使用光刺激网格绘制光遗传学蛋白的细胞分布图

我们的实验室研究环磷酸腺苷（cyclic AMP）在时空上的调控机制，以了解哪些条件会触发特定的下游事件。为了有效模拟细胞内亚细胞区域中环磷酸腺苷信号的激活与抑制，我们对一种名为bPAC-nanoluciferase的光遗传学工具的分布特性进行表征。为了验证当前环磷酸腺苷信号传导模型的有效性，我们开发了可在活细胞的亚细胞区室中评估、模拟和阻断环磷酸腺苷信号传导的工具。

本方案可用于系统性地刺激并评估光遗传学工具的分布与功能。我们的目标是验证聚焦光处理是否能够精确激活特定细胞区域内的光遗传学蛋白，从而避免对周围蛋白产生影响。该方法对于研究分布广泛的蛋白，或旨在产生环磷酸腺苷（cAMP）或其他信号分子局部增加效应的情况具有重要意义。

在光遗传学实验中，通常的做法是刺激整个细胞区域，有时也会刺激较小的特定区域。然而，该区域和刺激强度的选择往往具有随意性。我们的系统性方法能够帮助研究人员开展更精确的实验，有助于模拟信号通路的活动模式。

本研究中，使用共转染了核靶向cAMP传感器和光遗传学核靶向蛋白NLS-bPAC-nanoluciferase的细胞。在黑暗环境中培养和操作表达核定位bPAC的细胞。使用红光安全灯，以避免暴露于波长小于500纳米的光线。

在配备多LED光源、发射滤光轮、电动XY载物台、ORCA-Fusion数字CMOS相机以及100倍油镜（数值孔径为1.4）的电动双层显微镜上进行成像实验。使用数字显微成像软件采集图像。该系统可通过配备ZT458rdc二向色滤光片的独立光路，同时实现对细胞的刺激和FRET检测。

打开UGA-42地质系统和LDI-7激光器后，启动显微镜并将其正确设置，以配合H208 FRET传感器进行数据采集。随后依次打开成像软件和控制显微镜的SysCon软件。每次使用前需对系统进行校准，进入Camera窗口并选择Calibration标签页。

设置与光遗传学蛋白相匹配的激光波长。选择 445 纳米以刺激 bPAC-nanoluciferase。点击“相机”选项卡，然后单击“开始采集”，以启动成像软件中的图像采集。

再次选择校准选项卡。单击开始校准按钮。在出现的下拉列表中，选择正确的校准模式。

按照制造商提供的校准步骤进行操作。如有需要，调整成像软件设置以完成正确的校准。确保在样品中无细胞的区域进行校准。

接下来，使用成像软件采集一张荧光图像。荧光细胞将显示在图像查看器窗口中。利用显微镜的 XY 控制装置，将待刺激的细胞移至影响区域内部，最好位于其中心位置。

在开始实际实验之前，使用“点击即激发”模式快速评估单个细胞的反应性。在时间轴窗口中，调整细胞刺激参数，包括光源、刺激持续时间和强度。在图像查看器窗口中，大致点击细胞的中心位置，并评估其反应。

在图像查看器窗口中，选择左侧工具栏中的圆形图标，在下拉菜单中点击“Filled”，以绘制实心圆形刺激对象。重复此步骤，创建多个相同的圆形，并将其均匀分布，确保完全均一地覆盖待刺激细胞的整个细胞质。在图像查看器窗口中，点击左侧的鼠标指针图标，然后右键单击其中一个刺激对象，以查看并编辑其属性。

或者，选择所有已绘制的刺激对象，然后右键单击以同时编辑所有选定刺激对象的属性。在“视图”子窗口中，单击“对齐网格”按钮。该网格有助于保持圆形之间的均匀间距和对齐，从而形成规则的矩阵或阵列。

此外，使用“设置网格”按钮自定义网格属性。借助网格将刺激对象均匀分布。如有必要，可添加更多刺激对象以覆盖整个细胞。

确保所有对象具有相同的属性。在图像查看器窗口中先前创建的每个刺激对象都将在时间轴窗口中显示，用户可在其中编辑一组不同的属性，包括开始时间、持续时间、延迟、强度等。为了正确显示刺激对象，首先应展开时间轴窗口。

现在可以在时间轴窗口中查看刺激对象的时间特性。选择所有刺激对象，并在“对象时序”子窗口中编辑其延迟时间和持续时间。在“光源”子窗口中，设置对象的波长和强度。

确保所有刺激参数的波长和强度相同。为避免两种或多种刺激效应相互叠加，请为每个刺激对象设置不同的起始时间，或根据预期结果调整它们之间的延迟时间。接下来，如有需要，可在时间轴窗口中更改各刺激对象的激活顺序。

根据实验需求，将刺激序列设置为规律或随机模式。将序列上传至系统后，在“序列”子窗口中配置系统将执行的序列循环次数或运行次数。为测量受刺激细胞的荧光变化，需在成像软件中于目标位置放置感兴趣区域。

开始采集荧光图像。最后，在UGA-42窗口中点击播放以启动细胞刺激。观察实际的刺激光束（也可被相机捕获）及其与刺激对象的相关性。

仅注意绿色轨迹强度的变化，该变化显示了传感器检测到的环磷酸腺苷浓度的增加。这种现象特异性地发生在光束到达细胞中bPAC-nanoluciferase含量最少的区域时。H208的YFP荧光用于确定细胞核的位置。

选取覆盖整个细胞核的感兴趣区域，用于测量在指定蓝色光点刺激下H208传感器FRET比率的变化。结果显示，环磷酸腺苷（cyclic AMP）的瞬时升高仅在蓝光照射含有bPAC-nanoluciferase的区域时发生。这证实了靶向细胞核的bPAC-nanoluciferase仅在HC-1细胞的细胞核区室中表达。