Name: 使用 CRISPR/Cas9 系统生成着丝粒相关蛋白- E CENP-E-/- 敲除细胞系 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: 了解使用CRISPR/Cas9系统在HeLa细胞中敲除CENP-E基因的优化筛选策略。该方法通过表型筛选和免疫荧光验证，为研究CENP-E抑制剂特异性和毒性提供了重要细胞模型。

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感谢福建医科大学细胞骨架实验室所有成员的有益讨论。感谢福建医科大学公共技术服务中⼼的林俊进、黄志宏、林玲、庞丽丽、周林英、林曦和吴敏霞提供的技术支持。感谢福建医科大学基础医学实验教学中心郑思怡、林颖和柯祺给予的支持。本研究得到以下基金资助：国家自然科学基金（项目编号 82001608 和 82101678）、中国福建省自然科学基金（项目编号 2019J05071）、中国福建省科技创新增量联合资金（项目编号 2021Y9160）以及福建医科大学高层次人才科研启动基金项目（项目编号 XRCZX2017025）。

1. CRISPR/Cas9 基因敲除载体的构建
<ol>
	<li>选择人类基因组DNA中的目标序列 CENP-E 基因（GenBank登录号 NM_001286734.2），并使用在线CRISPR设计工具（http://crispor.tefor.net/）设计sgRNA。</li>
	<li>输入一条基因组序列，选择“Homo sapiens人UCSC 2013年12月（hg38分析集）+单核苷酸多态性（SNPs）：dbSNP148”，并选择原间隔序列邻近基序“20 bp-NGG-spCas9”。根据特异性评分选择两条引导序列，包括sgRNA-1（5'-CGGCCGCACTCGCACGCAGA-3'）和sgRNA-2（5'-TTCTTTAGAGACGCGGGCTC-3'）50，预测效率10，且脱靶效应最小。</li>
	<li>订购并合成单链DNA寡核苷酸（ssODNs）。将ssODNs稀释于ddH₂O中。2O 至最终浓度 100 µM. 为了磷酸化并退火sgRNA寡核苷酸，添加 1 µL 正向引物， 1 µL 反转录引物， 0.5 µL T4 多核苷酸激酶 1 µL T4 多核苷酸激酶缓冲液，以及 6.5 µL 在聚合酶链式反应（PCR）管中加入无RNase水，并将该管置于 37 °C 30 分钟 95 °C 5 分钟；然后，逐渐降温至 25 °C 在 5 °C 分钟-1.</li>
	<li>使用 BbsI 酶切 pX458 质粒<img alt="静态平衡示意图，ΣFx=0，通过杠杆系统和力矢量演示平衡状态。" src="/files/ftp_upload/65476/65476eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 1"> 限制性内切酶。加入 1 µg pX458 质粒的 2 µL 10x 缓冲液 G 1 µL Bbs 的<img alt="静态平衡图，ΣFx=0，通过杠杆系统和力矢量演示平衡。" src="/files/ftp_upload/65476/65476eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 1">，并加入无RNase的ddH₂O2O 至 20 µL 在1.5 mL离心管中。将离心管置于指定条件下孵育 37 °C 孵育2小时。然后，按照试剂盒说明书，使用柱式DNA胶回收试剂盒纯化线性化质粒。</li>
	<li>将sgRNA寡核苷酸连接至pX458质粒（pSpCas9(BB)-2A-绿色荧光蛋白（GFP）质粒，Addgene编号 48138）中。添加 1 µL 退火的寡核苷酸，25 ng 线性质粒， 1 µL 10x T4 DNA 连接酶缓冲液 0.5 µL T4 DNA连接酶（350 U/µL) 并定容至 10 µL 用 ddH₂O2在1.5 mL离心管中。将连接反应液于 16 °C 2小时。</li>
	<li>孵育 10 µL 将构建的质粒与感受态DH5α细胞在冰上孵育30 min，随后进行热激处理 42 °C 45秒，然后立即置于冰上5分钟。加入 500 µL Luria-Bertani (LB) 培养基，并将细胞接种至含氨苄青霉素的 LB 平板上（100 µg/mL）。在指定条件下孵育 37 °C 孵育16小时，筛选抗性克隆。</li>
	<li>用无菌的移液枪头挑选5-10个单菌落，转移至含有氨苄青霉素的1 mL LB培养基培养液中100 µg/mL）。将培养物置于 37 °C 以180 rpm振荡培养12-16小时。</li>
	<li>使用质粒提取试剂盒，按照制造商提供的操作说明提取质粒DNA。通过Sanger测序对每个菌落的质粒DNA进行验证，测序引物为 U6 启动子位点，使用 U6- 正向引物 5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC-3'</li>
