工操作。然而，人工培养方法劳动强度大，且易受污染，可能影响终产品的质量。此外，缺乏在线过程控制，导致不同批次间产品质量存在显著差异7。以干细胞治疗为例，目前有超过200种干细胞治疗候选产品正处于研发管线中，据估计，为满足临床应用需求，每年需要约300万亿个hMSCs8。因此，实现治疗性细胞的大规模制造已成为满足如此高细胞需求的治疗干预的前提条件9。
为克服平面培养系统的局限性，研究人员已致力于开发基于传统不可溶微载体的搅拌式生物反应器大规模生产工艺。10,11,12,13但这些方法存在制备步骤复杂和细胞收获效率低的问题14最近，我们创新性地开发了一种可溶解的微载体用于干细胞扩增，旨在克服从传统不可溶解的商用微载体中收获细胞所面临的挑战。15这种新型的、市售的符合药品生产质量管理规范（GMP）标准的三维可溶性多孔微载体3D TableTrix，在大规模细胞生产中展现出巨大潜力。事实上，基于此类多孔微载体的三维培养体系有望重建有利于细胞黏附、增殖、迁移和活化的仿生微环境16微载体的多孔结构和相互连通的孔隙网络可提供更大的细胞黏附面积，并促进氧气、营养物质和代谢产物的交换，从而为细胞生长创造理想的基质 体外 细胞扩增17这些符合GMP标准的三维可溶多孔微载体具有高孔隙率，可实现人源间充质干细胞（hMSCs）的大规模扩增，且微载体可完全溶解的特性有助于高效收获扩增后的细胞。18它也是一种GMP级产品，并已在中国药品审评中心注册为药用辅料（备案号：F20210000003 和 F20200000496）19 美国食品药品监督管理局（FDA，USA；药品主文件编号：35481）20.
本文展示了利用可分散且可溶解的多孔微载体，在自动化封闭式工业级细胞生产（ACISCP）系统18中进行人源间充质干细胞（hMSC）、HEK293T细胞和Vero细胞扩增的方法。我们成功实现了hMSC的两级扩增（在9天内累计扩增128倍），从5 L生物反应器扩增至15 L生物反应器，最终单批次获得高达1.1 × 1010个hMSC。细胞通过完全溶解微载体释放后，利用基于连续流离心的细胞处理系统进行浓缩、洗涤和制剂制备，再通过细胞分装系统进行分装。此外，我们对hMSC产品的质量进行了评估以确认其符合相关标准。我们还展示了此类可溶解微载体在另外两种广泛应用于细胞与基因治疗（CGT）产业的贴壁细胞——HEK293T细胞和Vero细胞——规模化生产中的应用。HEK293T细胞的峰值细胞密度达到1.68 × 107 个细胞/mL，Vero细胞的峰值密度达到1.08 × 107 个细胞/mL。该ACISCP系统可适用于多种贴壁细胞的培养，有望成为推动CGT产业化的有力平台。

