Name: 在非手术胚胎移植或人工授精之前诱导雌性小鼠假妊娠，而无需输精管切除雄性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-07T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 36 s
Description: 了解通过宫颈操作诱导小鼠假妊娠的方法，用于非手术胚胎移植和人工授精。该技术无需输精管切除雄性，减少繁殖动物数量，提高动物福利，适用于基因修饰动物生产和辅助生殖研究。

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本出版物中报告的研究由美国国立卫生研究院（NIH）主任办公室研究基础设施项目办公室根据资助号 R43OD020304 以及美国国立卫生研究院国家心理健康研究所根据资助号 R44MH122117 提供支持。本内容仅由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。

所有涉及动物的护理和使用均遵循适用的国际、国家和机构指南。所有动物实验程序均符合ParaTechs Corporation机构动物护理和使用委员会的伦理标准，并依照美国卫生与公共服务部公共卫生服务局国立卫生研究院实验室动物福利办公室规定的要求进行。实验所用小鼠为雄性和雌性CD1(ICR)小鼠及雌性C57Bl/6J小鼠，年龄 &gt;8周龄的动物用于本研究。动物来自商业来源（见 材料表).
1. CD1小鼠人工授精中使用的宫颈操作程序
<ol>
	<li>在第1天和第3天同步雌性小鼠的排卵
	<ol>
		<li>在第1天，于动物房暗周期开始前0.5小时，通过腹腔注射（IP）向雌性小鼠注射2.5 IU PMSG（见材料表）。 
		注：每只雄性供体提供的精子足以用于10只雌性受体。</li>
		<li>在第3天，于动物房暗周期开始前1小时，通过腹腔注射（IP）向雌性小鼠注射2.5 IU hCG（见材料表）。 
		注：注射时间、精子转移时间以及光照周期之间的相对时序非常重要。本方案中所有操作的时间均基于12小时光照/黑暗循环设定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第4天新鲜精子的采集与获能
	<ol>
		<li>在60 mm组织培养皿中，于石蜡油下准备500 µL精子预孵育培养基（PM，见材料表）。每位雄性供体准备一个培养皿。在采集精子前，于37 °C和5% CO2条件下平衡至少30分钟。</li>
		<li>在动物房光照周期开始后1小时，根据机构指南实施雄性小鼠安乐死。每只雄性小鼠提供的精子足以进行10次人工授精。</li>
		<li>迅速解剖小鼠的附睾尾部。使用解剖剪和有齿镊在膀胱上方做横向腹部切口。
		<ol>
			<li>睾丸脂肪垫位于膀胱两侧。用弯头镊夹住一侧睾丸脂肪垫，将睾丸和附睾从体腔中取出。在睾丸下方识别附睾尾部，其为扁平的椭圆形管状结构。</li>
			<li>用弯头镊夹住附睾尾部，使用小型斜角剪将其切除。取出双侧附睾尾部，并转移至吸水纸上，在解剖显微镜下去除脂肪和血液。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将两个附睾尾部放入37 °C下已平衡的500 µL PM液滴中（石蜡油覆盖下）。使用小剪刀对组织进行六次剪切。若使用多位雄性供体，为减少样本间差异，每个精子样本应包含每位供体的一个附睾尾部。</li>
		<li>轻轻旋转培养皿，使精子从组织中释放3分钟，每分钟轻摇一次。随后移除所有组织。</li>
		<li>将精子样本在37 °C和5% CO2条件下孵育45分钟至1小时以完成获能。</li>
		<li>可选：使用血细胞计数板在显微镜下测定精子浓度并评估其活力。计数时可根据需要以PM稀释精子。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过细胞学评估确认动情周期同步化
	<ol>
		<li>使用小的预湿润棉签（见材料表），轻轻在阴道壁上滚动以收集阴道细胞，将细胞涂抹于载玻片上20 µL无菌水液滴中，并自然风干。</li>
		<li>在显微镜下使用100倍明场照明，观察角化上皮细胞的存在。处于动情期或动情前期晚期的雌性小鼠会显示角化上皮细胞，应选择这些个体进行宫颈操作。</li>
		<li>可选：在授精前记录雌性受体的体重。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>实施宫颈操作（CM）
	<ol>
		<li>在授精前约0.5小时，将受体雌性小鼠置于带有金属网盖的笼子顶部，使其能够“抓住”笼条表面。用拇指和食指握住尾根部，将尾巴向上倾斜，同时稳定动物（图1）。 
		注：当操作技术正确时，小鼠在整个操作过程中会保持静止。若小鼠移位，可轻柔重新定位后继续操作。若选择具有攻击性的动物作为受体，可在操作过程中让其进入环境丰富化隧道以起到安抚作用。使用隧道为可选操作，但可为研究人员提供分散注意力的方式，从而更易于操作动物。</li>
		<li>将小型塑料棒的钝端（见材料表）经阴道插入至接触宫颈部位，并用剃须刀（见材料表）接触振动30秒。 
		注：应在启动剃须刀前将塑料棒放置到位。操作过程中两者均由一只手持握。无需麻醉或镇痛处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>非手术性精子转移用于人工授精
	<ol>
		<li>将授精装置（见材料表）安装至设定为40 µL的P200移液枪上，并移除保护盖。</li>
		<li>从37 °C和5% CO2环境中的培养皿中取出一份获能后的精子样本，转移至不含油的35 mm组织培养皿中（37 °C）。精子样本应立即用于转移。 
		注：精子在离开CO2培养箱后活力会迅速下降。应尽可能保持获能精子样本处于37 °C和5% CO2环境中。</li>
		<li>将移液枪按钮压至第一档，将导管尖端插入37 °C的精子样本中，缓慢将精子吸入转移装置。避免吸入团块。使用吸水纸清除授精装置外表面残留的石蜡油。将移液枪暂放一旁。 
		注：必须避免将石蜡油转移至子宫角。使用吸水纸清除授精装置外表面残留的石蜡油。</li>
		<li>将受体雌性小鼠置于金属网盖上。采用与宫颈操作相同的抓持技术固定小鼠：用拇指和食指握住尾根部，将尾巴向上倾斜，同时稳定动物。</li>
		<li>将小型阴道扩张器（见材料表）插入阴道。</li>
		<li>将授精装置的导管经扩张器穿过宫颈插入子宫。当装置接头接触扩张器时，按下移液枪按钮至第一档释放精子。避免将额外空气注入子宫角。 
		注：若导管未正确就位，会撞击宫颈周围组织，导致其弯曲甚至折弯。若导管首次尝试未能顺利通过宫颈，应轻柔回撤导管并重新尝试直至成功。必要时可调整扩张器位置。</li>
		<li>取出装置和扩张器。无需术后监测。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>可选：在第10–12天进行妊娠检测
	<ol>