	<li>使用无内毒素质粒DNA试剂盒，按照生产商提供的说明书提取和纯化质粒。</li>
</ol>
2. 转染、分离与筛选 CENP-E 敲除的HeLa细胞
<ol>
	<li>在含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养HeLa细胞，培养条件为37°C、5% CO₂的湿润培养箱 37 °C 含5% CO₂2.</li>
	<li>使用0.25%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）孵育HeLa细胞 37 °C 轻轻吹打细胞2-3分钟使其解离，然后按1:4的传代比例将细胞接种至新的培养板中。</li>
	<li>在12孔板中接种细胞，培养至60–70%融合度后进行转染。根据生产商说明书，使用参考试剂将pX458-sgRNA质粒转染至HeLa细胞中（参见 材料表).
	<ol>
		<li>轻轻混匀 1 µg 经验证的 pX458-sgRNA 质粒 50 µL 在A管中加入减量血清培养基，然后轻轻混匀 2 µL 转染试剂的 50 µL B管中加入低血清培养基。将A管和B管分别在室温下孵育5分钟。</li>
		<li>轻柔混合A管和B管，室温孵育5分钟。将混合液加入12孔板中，孵育细胞6小时，随后更换为新鲜DMEM培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在转染后24 h或48 h，使用荧光显微镜观察HeLa细胞以评估转染效率。转染48 h后，使用0.25%胰蛋白酶/EDTA将转染的HeLa细胞完全消化解离 37 °C 孵育3-5分钟，使用血细胞计数板或自动细胞计数仪对细胞进行计数，然后根据梯度稀释法，将转染后的每种细胞群体分别接种至三个独立的96孔板中10.</li>
	<li>将细胞放回湿润的培养箱中，继续培养1-2周，每3天更换一次培养基。用于基于表型的筛选与验证 CENP-E 在24孔或12孔板中对细胞进行敲除、解离并扩增培养5-7天。</li>
	<li>使用配备10倍和20倍物镜的倒置显微镜，筛选菌落直径较小的突变细胞。 
	注意： CENP-E 突变通常会导致细胞克隆中分裂细胞数量显著增加，这可能成为筛选的关键指标之一 CENP-E 突变细胞。</li>
	<li>使用柱式动物基因组DNA提取试剂盒，按照制造商提供的操作说明提取细胞DNA。PCR反应体系设置如下： 0.25 µL Taq 聚合酶 5 µL 10x 缓冲液（Mg2+ 加） 4 µL dNTP混合物，500 ng DNA模板， 1 µL 正向引物， 1 µL 反向引物的用量，并用ddH₂O调整2O 至 50 µL采用以下PCR程序设置进行基因扩增： 98 °C，10 秒； 98 °C，10 秒， 55 °C，30 秒， 72 °C，33个循环，每个循环60秒； 72 °C，10 分钟，然后保持在 4 °C. 
	注意：用于目标位点克隆的特异性引物序列如下所列： CENP-E 靶标 F1，5'-GAGGGTCCTGGCCATTTTCCTG-3'； CENP-E 靶序列 R1，5'-AGATCTCCGATCCTCCCCTGTC-3'； CENP-E 靶标 F2，5'-TGGTAACTGCATTTTGGTGTTCTAC-3'； CENP-E 靶标 R2，5'-CCTGTTGCAACGTGAGGGAAG-3'</li>
	<li>按照生产商的说明书将目标DNA连接至pMD18-T载体中。将连接产物转化至感受态DH5α细胞中，并进行培养以筛选克隆。</li>
	<li>进行Sanger测序以确定类型 CENP-E 敲除。使用质粒提取试剂盒，按照生产商的说明书提取质粒DNA。使用M13正向和反向引物对每个菌落的质粒DNA进行Sanger测序。M13F引物序列：5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'；M13R引物序列：5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3'。</li>
	<li>接种野生型和 CENP-E 分别将突变的HeLa细胞接种于24孔板中的12 mm玻璃盖玻片上。吸除完全DMEM培养基，于室温下用4%多聚甲醛/磷酸盐缓冲液（PBS）固定液固定细胞10分钟。</li>
	<li>用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）溶液在室温下染色细胞核5分钟。筛选并验证 CENP-E 使用配备 Plan Fluor 40x/数值孔径（NA）0.75 物镜的荧光显微镜，根据染色体排列的表型筛选突变细胞。</li>
	<li>使用CENP-E蛋白的免疫荧光染色与分析（见第3节）筛选并验证CENP-E基因敲除细胞。</li>
</ol>
3. 免疫荧光染色与高分辨率共聚焦显微镜检测
<ol>
	<li>在室温下用 4% 多聚甲醛/PBS 固定液固定细胞 10 分钟，并在 1× PBS 中浸洗 2 次，每次 5 分钟。 