<table><tbody><tr><td>0.25% 胰蛋白酶 EDTA</td><td>基础培养基</td><td>S310JV</td><td>用于二维细胞收获。</td></tr><tr><td>3D FloTrix 消化法</td><td>赛诺菲克生物技术</td><td>R001-500</td><td>这是一种可特异性溶解3D TableTrix微载体的试剂。</td></tr><tr><td>3D FloTrix MSC 无血清培养基</td><td>赛微 nich 生物科技</td><td>RMZ112</td><td>这是一种无血清、无动物成分的培养基，用于间充质干细胞在二维平面培养以及基于3D TableTrix微载体的三维培养中的扩增与维持。</td></tr><tr><td>3D FloTrix一次性过滤模块</td><td>赛微 nich 生物科技</td><td>R020-00-10</td><td>该模块包含 0.22 &amp;mu;用于培养基和消化液过滤的 m capsule 滤器。</td></tr><tr><td>3D FloTrix一次性使用储存袋（10 L）</td><td>赛诺 Nich 生物科技</td><td>R020-00-03</td><td>用作5 L生物反应器的进料袋。</td></tr><tr><td>3D FloTrix一次性使用储存袋（3 L）</td><td>赛微 nich 生物科技</td><td>R020-00-01</td><td>用作细胞接种或转移袋。</td></tr><tr><td>3D FloTrix一次性使用储存袋（50 L）</td><td>赛诺 Nich 生物科技</td><td>R020-00-04</td><td>用作15 L生物反应器的进料袋。</td></tr><tr><td>3D FloTrix vivaPACK 一次性填充包&amp;amp;Finish 消耗品套装</td><td>赛微 nich 生物科技</td><td>PACK-01-01</td><td>这是一种适用于3D vivaPACK灌装与完成系统的标准试剂盒。</td></tr><tr><td>3D FloTrix vivaPACK 细胞分装与完成系统</td><td>赛微 nich 生物科技</td><td>vivaPACK</td><td>该系统为封闭式液体处理装置，具有自动混合和排气功能。重悬于冷冻保存液中的细胞可快速且均匀地分装至每批次20个袋子中。</td></tr><tr><td>3D FloTrix vivaPREP PLUS 细胞处理系统</td><td>赛微 nich 生物科技</td><td>vivaPREP PLUS</td><td>该系统是一种基于连续流离心机的装置，可在完全封闭的条件下对细胞进行浓缩、洗涤和重悬。</td></tr><tr><td>3D FloTrix vivaPREP PLUS 一次性细胞处理试剂盒</td><td>赛诺 Nich 生物科技</td><td>PREP-PLUS-00</td><td>这是一种适用于3D vivaPREP PLUS细胞处理的标准试剂盒。</td></tr><tr><td>3D FloTrix vivaSPIN&amp;nbsp; 15 L 生物反应器</td><td>赛微 nich 生物科技</td><td>FTVS15</td><td>该生物反应器产品采用控制器、15 L玻璃搅拌罐反应器及配套附件，并配有特殊的灌流管。</td></tr><tr><td>3D FloTrix vivaSPIN&amp;nbsp; 5 L 生物反应器</td><td>赛微 nich 生物科技</td><td>FTVS05</td><td>该生物反应器产品采用控制器、5 L 玻璃搅拌罐反应器及配套附件，并配有特殊的灌流管。</td></tr><tr><td>3D FloTrix vivaSPIN 封闭系统耗材包（10/15 L）</td><td>赛微 nich 生物科技</td><td>R020-10-10</td><td>这是一种适用于3D vivaSPIN 15 L生物反应器的标准管路套件，包含取样袋。</td></tr><tr><td>3D FloTrix vivaSPIN 封闭系统耗材包（2/5 L）</td><td>赛微 nich 生物科技</td><td>R020-05-10</td><td>这是一种适用于3D vivaSPIN 5 L生物反应器的标准管路套件，包含取样袋。</td></tr><tr><td>3D TableTrix 微载体 G02</td><td>赛微 nich 生物科技</td><td>G02-10-10g</td><td>这些多孔且可降解的微载体适用于HEK293T细胞培养。产品以10 g/瓶的规格提供，已预先灭菌，并配有C-Flex管路，可用于与生物反应器的管道焊接。</td></tr><tr><td>3D TableTrix 微载体 V01</td><td>赛微 nich 生物科技</td><td>V01-100-10g</td><td>这些多孔且可降解的微载体适用于贴壁细胞培养，以非无菌形式提供，使用前需在磷酸盐缓冲液（PBS）中进行高压灭菌。