		<li>通过体重增加判断妊娠状态。体重增长因品系而异，但至少增加1–2 g通常提示妊娠。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="小鼠操作流程，戴手套的手，用于科研操作的啮齿类动物固定技术。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65477/65477fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：用于宫颈刺激的小鼠抓持技术。 小鼠置于金属网笼盖上，尾部及后肢前侧两侧均被固定。将一根细小塑料棒的钝端插入阴道以接触宫颈，并通过与剃须刀接触产生振动刺激。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65477/65477fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
2. 用于CD1小鼠宫颈操作的非手术胚胎移植程序
<ol>
	<li>在第1天和第3天同步雌性小鼠的排卵
	<ol>
		<li>在第1天，大约在动物房光照周期开始后6小时，通过腹腔注射（IP）向雌性小鼠注射2.5 IU PMSG。</li>
		<li>在第3天，于PMSG注射后47小时或动物房光照周期开始后约5小时，通过腹腔注射向雌性小鼠注射2.5 IU hCG。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过细胞学评估确认动情周期同步
	<ol>
		<li>在第3天，于交配操作（CM）前约1小时，对潜在受体小鼠进行细胞学检查。使用一支预先润湿的小棉签，轻轻在阴道壁上滚动以收集阴道细胞，将细胞涂抹在载玻片上20 µL无菌水液滴中，并自然风干。</li>
		<li>在显微镜下使用100倍明场照明，观察角化上皮细胞的存在情况。处于动情期或动情前期晚期的雌性小鼠会显示角化上皮细胞，应选择这些个体进行宫颈操作。</li>
		<li>可选：记录潜在雌性胚胎受体的体重。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>执行宫颈操作（CM）
	<ol>
		<li>在第3天，于动物房暗周期开始前1小时，将受体雌鼠放置在带有金属网盖的笼子顶部，使其能够“抓住”笼条。用拇指和食指握住尾巴基部，将尾巴向上倾斜，同时稳定动物（图1）。 
		注：当操作技术正确时，小鼠在整个操作过程中会保持静止。如果小鼠移动位置，应轻柔地重新调整并继续操作。若选择具有攻击性的动物作为受体，可在操作过程中让其进入 enrichment 隧道以帮助镇静。</li>
		<li>将小型塑料棒的钝端经阴道插入，接触宫颈，并用剃须刀接触塑料棒使其振动30秒。 
		注：应在启动剃须刀前将塑料棒放置到位。操作过程中两者均由一只手持握。无需使用麻醉或镇痛剂。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第6天进行非手术胚胎移植
	<ol>
		<li>将20 µL M2培养基（参见材料表）滴加至组织培养皿的盖子上。 
		注：选择盖子是因为其边缘较短，便于接触液滴中的胚胎。切勿在M2液滴上覆盖石蜡油，因为将油引入子宫角似乎会对胚胎移植产生不利影响。</li>
		<li>在显微镜下使用反射照明，用标准胚胎操作移液器（参见材料表）将10–20个囊胚加载至培养基液滴中。 
		注：最佳移植胚胎数量取决于小鼠品系以及胚胎所经历的任何操作。对于健康的未操作胚胎，移植10–15个胚胎通常已足够。对于重新衍生或基因修饰胚胎，应移植更多胚胎。</li>
		<li>将非手术胚胎移植装置（参见材料表）安装至设定为1.8 µL的P2移液器上，并移除保护性导管套。</li>
		<li>将移液器按钮压至第一档，将导管尖端插入培养基液滴中，缓慢将胚胎吸入装置的导管尖端，然后将尖端从液滴中取出。 
		注：在低倍镜下观察胚胎有助于更轻松地将胚胎装入装置。如果胚胎分散在液滴中，可轻轻左右摇晃培养皿以将胚胎集中至液滴中央，或使用胚胎操作移液器重新定位。</li>
		<li>将移液器体积设定为2.0 µL，以在导管尖端形成一个小气泡。将已加载胚胎的移液器轻轻放置在靠近小鼠笼子的位置。</li>
		<li>将受体雌鼠置于金属网盖笼子顶部，采用与CM相同的手法固定小鼠：用拇指和食指握住尾巴基部，将尾巴向上倾斜，同时稳定动物。</li>
		<li>将小型阴道扩张器（参见材料表）插入阴道。</li>
		<li>将移植装置的导管经扩张器穿过宫颈进入子宫。当装置接头接触扩张器时，按下移液器按钮至第一档以释放胚胎。避免将过多空气注入子宫角。</li>
		<li>在不释放移液器按钮的情况下，取出装置和扩张器。无需术后监测。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Cervical Manipulation Induced Pseudopregnancy in Mice for Assisted Reproduction

<ol><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBehringer%2C+R+%22Manipulating+the+Mouse+Embryo%3A+A+Laboratory+Manual%2C+fourth+edition%22">Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, fourth edition</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2014).</li>
<li>Wake, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+induction+of+pseudopregnancy+using+sonic+vibration+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Successful induction of pseudopregnancy using sonic vibration in mice.</a> Scientific Reports. 13 (1), 3604(2023).</li>
<li>Stone, B. J., Steele, K. H., Fath-Goodin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+effective+nonsurgical+artificial+insemination+protocol+using+the+NSET+device+for+sperm+transfer+in+mice+without+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">A rapid and effective nonsurgical artificial insemination protocol using the NSET device for sperm transfer in mice without anesthesia.</a> Transgenic Research. 24 (4), 775-781 (2015).</li>