	注意：确保细胞处于良好状态，并轻柔地收集和固定细胞，以避免中期细胞脱落。</li>
	<li>在室温下用 0.25% Triton X-100/PBS 处理细胞 10 分钟，然后在 1× PBS 中浸洗 2 次，每次 5 分钟。</li>
	<li>在室温下用 1% BSA/PBST（含 0.1% Tween 20 的 PBS）封闭细胞 1 小时。用 1% BSA/PBST 稀释一抗，将样本在 4 °C 下孵育 12 小时。</li>
	<li>弃去一抗溶液，在 1× PBS 中清洗细胞 3 次，每次 5 分钟，然后在室温下加入稀释的二抗孵育 2 小时。</li>
	<li>弃去二抗溶液，在 1× PBS 中清洗细胞 3 次，每次 5 分钟。</li>
	<li>在室温下用 DAPI 染色细胞核 5 分钟。用封片剂封片，并用指甲油密封载玻片。</li>
	<li>使用配备 63×/NA 1.40 物镜的激光扫描共聚焦显微镜观察并记录荧光图像。</li>
</ol>
4. 染色体标本制备与核型分析
<ol>
	<li>将野生型和 CENP-E-/- HeLa 细胞在含 10% 胎牛血清和 1% 青霉素/链霉素的完全 DMEM 培养基中培养 24 小时，然后用 300 nM 秋水仙素处理野生型和 CENP-E-/- HeLa 细胞 5 小时。</li>
	<li>在 37 °C 下用 0.25% 胰蛋白酶/EDTA 孵育细胞 3 分钟，将细胞收集至 1.5 mL 离心管中。</li>
	<li>在室温下以 1,000 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，加入 1.2 mL 0.075 mol/L KCl 溶液，在 37 °C 下孵育 20 分钟。</li>
	<li>在室温下以 1,000 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，加入 0.2 mL 固定液（甲醇:冰醋酸 = 3:1）进行预固定，轻轻混匀 1 分钟。</li>
	<li>在室温下以 1,000 × g 离心 5 分钟，收集细胞沉淀，加入 1.5 mL 室温固定液孵育 10 分钟，然后在室温下以 1,000 × g 再次离心 5 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，加入 0.6 mL 固定液，制备细胞悬液。从距冰上载玻片 35–40 cm 的高度滴加 3–5 滴细胞悬液。 
	注意：保持细胞悬液滴加到载玻片的高度为 35–40 cm；否则染色体可能过于分散或彼此无法分离。</li>
	<li>立即用酒精灯烘干载玻片，用 10% 吉姆萨染色液染色 7 分钟，用流水冲洗 2 分钟，然后使用配备 Plan Fluor 40x/NA 0.75 物镜的光学显微镜观察样本。</li>
</ol>
5. 细胞克隆形成实验
<ol>
	<li>在6孔板中制备细胞悬液，每孔细胞密度为1,000-2,000个细胞。轻轻摇动培养板，使细胞均匀分布。</li>
	<li>将6孔板放入CO₂培养箱中2 孵育器中孵育，2-3 周 37 °C 含5% CO2每5天更换一次培养基。使用配备10倍和20倍物镜的倒置显微镜记录图像。当克隆中出现可见的细胞集落（一个克隆内含数百个细胞）时，收获细胞。</li>
	<li>为研究GSK923295的作用，将细胞接种于6孔板中培养24小时，随后加入终浓度分别为10、25、50、100和200 nM的GSK923295溶液，每孔2 mL。 
	注意：在克隆形成的早期阶段，不要移动培养皿，以避免细胞脱落，否则可能形成新的克隆，影响转染细胞的筛选。</li>
	<li>弃去培养基，在室温下用1% PFA固定细胞10 min。在室温下用0.1%结晶紫染色液染色集落15 min。用1× PBS冲洗样本3次。使用ImageJ软件记录细胞集落的图像并量化每个集落的直径。选择 直线 选择工具，单击 分析，选择 测量，并记录长度。</li>
	<li>用1 mL 10%乙酸溶液冲洗菌落，持续5分钟。转移 200 µL 将上清液加入96孔板中，使用微孔板分光光度计在A波长下测定吸光度值600 nm.</li>
</ol>
6. 细胞活力检测
<ol>
	<li>将细胞接种于24孔板中，在37 °C培养48小时，使细胞密度达到80-90%。</li>
	<li>加入100 µL含0.25%胰蛋白酶/EDTA的溶液，于37 °C孵育3分钟。</li>
	<li>用移液枪将400 µL PBS与细胞充分混匀，取100 µL细胞悬液转移至96孔板中。</li>
	<li>每孔加入20 µL MTS溶液，使其终浓度为317 µg/mL，按照试剂盒说明书轻轻混匀。将样品置于CO2培养箱中，37 °C孵育1-3小时。</li>
	<li>使用酶标仪在A490 nm波长处测定各孔的吸光度值，并以A630 nm作为参比波长，扣除细胞碎片及非特异性吸收带来的背景信号（细胞活力 = A490nm - A630 nm）。</li>
</ol>