它们特别适用于疫苗生产。</td></tr><tr><td>3D TableTrix 微载体 W01</td><td>赛诺 Nichi 生物科技</td><td>W01-10-10g（一次性包装）；&lt;br/&gt; W01-200（片剂）</td><td>这些多孔且可降解的微载体适用于贴壁细胞培养，尤其适用于需要收获作为终产物的细胞。产品以每瓶10克、预灭菌形式提供，并配有C-Flex管路，可用于与生物反应器的管道焊接。该产品已获得中国药品审评中心（CDE）两项药用辅料资质，注册号为[F20200000496；F20210000003]。同时已获得美国食品药品监督管理局（FDA）药用辅料DMF资质，注册号为[DMF:35481]。</td></tr><tr><td>APC 抗人 CD45 抗体</td><td>BioLegend</td><td>368512</td><td>用于间充质干细胞身份鉴定的流式细胞术</td></tr><tr><td>Calcein-AM/PI 双重染色试剂盒</td><td>Dojindo</td><td>C542</td><td>Calcein-AM/PI 双染试剂盒用于活细胞和死细胞的同步荧光染色。该试剂盒包含 Calcein-AM 溶液和碘化丙啶（PI）溶液，分别用于染色活细胞和死细胞。</td></tr><tr><td>NALGENE 容器（500 mL）用 EZ Top 容器盖（50 个装）</td><td>圣戈班</td><td>CAP-38</td><td>品牌和目录编号仅作示例，类似产品可由不同供应商提供，只要功能相同，即可使用其他品牌的产品替代。</td></tr><tr><td>C-Flex 管路，配方 374（0.25 英寸 × 0.44 英寸）</td><td>圣戈班</td><td>374-250-3</td><td>用于管道焊接和断开。</td></tr><tr><td>CryoMACS 冻存袋 50</td><td>Miltenyi Biotec&amp;nbsp;</td><td>200-074-400</td><td>用于扩增 3D FloTrix vivaPACK 一次性填充&amp;amp;Finish 消耗品套装</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D2650-100mL</td><td>用于制备冻存溶液。</td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>基础培养基</td><td>L120KJ</td><td>用于HEK293T细胞和Vero细胞的培养。</td></tr><tr><td>DURAN 原装 GL 45 实验室瓶（2 L）</td><td>DWK生命科学</td><td>218016357</td><td>用于收集5 L生物反应器的废弃物。</td></tr><tr><td>DURAN 原装 GL 45 实验室瓶（5 L）</td><td>DWK生命科学</td><td>218017353</td><td>用于收集15 L生物反应器的废弃物。</td></tr><tr><td>DURAN 原装 GL 45 实验室瓶（500 mL）</td><td>DWK生命科学</td><td>218014459</td><td>用于0.1 M NaOH补充瓶。</td></tr><tr><td>NALGENE 容器（500 mL）用 EZ Top 容器密封盖</td><td>Saint-Gobain</td><td>EZ500 ML-38-2</td><td>品牌和目录编号仅作示例，类似产品可由不同供应商提供，只要功能相同，即可使用其他品牌替代。</td></tr><tr><td>优质胎牛血清（FBS）</td><td>Wisent</td><td>086-150</td><td>用于HEK293T细胞的培养。</td></tr><tr><td>FITC 标记抗人 CD14 抗体</td><td>BioLegend</td><td>301804</td><td>用于间充质干细胞身份鉴定的流式细胞术。</td></tr><tr><td>FITC 标记的抗人 CD34 抗体</td><td>BioLegend</td><td>343504</td><td>用于间充质干细胞身份鉴定的流式细胞术。</td></tr><tr><td>FITC 标记的抗人 CD90（Thy1）抗体</td><td>BioLegend</td><td>328108</td><td>用于间充质干细胞身份鉴定的流式细胞术。</td></tr><tr><td>流式细胞术</td><td>贝克曼库尔特</td><td>CytoFLEX</td><td>用于细胞身份鉴定。</td></tr><tr><td>荧光细胞分析仪</td><td>生命科学</td><td>Countstar Rigel S2</td><td>用于细胞计数。细胞活力可通过AO/PI染料染色计算。