<li>Green, M., Bass, S., Spear, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+device+for+the+simple+and+rapid+transcervical+transfer+of+mouse+embryos+eliminates+the+need+for+surgery+and+potential+post-operative+complications%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">A device for the simple and rapid transcervical transfer of mouse embryos eliminates the need for surgery and potential post-operative complications.</a> BioTechniques. 47 (5), 919-924 (2009).</li>
<li>Bin Ali, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+pregnancy+and+birth+rates+with+routine+application+of+nonsurgical+embryo+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Improved pregnancy and birth rates with routine application of nonsurgical embryo transfer.</a> Transgenic Research. 23 (4), 691-695 (2014).</li>
<li>Men, H., Stone, B. J., Bryda, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Media+optimization+to+promote+rat+embryonic+development+to+the+blastocyst+stage+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Media optimization to promote rat embryonic development to the blastocyst stage in vitro.</a> Theriogenology. 151, 81-85 (2020).</li>
<li>Stone, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nonsurgical+embryo+transfer+technique+for+fresh+and+cultured+blastocysts+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">A nonsurgical embryo transfer technique for fresh and cultured blastocysts in rats.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 59 (5), 488-495 (2020).</li>
<li>Steele, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonsurgical+embryo+transfer+device+compared+with+surgery+for+embryo+transfer+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Nonsurgical embryo transfer device compared with surgery for embryo transfer in mice.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 52 (1), 17-21 (2013).</li>
<li>Terkel, J., Witcher, J. A., Adler, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+%26%2334%3Bmemory%26%2334%3B+of+cervical+stimulation+for+the+promotion+of+pregnancy+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Hormones+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Evidence for &#34;memory&#34; of cervical stimulation for the promotion of pregnancy in rats.</a> Hormones and Behavior. 24 (1), 40-49 (1990).</li>
<li>Kaneko, T., Endo, M., Tsunoda, S., Nakagawa, Y., Abe, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+induction+of+pseudopregnancy+by+artificial+stimulation+using+a+sonic+vibration+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Simple induction of pseudopregnancy by artificial stimulation using a sonic vibration in rats.</a> Scientific Reports. 10 (1), 2729(2020).</li>
<li>Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+estrous+cycle+identification+tool+and+images%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mouse estrous cycle identification tool and images.</a> PLoS One. 7 (4), e35538(2012).</li>