Centromere-Associated Protein-E Gene Editing Using the CRISPR/Cas9 System

作者声明无利益冲突。

驱动蛋白-7 CENP-E 是细胞分裂过程中染色体排列和纺锤体组装检查点的关键调控因子17,19,20。CENP-E 的基因缺失通常会导致纺锤体组装检查点激活、细胞周期阻滞以及细胞死亡27,29,51,52。因此，构建稳定的 CENP-E 基因敲除细胞系是 CENP-E 生物学研究中一个尚未解决的重要问题。本研究利用 CRISPR/Cas9 系统成功构建了 CENP-E 基因敲除的 HeLa 细胞。本研究建立了三种优化的基于表型的筛选策略——细胞克隆筛选、染色体排列表型分析以及 CENP-E 蛋白荧光强度检测——显著提高了 CENP-E 基因敲除细胞的筛选效率和成...

基因组编辑技术可实现对多种细胞和生物体中基因的靶向修饰。在真核生物中，可通过使用序列特异性核酸酶诱导靶标DNA的同源重组，从而实现位点特异性突变1。近年来，已开发出多种基因组编辑技术，包括锌指核酸酶（ZFNs）2,3、转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）4,5以及归巢大核酸酶（homing meganucleases）6,7，这些技术均可在基因组特定位点进行切割，但往往需要复杂的蛋白质工程和重复的实验流程。研究表明，II型原核生物成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas系统是一种高效的基因编辑技术，可在多种细胞和物种中特异性地介导RNA引导的位点特异性DNA切割8,9,10,11。CRISPR/Cas9基因敲除技术已彻底改变了基础生物学、生物技术和医学领域12。
细菌和大多数古菌进化出了一种基于RNA的适应性免疫系统，该系统利用CRISPR和Cas蛋白来识别并摧毁病毒和质粒13。Streptococcus pyogenes Cas9（SpCas9）核酸酶包含类RuvC的Holliday连接体解离酶（RuvC）结构域和组氨酸-天冬酰胺-组氨酸（HNH）结构域，通过提供包含CRISPR RNA（crRNA）和反式激活crRNA（tracrRNA）的合成单导向RNA（sgRNA），可高效介导序列特异性的双链断裂（DSBs）14,15,16。双链断裂可通过产生插入缺失的非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）途径进行修复，从而在哺乳动物细胞中引入多种突变，包括插入、缺失或无痕的单核苷酸替换1,8。易错的NHEJ途径和高保真的HDR途径均可用于介导基因敲除，通过插入或缺失导致移码突变和提前终止密码子的产生10。
驱动蛋白-7 CENP-E 在细胞分裂过程中对动粒-微管连接和染色体排列至关重要17,18,19抗体显微注射20,21，siRNA 耗竭22,23，化学抑制24,25,26，以及基因敲除27,28,29 CENP-E的缺失会导致染色体排列异常、纺锤体组装检查点激活以及有丝分裂缺陷，进而引起非整倍性和染色体不稳定性19,30在小鼠中， CENP-E 缺失会导致发育异常，并在发育的极早期阶段引发胚胎致死27,29,31基因敲除 CENP-E 通常会导致染色体错位和细胞死亡26,27,29，这阻碍了对CENP-E蛋白功能和作用机制的研究。
最近一项研究利用一种可诱导的生长素CRISPR/Cas9基因编辑方法建立了条件性CENP-E基因敲除细胞系32，可在相对较短的时间内实现CENP-E蛋白的快速降解33。然而，迄今为止尚未建立稳定的CENP-E基因敲除细胞系，这是CENP-E生物学领域尚未解决的一项技术挑战。考虑到遗传稳健性34、遗传补偿反应35,36,37以及复杂的细胞内环境，完全删除CENP-E的直接后果可能十分复杂且难以预测。因此，建立CENP-E基因敲除细胞系对于研究染色体排列机制、纺锤体组装检查点以及下游信号通路具有重要意义。
CENP-E抑制剂的发现及其应用对癌症治疗具有重要意义。迄今为止，已发现并合成了七类CENP-E抑制剂，包括GSK923295及其衍生物24,25、PF-277138,39、咪唑并[1,2-a]吡啶骨架衍生物40,41、化合物A42,43、syntelin44,45、UA6278446以及苯并[d]吡咯并[2,1-b]噻唑衍生物47。在这些抑制剂中，GSK923295是一种变构性且高效的CENP-E抑制剂，可结合于CENP-E的马达结构域，抑制CENP-E微管刺激的ATP酶活性，其Ki值为3.2 ± 0.2 nM24,25。然而，与GSK923295在培养的癌细胞中的抑制效果相比，其在临床癌症患者中的治疗效果并不理想48,49，这也引发了人们对GSK923295作用于CENP-E特异性的担忧。此外，其他CENP-E抑制剂对CENP-E蛋白的特异性及其副作用也是癌症研究中的关键问题。
本研究利用 CRISPR/Cas9 系统在 HeLa 细胞中完全敲除了 CENP-E 基因。我们建立了三种优化的基于表型的筛选策略，包括细胞克隆筛选、染色体排列表型分析以及 CENP-E 蛋白的荧光强度检测，以提高 CENP-E 基因编辑的筛选效率和成功率。此外，CENP-E 基因敲除细胞系可用于验证候选化合物对 CENP-E 的特异性。