</td></tr><tr><td>GL 45 多端口连接螺旋盖，带2个端口&amp;nbsp;</td><td>DWK生命科学</td><td>292632806</td><td>品牌和目录编号仅作示例，类似产品可由不同供应商提供，只要功能相同，即可使用其他品牌的产品替代。</td></tr><tr><td>葡萄糖检测仪</td><td>三诺生物</td><td>6243578</td><td>用于检测细胞培养基和上清液中的葡萄糖浓度。</td></tr><tr><td>含钙和镁的汉克平衡盐溶液（HBSS）</td><td>Gibco</td><td>14025092</td><td>用于消化液的配制。</td></tr><tr><td>20% 白蛋白（贝林）（HSA）</td><td>CSL Behring</td><td>N/A</td><td>用于配制洗涤缓冲液。</td></tr><tr><td>倒置荧光显微镜</td><td>OLYMBUS</td><td>CKX53SF</td><td>用于明场和荧光观察及成像。</td></tr><tr><td>Nalgene 量筒（500 mL）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>3662-0500PK</td><td>用于校准蠕动泵的液体处理体积速度。</td></tr><tr><td>新生牛血清（NBS）超细级</td><td>MINHAI BIO</td><td>SC101.02</td><td>用于Vero细胞的培养。</td></tr><tr><td>OriCell 人源间充质干细胞成脂分化与鉴定试剂盒</td><td>Cyagen</td><td>HUXUC-90031</td><td>用于hUCMSCs的三系分化。</td></tr><tr><td>OriCell 人源间充质干细胞软骨分化与鉴定试剂盒</td><td>Cyagen</td><td>HUXUC-90041</td><td>用于hUCMSCs的三系分化。</td></tr><tr><td>OriCell 人骨髓间充质干细胞成骨分化与鉴定试剂盒</td><td>Cyagen</td><td>HUXUC-90021</td><td>用于hUCMSCs的三系分化。</td></tr><tr><td>PE 抗人 CD105 抗体</td><td>BioLegend</td><td>800504</td><td>用于间充质干细胞身份鉴定的流式细胞术。</td></tr><tr><td>PE 抗人 CD19 抗体</td><td>BioLegend</td><td>302208</td><td>用于间充质干细胞身份鉴定的流式细胞术。</td></tr><tr><td>PE 抗人 CD73（胞外-5'-核苷酸酶）抗体</td><td>BioLegend</td><td>344004</td><td>用于间充质干细胞身份鉴定的流式细胞术。</td></tr><tr><td>PE 抗人 HLA-DR 抗体</td><td>BioLegend</td><td>307605</td><td>用于间充质干细胞身份鉴定的流式细胞术。</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Wisent</td><td>311-010-CL</td><td>用于玻璃容器和V01微载体的高压灭菌以及培养基的更换。</td></tr><tr><td>Sani-Tech 铂金固化卫生级硅胶管（0.13 英寸 × 0.25 英寸）</td><td>圣戈班</td><td>ULTRA-C-125-2F</td><td>用于由蠕动泵驱动的溶液转移。</td></tr><tr><td>无菌生理盐水</td><td>Hopebiol</td><td>HBPP008-500</td><td>用于配制洗涤缓冲液。</td></tr><tr><td>Trypzyme 重组胰蛋白酶</td><td>基础培养基</td><td>S342JV</td><td>该试剂用于HEK293T细胞和Vero细胞的微珠间转移。</td></tr><tr><td>管路封口机</td><td>英奇生物技术</td><td>Tube Sealer I</td><td>该封口机与C-Flex管路和PVC管路均兼容。</td></tr><tr><td>用于PVC管路的管路焊接仪</td><td>楚生物技术</td><td>Tube Welder Micro I</td><td>用于聚氯乙烯管路的焊接。</td></tr><tr><td>用于TPE管路的管路焊接机</td><td>英奇生物技术</td><td>管式焊接仪 I-V2</td><td>用于TPE管路的焊接。</td></tr><tr><td>ViaStain AO / PI 活性染色试剂</td><td>Nexcelom</td><td>CS2-0106-25mL</td><td>双荧光活力检测法，使用吖啶橙（AO）和碘化丙啶（PI），是针对含有碎片的样本中PBMCs及干细胞等原代细胞进行准确活力分析的推荐方法。</td></tr></tbody></table>

