使用 CRISPR/Cas9 系统构建着丝粒相关蛋白-E CENP-E^-/- 敲除细胞系

敲除驱动蛋白-7和CENP基因通常会导致细胞周期阻滞和细胞死亡。构建稳定的CENP基因敲除细胞系是CENP生物学研究中一个尚未解决的重要问题。在本研究中，我们利用CRISPR/Cas9系统生成了CENP基因敲除的HeLa细胞，并建立了三种优化的筛选策略。

近年来，多种基因组编辑技术，包括锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶，以及我们如何构建核酸酶，已被设计用于在特定位置切割基因组。CRISPR/Cas9 基因敲除技术已彻底改变了基础生物学、生物技术和医学。CENP 对于将动粒连接到微管以及染色体的排列至关重要。

通过抗体显微注射、sgRNA敲除、化学抑制或基因删除等方式破坏CENP，会导致染色体排列异常、有丝分裂缺陷，并常引发细胞死亡，从而增加了研究CENP蛋白机制的难度。本研究建立了三种优化的基于表型的筛选策略，包括细胞克隆筛选、染色体排列表型分析以及CENP蛋白荧光强度检测，显著提高了筛选效率和实验成功率。重要的是，CENP的缺失会导致染色体排列异常、BubR1蛋白定位异常以及有丝分裂缺陷。

CENP及其抑制剂的相互作用模式和分子机制是细胞生物学和癌症研究中的重要研究领域。本研究中，已建立CENP基因敲除的HeLa细胞系，作为验证CENP抑制剂特异性和毒性的有力工具。首先，向HeLa细胞中加入0.25%胰蛋白酶EDTA溶液，在37摄氏度下孵育2至3分钟。

用移液器轻柔地分散细胞，并按1:4的比例将细胞接种至新的培养皿中进行传代。为了将质粒转染至HeLa细胞中，取一微克经验证的PX458 sgRNA质粒与50微升低血清培养基混合于A管中。在B管中，轻轻混合两微升转染试剂与50微升低血清培养基，室温孵育五分钟。随后，将A管和B管中的溶液合并，室温再孵育五分钟。

将混合物加入12孔板中，在37摄氏度下孵育细胞6小时。孵育结束后，更换为新鲜的DMEM培养基。在转染24或48小时后，通过荧光显微镜观察HeLa细胞以评估转染效率。

使用0.25%胰蛋白酶EDTA充分解离转染的HeLa细胞，并在37°C下孵育3至5分钟。随后，使用血球计数板或自动细胞计数仪对细胞进行计数。根据连续稀释法，将细胞接种至三个独立的96孔板中，每个转染细胞群体对应一个96孔板。

将细胞放回湿润培养箱中培养一到两周。对于基于表型的筛选及CENP-E基因敲除的验证，将细胞在24孔板或12孔板中解离并扩增培养5至7天。使用倒置显微镜配合10倍和20倍物镜，对菌落直径较小的突变细胞进行筛选。

接下来，采用柱式动物基因组DNA提取试剂盒，按照制造商说明书提取细胞DNA，并进行聚合酶链式反应（PCR）体系的建立。按照制造商的操作步骤，将目标DNA片段连接至pMD18-T载体中。将连接产物转化至感受态DH5-alpha细胞，并进行培养以筛选阳性克隆。

为了鉴定CENP-E基因敲除的类型，按照制造商的说明，使用质粒提取试剂盒提取质粒DNA。接着，使用M13正向和反向引物对每个菌落的质粒DNA进行Sanger测序。将野生型和CENP-E突变型HeLa细胞接种于24孔板中的12毫米玻璃盖玻片上。

移除完全DMEM培养基，并在室温下使用4%多聚甲醛和PBS溶液固定细胞10分钟。接着，在室温下用DAPI染色细胞核5分钟。使用荧光显微镜观察并验证基于染色体排列表型的CENP-E突变细胞。

菌落的表型筛选显示，与对照组相比，CENP-E基因敲除细胞的染色体错位现象增加。首先，取一皿在盖玻片上生长的野生型和CENP-E突变型HeLa细胞。在室温下用4%多聚甲醛和PBS固定液固定细胞10分钟。

然后在PBS中浸洗两轮，每轮5分钟。接着在室温下用0.25% Triton X-100和PBS对细胞进行10分钟的透化处理。再将细胞在PBS中浸洗两轮，每轮5分钟。

在室温下用含0.1% Tween 20的1% BSA PBS封闭细胞，持续一小时。将一抗用含1% BSA的PBST稀释后，于4°C孵育样本12小时。弃去一抗溶液，随后用PBS洗涤细胞三次，每次五分钟。

加入稀释后的二抗孵育细胞，在室温下孵育两小时。接着弃去二抗，用 PBS 洗涤细胞三次，每次五分钟。使用 DAPI 在室温下对细胞核染色五分钟。

使用封片剂封片，并用指甲油密封。使用配备63倍放大倍数、数值孔径为1.40的物镜的扫描共聚焦显微镜观察荧光图像，并记录图像以供进一步分析。对照组与CENP-E突变组的免疫荧光染色结果显示，CENP-E突变克隆1细胞中CENP-E蛋白的荧光强度完全消失，而在CENP-E突变克隆3细胞中显著降低。

与对照细胞相比，克隆1和克隆3中染色体排列异常的中期细胞比例增加。同时，克隆1和克隆3细胞中中期细胞的比例显著升高。此外，与对照组相比，在CENP-E缺失后，克隆1和克隆3组中间期细胞的比例略有增加。

在删除CENP-E后，前期、后期和末期细胞的比例略有下降，而中期细胞的比例则有所增加。首先，取野生型和CENP-E突变型HeLa细胞培养物，加入300纳米浓度的秋水仙素，于37摄氏度孵育5小时。接着，用0.25%胰蛋白酶EDTA在37摄氏度孵育细胞3分钟，并将细胞收集至1.5毫升离心管中。

接下来，在室温下以 1000 G 离心细胞 5 分钟。弃去上清液，加入 1.2 毫升 0.075 摩尔的氯化钾溶液。将细胞在 37 摄氏度孵育 20 分钟。

孵育结束后，离心细胞，弃去上清液，加入0.2毫升固定液进行预固定。轻轻混匀1分钟，然后按照之前的方法收集细胞沉淀，并加入1.5毫升室温固定液，固定10分钟。再次离心细胞并弃去上清液后，加入0.6毫升固定液以制成细胞悬液。

从35至40厘米的高度，小心地将三到五滴细胞悬液滴加到冰冻载玻片上。立即用酒精灯烘干载玻片，并用10%吉姆萨染色液染色7分钟。用流水冲洗载玻片2分钟，然后使用配备Plan Fluor 40倍物镜（数值孔径0.75）的光学显微镜观察样品。

核型分析显示，与野生型细胞相比，CENP-E突变的HeLa细胞中染色体数目减少。