<table><tbody><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 离心管</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>24孔板</td><td>康宁</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>4S Gelred，水中10,000倍浓缩液</td><td>上海桑谷生物技术有限公司</td><td>A616697</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>康宁</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>6 cm 培养皿</td><td>康宁</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>95% 乙醇</td><td>国药化学试剂</td><td>10009164</td><td></td></tr><tr><td>96孔板</td><td>康宁</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>国药集团化学试剂</td><td>10000218</td><td>溶于 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 以配制10%的工作液。</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>生工生物（上海）</td><td>A620014</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 标记的山羊抗小鼠 IgG(H+L)</td><td>Beyotime</td><td>A0428</td><td>用于免疫荧光。用 1% BSA/PBST 溶解，按 1:500 稀释。</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 标记的山羊抗兔 IgG(H+L)</td><td>Beyotime</td><td>A0423</td><td>用于免疫荧光。用 1% BSA/PBST 溶解，按 1:500 稀释。</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 标记的驴抗小鼠 IgG(H+L)</td><td>Beyotime</td><td>A0460</td><td>用于免疫荧光。用 1% BSA/PBST 溶解，按 1:500 稀释。</td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>100092690</td><td></td></tr><tr><td>抗BubR1兔单克隆抗体</td><td>Abcam</td><td>ab254326</td><td>用于免疫荧光。用 1% BSA/PBST 溶解，按 1:100 稀释&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>抗CENP-B小鼠单克隆抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-376392</td><td>用于免疫荧光。用 1% BSA/PBST 溶解，按 1:50 稀释。</td></tr><tr><td>抗CENP-E兔单克隆抗体</td><td>Abcam</td><td>ab133583</td><td>用于免疫荧光。用 1% BSA/PBST 溶解，按 1:100 稀释。</td></tr><tr><td>抗荧光淬灭封片剂</td><td>Beyotime</td><td>P0131</td><td>减缓荧光信号的淬灭</td></tr><tr><td>抗-&amp;alpha;微管蛋白小鼠单克隆抗体</td><td>Abcam</td><td>ab7291</td><td>用于免疫荧光。溶于 1% BSA/PBST 中，按 1:100 稀释。</td></tr><tr><td>Biotek Epoch 微孔板分光光度计</td><td>Biotek Instruments</td><td>Biotek Epoch</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>国药集团化学试剂</td><td>69003435</td><td></td></tr><tr><td>BpiI (BbsI)</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>ER1011</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter 96 Aqueous 单溶液细胞增殖检测</td><td>Promega</td><td>G3580</td><td></td></tr><tr><td>离心</td><td>Eppendorf</td><td>5424BK745380</td><td></td></tr><tr><td>秋水仙碱</td><td>国药集团化学试剂</td><td>61001563</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦扫描显微镜</td><td>Leica</td><td>Leica TCS SP8</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>CITOTEST</td><td>80344-1220</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Beyotime</td><td>C1006</td><td></td></tr><tr><td>DH5&amp;alpha; 感受态细胞</td><td>上海桑谷生物技术有限公司</td><td>B528413</td><td></td></tr><tr><td>DL2000 DNA marker</td><td>TaKaRa</td><td>3427A</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Gibco</td><td>C11995500BT</td><td></td></tr><tr><td>无内毒素质粒小提试剂盒 &lt;图像替代文本&quot;公式 2&quot; 源文本：src=&quot;/files/ftp_upload/65476/65476eq02.jpg&quot; 样式=&quot;margin: auto;&quot;/&gt;</td><td>Omega</td><td>D6950</td><td></td></tr><tr><td>Ezup柱式动物基因组DNA纯化试剂盒</td><td>上海桑谷生物技术有限公司</td><td>B518251</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>浙江天航生物科技</td><td>11011-8611</td><td></td></tr><tr><td>龙胆紫</td><td>国药集团化学试剂</td><td>71019944</td><td>用 PBS 溶解，配制 0.1% 龙胆紫/PBS 溶液。</td></tr><tr><td>吉姆萨染色液</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>71020260</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 8.0 版本软件</td><td>GraphPad</td><td>www.graphpad.com</td><td>统计分析。</td></tr><tr><td>GSK923295</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-10299</td><td></td></tr><tr><td>HeLa细胞系</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>加湿培养箱</td><td>Heal Force</td><td>HF90/HF240</td><td></td></tr><tr><td>Image J 软件</td><td>美国国立卫生研究院</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td><td>图像处理与分析</td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>南京江南永新光学</td><td>XD-202</td><td></td></tr><tr><td>LB 琼脂粉</td><td>上海桑谷生物技术有限公司</td><td>A507003</td><td></td></tr><tr><td>Lipo6000 转染试剂</td><td>Beyotime</td><td>C0526</td><td></td></tr><tr><td>尼康 Ti-S2 显微镜</td><td>尼康</td><td>Ti-S2</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM&amp;nbsp;降低的&amp;nbsp;血清&amp;nbsp;培养基</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>国药集团化学试剂</td><td>80096618</td><td>用 PBS 溶解，配制 4% 多聚甲醛/PBS 溶液。</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>SanPrep 柱式 DNA 胶回收试剂盒</td><td>上海桑谷生物技术有限公司</td><td>B518131</td><td></td></tr><tr><td>SanPrep&amp;nbsp;柱&amp;nbsp;质粒&amp;nbsp;小量质粒提取&amp;nbsp;试剂盒</td><td>生工生物（上海）</td><td>B518191</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶</td><td>TaKaRa</td><td>2011A</td><td></td></tr><tr><td>T4多核苷酸激酶</td><td>TaKaRa</td><td>2021A</td><td></td></tr><tr><td>TaKaRa Ex Taq</td><td>TaKaRa</td><td>RR001A</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>国药化学试剂</td><td>30188928</td><td>用 PBS 溶解，配制 0.25% Triton X-100/PBS 溶液。</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>国药集团化学试剂</td><td>30189328</td><td>用 PBS 溶解，配制 0.1% Tween 20/PBS。</td></tr></tbody></table>

