人外周淋巴细胞中γH2AX与53BP1的双重免疫荧光染色

本研究的目的是评估同时定量分析γH2AX和53BP1焦点在检测博来霉素诱导的人外周血淋巴细胞基因组损伤中的适用性。多种因素可导致DNA双链断裂。因此，细胞具备多种修复机制，其中涉及γH2AX和53结合蛋白1，二者可在双链断裂附近共定位。

采集全血样本后，将300微升样本加入含有4.7毫升完全培养基的离心管中。然后加入博来霉素硫酸盐，使其终浓度为每毫升5微克。每个样本均需设立阴性对照。

将试管置于37摄氏度的恒温器中孵育两小时。以540 ×g离心样品五分钟。然后向沉淀中加入五毫升低渗溶液。

然后加入 400 µL 预固定液以引起溶血。将样品在 540 ×g 下离心 5 分钟，随后将沉淀物重悬于 5 mL 甲醇中，在室温下固定至少 30 分钟。再次在 540 ×g 下离心 5 分钟，然后将沉淀物重悬于 5 mL 固定液中。

再重复此步骤一次。再次以 540 G 离心五分钟，然后吸除上清液，保留足够液体以重悬沉淀。将重悬的细胞沉淀滴加到载玻片上。

配制两种溶液，分别含有溶解于封闭液中的抗 Gamma H2AX 和抗 53BP1 一抗。然后将载玻片在 1× PBS 中洗涤两次。随后将载玻片置于封闭液中孵育 30 分钟。

向每张载玻片分别加入 10 微升含有溶解于封闭液中的两种一抗溶液。用封口膜覆盖载玻片。在 4 摄氏度下孵育过夜。

孵育结束后，在1× PBS中洗涤三次，每次五分钟。配制两种溶液，分别含有溶解于封闭液中的DyLight 488和Alexa Fluor 568二抗。然后向每张载玻片各加入10 µL上述两种含二抗的封闭液溶液。

用封口膜覆盖载玻片，并在室温下孵育两小时。第二次孵育结束后，用1× PBS缓冲液洗涤三次，每次五分钟。在盖玻片组装前，加入2.5 µL含DAPI的抗荧光淬灭剂溶液，以对细胞核进行复染。

为了评估焦点动力学，操作步骤与上述方法相同。最后阶段为焦点的观察与定量分析。图A、图B和图C分别显示了无Gamma H2AX和53BP1焦点的人类淋巴细胞，以及含有不同数量Gamma H2AX和53BP1焦点的人类淋巴细胞。

观察到焦点共定位水平较低。与预期一致，在未经处理的细胞中，Gamma H2AX 和 53BP1 焦点的共现频率非常高。此外，两种标记物的焦点数量之间也存在显著差异。

随着时间推移，γ-H2AX 和 53BP1 焦点的变化过程表现出不同的行为，尽管它们参与相同的功能。对 γ-H2AX 和 53BP1 焦点的分析能够评估细胞在暴露或病理条件下的应答反应。然而，γ-H2AX 和 53BP1 的双重免疫荧光染色可能导致低估事件的真实发生频率。