基于gmp级可溶性多孔微载体的大规模细胞生产

Large-Scale Cell Production Based on GMP-Grade Dissolvable Porous Microcarriers

细胞与基因治疗（CGT）领域的研究人员长期以来一直面临细胞高效、大规模扩增的重大挑战。为克服二维（2D）平面培养系统的固有缺陷，我们创新性地开发了一种基于GMP级可溶性多孔微载体的自动化封闭式工业化细胞生产（ACISCP）平台，用于贴壁细胞的三维（3D）培养，包括人源间充质干细胞/基质细胞（hMSCs）、HEK293T细胞和Vero细胞。为实现大规模扩增，采用5 L和15 L搅拌罐式生物反应器进行两阶段扩增，在9天内获得1.1 × 1010个hMSCs，总体扩增倍数达128倍。通过完全溶解微载体收获细胞，并利用基于连续流离心的细胞处理系统进行浓缩、洗涤和制剂，随后由细胞分装系统进行分装。与2D平面培养相比，从3D培养中收获的hMSCs在质量上无显著差异。我们还将此类可溶性多孔微载体应用于CGT领域其他常用细胞类型；具体而言，HEK293T细胞和Vero细胞的峰值细胞密度分别达到1.68 × 107 个细胞/mL和1.08 × 107 个细胞/mL。本研究提供了一套利用生物工艺工程平台的方案，该平台结合GMP级可溶性微载体的特性与先进的封闭式设备，实现贴壁细胞的工业化规模生产。

ACISCP 平台是一个完全封闭的系统，采用一系列搅拌罐式生物反应器进行规模扩增，配备细胞处理系统用于自动化收获和配制细胞，以及细胞灌装系统（图1）。贴壁细胞附着在多孔微载体上，微载体可分散于生物反应器中，从而实现贴壁细胞的悬浮培养。
按照所述方案，首先将 2.5 × 108 个 hMSCs 与 10 g W01 微载体接种于 5 L 搅拌式生物反应器中进行初始扩增。在第 4 天，通过细胞处理系统浓缩并洗涤细胞，共获得约 2.9 × 109 个细胞，其中 1.0 × 109 个收获的细胞被传代至含 40 g W01 微载体的 15 L 搅拌式生物反应器中，进入第二阶段培养。最终，在第 9 天收获了 1.1 × 1010 个 MSCs，并将其配制成制剂，分装至 70 多个制剂袋中（图 2A）。每日监测细胞数量、活力及葡萄糖消耗情况（图 2...

本文介绍了一种基于符合GMP标准的可溶性微载体的全封闭系统，用于实现贴壁细胞的大规模生产。该方法已验证可用于人源间充质干细胞、HEK293T细胞和Vero细胞的培养，其产量和质量均满足细胞与基因治疗产业的要求。