使用 crispr/cas9 系统构建着丝粒相关蛋白-e cenp-e-/- 敲除细胞系

Generation of Centromere-Associated Protein-E CENP-E-/- Knockout Cell Lines using the CRISPR/Cas9 System

CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）/Cas9 系统已成为在多种生物体中进行精确高效基因编辑的强大工具。着丝粒相关蛋白 E（CENP-E）是一种向微管正端移动的驱动蛋白，参与动粒-微管捕获、染色体排列以及纺锤体组装检验点的调控。尽管 CENP-E 蛋白的细胞功能已被广泛研究，但使用传统方法研究其直接功能仍存在困难，因为 CENP-E 的缺失通常会导致纺锤体组装检验点激活、细胞周期阻滞以及细胞死亡。在本研究中，我们利用 CRISPR/Cas9 系统在人 HeLa 细胞中完全敲除了 CENP-E 基因，并成功构建了 CENP-E-/- HeLa 细胞系。
建立了三种优化的基于表型的筛选策略，包括细胞克隆筛选、染色体排列表型以及CENP-E蛋白的荧光强度检测，这些策略显著提高了CENP-E基因敲除细胞的筛选效率和实验成功率。重要的是，CENP-E基因的缺失会导致染色体排列异常、有丝分裂检查点丝氨酸/苏氨酸激酶B（BubR1）蛋白定位异常以及有丝分裂缺陷。此外，我们利用CENP-E基因敲除的HeLa细胞模型，开发了一种针对CENP-E特异性抑制剂的鉴定方法。
本研究建立了一种验证CENP-E抑制剂特异性和毒性的有效方法。此外，本文介绍了利用CRISPR/Cas9系统进行CENP-E基因编辑的实验方案，该方法可作为研究CENP-E在细胞分裂中作用机制的有力工具。同时，CENP-E&#160;基因敲除细胞系将有助于CENP-E抑制剂的发现与验证，对肿瘤药物研发、细胞生物学中细胞分裂机制的研究以及临床应用具有重要意义。

的 CENP-E-/- HeLa 细胞通过 CRISPR/Cas9 系统成功构建（图1）。该方法的时间线和关键实验步骤如图所示 图1首先，我们设计并合成了 CENP-E特异性的sgRNA，将sgRNA退火并连接至pX458质粒，将质粒转染入HeLa细胞，并培养48 h。转染后的细胞经消化分散，通过连续稀释法接种于96孔板中图1A）。挑取单菌落，并采用三种基于表型的策略进行筛选。突变类型及 CENP-E 敲除细胞通过PCR、Sanger测序和免疫荧光实验进行验证（图1A）。第1外显子和第13外显子的 CENP-E 基因被选为染色体4上的靶向位点（图1B）。CRISPR/Cas9 系统利用 RuvC 和 HNH 核酸内切酶结构域，在原间隔序列邻近基序（P...