基于GMP级可溶性多孔微载体的大规模细胞生产

细胞与基因治疗（CGT）领域的研究人员长期以来一直面临细胞高效、大规模扩增的重大挑战。为了……

过去二十年间，细胞与基因治疗行业经历了指数级扩张。然而，在实验室研究与工业化规模生产之间仍存在巨大的技术鸿沟。为符合监管政策要求，并满足细胞与基因治疗（CGT）行业对绿色生产的需要，自动化封闭系统已被广泛采用以生产细胞治疗产品。对于贴壁细胞，使用微载体在可放大的搅拌罐式生物反应器中进行培养是一种有前景的方法。然而，传统的商业化微载体存在不足之处。通过胰酶消化收获细胞并利用尺寸筛分去除微载体的方法不仅效率低下且操作困难，还会影响细胞质量并引发安全性问题。本研究中，我们基于符合GMP标准的3D TableTrix可溶性微载体，在自动化且封闭的系统中成功实现了大规模细胞生产。在九天内通过两阶段扩增获得了超过110亿个人源间充质干细胞。我们还展示了HEK293T细胞和Vero细胞的高密度培养，两种细胞的密度均达到每毫升一千万个以上。这种先进的生物制造平台能够以自动化且封闭的方式有效地扩增和完全收获贴壁细胞。我们的方案为提高CGT产品工业化生产中的生产效率和优化质量控制提供了机会。首先，使用生物反应器控制器对pH探针进行两点校准。然后组装生物反应器罐体，根据制造商的说明将不锈钢管、搅拌桨等部件安装到顶板上。按照制造商的指导，将即用型培养一次性耗材套件连接至顶板上相应的不锈钢部件、管道和接口处。罐体组装完成后，依照制造商说明对组装完整的罐体进行气密性检测。将装有耗材套件的容器在15 PSI、121摄氏度条件下高压灭菌60分钟。待容器冷却至室温后，将温度探头插入温度探头管中，并将控制器上的监测仪、pH探头和溶氧探头的电缆分别连接至容器对应的部件。将加热垫紧密缠绕在容器外壁。登录生物反应器控制器的系统，并根据制造商的说明将参数输入系统。将培养基瓶上的出口管与装有10克预灭菌W01微载体用于MSC的瓶子上的C-flex进液管焊接连接。从储液袋中将500毫升培养基泵入W01微载体瓶中。从搅拌罐式生物反应器容器中，停止温度、pH 和溶氧控制，暂时关闭生物反应器控制器，并将容器中的全部 PBS 完全排入废液瓶中。将一次性过滤模块焊接至 10 升一次性储液袋的接口上。过滤并将完全无血清的 MSC 培养基转移至储液袋中。将PUMP1的转速设置为300 RPM，并从进料袋向反应器中泵入一升培养基。停止泵运行，然后按照制造商的说明重新启动温度、pH值和溶解氧（DO）的监测。密封并断开连接进料袋与进料管的管路。将分散的微载体瓶上的管子与进料管焊接，然后将瓶中的全部内容物泵入反应容器中。接着，用无血清培养基重悬2.5 × 10⁸个hMSCs，并转移至之前盛有微载体悬浮液的空瓶中。向瓶中添加无血清培养基，使总体积达到500 mL，并混匀细胞悬液。将瓶中的全部内容物泵入容器中。密封后断开连接瓶与进料管的管路，然后将进料袋重新焊接回去。调节控制器上的搅拌参数，启动细胞接种至微载体的过程。建立自动化的培养基补充和换液程序。将一次性取样袋焊接在取样管上，并在预定的时间点收集样品。在细胞收获时，于控制器上将搅拌速度设为零，使微载体沉降，随后将上清液转移至补料程序中，保留约一升的培养悬液在反应器内。将含有50毫升新鲜配制的消化液的袋子与500毫升HBSS连接进行稀释，并通过进料管将全部溶液泵入反应容器中。设定搅拌速度为40至45 RPM，以溶解微载体。待微载体在40至60分钟内完全溶解后，将一次性三升储存袋连接至收获管，并将细胞悬液完全泵出。在细胞收获期间启动细胞处理系统，并根据制造商的说明将一次性细胞处理试剂盒安装到仪器上。将细胞悬液袋、洗涤缓冲液袋和培养基袋焊接至试剂盒。输入操作参数，然后启动自动洗涤和重悬过程。根据细胞处理系统指示，从离心室收集细胞样品用于细胞密度计算。计数后，使用完全无血清培养基将细胞密度重新调整至每毫升2 × 10⁶个细胞。在15升生物反应器中进行细胞配制时，使用配制缓冲液重悬收获的细胞。将重悬的细胞250毫升焊接至细胞灌装系统。将一次性灌装与完成耗材套件安装到细胞灌装系统上，并在细胞重悬前，按照制造商说明开启预冷却系统。根据系统操作说明，设置每袋灌装30毫升，每组共20袋。将新的一组20个冷冻保存袋焊接至一次性填充与完成耗材套件，并重复填充与完成操作，直至所有细胞分装完毕。对于人源间充质干细胞（hMSCs），累计实现了128倍的扩增，细胞活力保持在90%以上。葡萄糖摄取量与细胞扩增呈负相关，表明其代谢特征与健康细胞生长相关。 freshly harvested MSCs 保留典型的表型标志物，阳性标志物表达率超过95%，阴性标志物表达率低于2%。冻存细胞在解冻并重新接种至二维培养瓶后，表现出良好的贴附性、正常的扩增能力以及典型的纺锤形形态和螺旋状生长。此外，这些细胞仍保持向成骨、成脂和成软骨谱系分化的能力。该平台也可用于培养其他贴壁依赖性细胞，例如 HEK293T 和 Vero 细胞。在15升生物反应器中完成微珠到微珠的转移过程后，HEK293T细胞达到的最高细胞浓度为1.68 × 10⁷ 个细胞/毫升，而Vero细胞的浓度达到1.08 × 10⁷ 个细胞/毫升。两种细胞类型均保持了较高的活力。

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高通量单细胞与多细胞微封装

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用于细胞扩增的重组胶原蛋白I肽微载体及其在生物反应器模型中作为细胞递送系统的潜在应用

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实验室规模的合成蜘蛛丝生产

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