本文报道了利用CRISPR/Cas9系统构建着丝粒相关蛋白E（CENP-E）基因敲除细胞及三种基于表型的筛选策略。我们已利用CENP-E&#160;基因敲除细胞系建立了一种新方法，用于验证CENP-E抑制剂的特异性和毒性，该方法对药物开发和生物学研究具有重要意义。

使用 CRISPR/Cas9 系统构建着丝粒相关蛋白-E CENP-E-/- 敲除细胞系

CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）/Cas9 系统已成为一种强大工具，可用于精确且高效的基因编辑……

敲除驱动蛋白-7和CENP基因通常会导致细胞周期阻滞和细胞死亡。构建稳定的CENP基因敲除细胞系是CENP生物学研究中一个尚未解决的重要问题。在本研究中，我们利用CRISPR/Cas9系统生成了CENP基因敲除的HeLa细胞，并建立了三种优化的筛选策略。近年来，多种基因组编辑技术，包括锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶，以及我们如何构建核酸酶，已被设计用于在特定位置切割基因组。CRISPR/Cas9 基因敲除技术已彻底改变了基础生物学、生物技术和医学。CENP 对于将动粒连接到微管以及染色体的排列至关重要。通过抗体显微注射、sgRNA敲除、化学抑制或基因删除等方式破坏CENP，会导致染色体排列异常、有丝分裂缺陷，并常引发细胞死亡，从而增加了研究CENP蛋白机制的难度。本研究建立了三种优化的基于表型的筛选策略，包括细胞克隆筛选、染色体排列表型分析以及CENP蛋白荧光强度检测，显著提高了筛选效率和实验成功率。重要的是，CENP的缺失会导致染色体排列异常、BubR1蛋白定位异常以及有丝分裂缺陷。CENP及其抑制剂的相互作用模式和分子机制是细胞生物学和癌症研究中的重要研究领域。本研究中，已建立CENP基因敲除的HeLa细胞系，作为验证CENP抑制剂特异性和毒性的有力工具。首先，向HeLa细胞中加入0.25%胰蛋白酶EDTA溶液，在37摄氏度下孵育2至3分钟。用移液器轻柔地分散细胞，并按1:4的比例将细胞接种至新的培养皿中进行传代。为了将质粒转染至HeLa细胞中，取一微克经验证的PX458 sgRNA质粒与50微升低血清培养基混合于A管中。在B管中，轻轻混合两微升转染试剂与50微升低血清培养基，室温孵育五分钟。随后，将A管和B管中的溶液合并，室温再孵育五分钟。将混合物加入12孔板中，在37摄氏度下孵育细胞6小时。孵育结束后，更换为新鲜的DMEM培养基。在转染24或48小时后，通过荧光显微镜观察HeLa细胞以评估转染效率。使用0.25%胰蛋白酶EDTA充分解离转染的HeLa细胞，并在37°C下孵育3至5分钟。随后，使用血球计数板或自动细胞计数仪对细胞进行计数。根据连续稀释法，将细胞接种至三个独立的96孔板中，每个转染细胞群体对应一个96孔板。将细胞放回湿润培养箱中培养一到两周。对于基于表型的筛选及CENP-E基因敲除的验证，将细胞在24孔板或12孔板中解离并扩增培养5至7天。使用倒置显微镜配合10倍和20倍物镜，对菌落直径较小的突变细胞进行筛选。接下来，采用柱式动物基因组DNA提取试剂盒，按照制造商说明书提取细胞DNA，并进行聚合酶链式反应（PCR）体系的建立。按照制造商的操作步骤，将目标DNA片段连接至pMD18-T载体中。将连接产物转化至感受态DH5-alpha细胞，并进行培养以筛选阳性克隆。为了鉴定CENP-E基因敲除的类型，按照制造商的说明，使用质粒提取试剂盒提取质粒DNA。接着，使用M13正向和反向引物对每个菌落的质粒DNA进行Sanger测序。将野生型和CENP-E突变型HeLa细胞接种于24孔板中的12毫米玻璃盖玻片上。移除完全DMEM培养基，并在室温下使用4%多聚甲醛和PBS溶液固定细胞10分钟。接着，在室温下用DAPI染色细胞核5分钟。使用荧光显微镜观察并验证基于染色体排列表型的CENP-E突变细胞。菌落的表型筛选显示，与对照组相比，CENP-E基因敲除细胞的染色体错位现象增加。首先，取一皿在盖玻片上生长的野生型和CENP-E突变型HeLa细胞。在室温下用4%多聚甲醛和PBS固定液固定细胞10分钟。然后在PBS中浸洗两轮，每轮5分钟。接着在室温下用0.25% Triton X-100和PBS对细胞进行10分钟的透化处理。再将细胞在PBS中浸洗两轮，每轮5分钟。在室温下用含0.1% Tween 20的1% BSA PBS封闭细胞，持续一小时。将一抗用含1% BSA的PBST稀释后，于4°C孵育样本12小时。弃去一抗溶液，随后用PBS洗涤细胞三次，每次五分钟。加入稀释后的二抗孵育细胞，在室温下孵育两小时。接着弃去二抗，用 PBS 洗涤细胞三次，每次五分钟。使用 DAPI 在室温下对细胞核染色五分钟。使用封片剂封片，并用指甲油密封。使用配备63倍放大倍数、数值孔径为1.40的物镜的扫描共聚焦显微镜观察荧光图像，并记录图像以供进一步分析。对照组与CENP-E突变组的免疫荧光染色结果显示，CENP-E突变克隆1细胞中CENP-E蛋白的荧光强度完全消失，而在CENP-E突变克隆3细胞中显著降低。与对照细胞相比，克隆1和克隆3中染色体排列异常的中期细胞比例增加。同时，克隆1和克隆3细胞中中期细胞的比例显著升高。此外，与对照组相比，在CENP-E缺失后，克隆1和克隆3组中间期细胞的比例略有增加。在删除CENP-E后，前期、后期和末期细胞的比例略有下降，而中期细胞的比例则有所增加。首先，取野生型和CENP-E突变型HeLa细胞培养物，加入300纳米浓度的秋水仙素，于37摄氏度孵育5小时。接着，用0.25%胰蛋白酶EDTA在37摄氏度孵育细胞3分钟，并将细胞收集至1.5毫升离心管中。接下来，在室温下以 1000 G 离心细胞 5 分钟。弃去上清液，加入 1.2 毫升 0.075 摩尔的氯化钾溶液。将细胞在 37 摄氏度孵育 20 分钟。孵育结束后，离心细胞，弃去上清液，加入0.2毫升固定液进行预固定。轻轻混匀1分钟，然后按照之前的方法收集细胞沉淀，并加入1.5毫升室温固定液，固定10分钟。再次离心细胞并弃去上清液后，加入0.6毫升固定液以制成细胞悬液。从35至40厘米的高度，小心地将三到五滴细胞悬液滴加到冰冻载玻片上。立即用酒精灯烘干载玻片，并用10%吉姆萨染色液染色7分钟。用流水冲洗载玻片2分钟，然后使用配备Plan Fluor 40倍物镜（数值孔径0.75）的光学显微镜观察样品。核型分析显示，与野生型细胞相比，CENP-E突变的HeLa细胞中染色体数目减少。

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科研

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Biology

生物学

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基因组编辑工具（如CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）/Cas（CRISPR相关蛋白）系统）显著提高了在人诱导性多能干细胞（hiPSCs）中进行基因靶向的效率。本文描述了一种利用CRISPR/Cas系统介导的同源重组技术，构建谱系特异性hiPSC报告细胞系的实验方案。...

利用CRISPR/Cas9与Cas9双切口酶系统高效构建hiPSC神经谱系特异性敲入报告细胞系

通过功能缺失分析是验证增强子活性的最佳方法。本文介绍了一种高效方案，利用CRISPR/Cas9介导的缺失技术，在含有杂合基因组（Mus musculus129 × Mus...

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近年来，在体细胞系中进行基因操作的能力取得了显著进展，为基础研究和应用研究带来了巨大潜力。本文介绍了两种在哺乳动物细胞系中利用CRISPR/Cas9技术生成基因敲除并进行筛选的方法，一种使用可选择标记，另一种则不使用可选择标记。...

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关键词：CRISPR/Cas9，基因敲除，哺乳动物细胞，选择标记，非选择性筛选，基因编辑

本文介绍了一种利用CRISPR-Cas9核糖核蛋白和同源依赖性修复模板对秀丽隐杆线虫（C.

使用 CRISPR/Cas9 核糖核蛋白在 C. elegans 中快速简便地生成基因组点突变的流程

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一种研究方法 从头合成 染色质结构域的形成

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利用CRISPR-Cas9在人类多能干细胞中产生特定基因组修饰

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使用 dpy-10 共 CRISPR 筛选标记和组装的核糖核蛋白复合物对 C. elegans rbm-3.2 基因进行 CRISPR/Cas9 编辑。

随着CRISPR相关技术方案变得越来越实用且易于获取，在特定实验条件下仍可能出现复杂情况和障碍。本方案概述了利用CRISPR/Cas9技术构建受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（RIPK1/RIP1）基因敲除人源细胞系的步骤，并重点指出了在此过程中可能遇到的潜在挑战。...

使用 CRISPR-Cas9 系统生成 RIP1 敲除 U937 细胞系

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CRISPR-Cas9 介导的无饲养层培养条件下人多能干细胞基因敲除

THP-1细胞系被广泛用作研究人类单核细胞/巨噬细胞在各个生物学相关研究领域中功能的模型。本文介绍了一种高效的基于CRISPR-Cas9的基因编辑和单细胞克隆分离方案，可实现稳定且可重复的表型数据的获取。...

基于电穿孔的CRISPR-Cas9介导的THP-1细胞基因敲除及单细胞克隆分离

了解使用CRISPR/Cas9系统在HeLa细胞中敲除CENP-E基因的优化筛选策略。该方法通过表型筛选和免疫荧光验证，为研究CENP-E抑制剂特异性和毒性提供了重要细胞模型。

使用 CRISPR/Cas9 系统构建着丝粒相关蛋白-E CENP-E^-/- 敲除细胞系

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