<li>Cora, M. C., Kooistra, L., Travlos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaginal+cytology+of+the+laboratory+rat+and+mouse%3A+Review+and+criteria+for+the+staging+of+the+estrous+cycle+using+stained+vaginal+smears%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Vaginal cytology of the laboratory rat and mouse: Review and criteria for the staging of the estrous cycle using stained vaginal smears.</a> Toxicologic Pathology. 43 (6), 776-793 (2015).</li>
<li>Luo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superovulation+strategies+for+6+commonly+used+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Superovulation strategies for 6 commonly used mouse strains.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (4), 471-478 (2011).</li>
<li>Gates, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viability+and+developmental+capacity+of+eggs+from+immature+mice+treated+with+gonadotrophins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Viability and developmental capacity of eggs from immature mice treated with gonadotrophins.</a> Nature. 177 (4512), 754-755 (1956).</li>
<li>Russell, W. M. S., Burch, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRussell%2C+WMS+%22The+Principles+of+Humane+Experimental+Technique%22">The Principles of Humane Experimental Technique</a>. , Methuen & Co., Ltd. London, UK. (1959).</li>
<li>Hasegawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+scheduled+production+of+pseudopregnant+female+mice+for+embryo+transfer+by+estrous+cycle+synchronization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">Efficient and scheduled production of pseudopregnant female mice for embryo transfer by estrous cycle synchronization.</a> Journal of Reproduction and Development. 63 (6), 539-545 (2017).</li>
<li>Beaumont, H. M., Smith, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+mortality+during+the+pre-+and+post-implantation+periods+of+pregnancy+in+mature+mice+after+superovulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Reproduction+and+Fertility%22%5BJournal%5D)">Embryonic mortality during the pre- and post-implantation periods of pregnancy in mature mice after superovulation.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 45 (3), 437-448 (1975).</li>
<li>Champlin, A. K., Dorr, D. L., Gates, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+the+stage+of+the+estrous+cycle+in+the+mouse+by+the+appearance+of+the+vagina%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Determining the stage of the estrous cycle in the mouse by the appearance of the vagina.</a> Biology of Reproduction. 8 (4), 491-494 (1973).</li>
</ol>

Barbara Stone 和 Sarah Srodulski 均就职于美国肯塔基州列克星敦的 ParaTechs 公司。ParaTechs 公司拥有用于小鼠的 mNSET 设备的独家生产许可权。ParaTechs 公司开发并销售 mNSET 和 mC&amp;I 设备，分别可用于非手术胚胎移植和非手术人工授精。

3R原则是由Russel和Burch于1959年在《人道实验技术原则》&#34;The Principles of Humane Experimental Technique&#34;15中提出的有关实验动物使用的伦理框架。3R分别指替代（replacement）、减少（reduction）和优化（refinement）。本文所强调的实验方案符合3R原则。颈椎操作技术通过不再需要使用雄性动物来制备假孕雌性动物，从而减少了所需动物的数量。该技术还消除了对雄性动物进行输精管结扎术的需要，因此通过减少疼痛和痛苦实现了3R中的优化。本文所述的辅助生殖技术（人工授精和胚胎移植）均为非手术方法，因此相较于其手术替代方案，可减少由手术引起的疼痛和痛苦，实现了3R中的优化8。
在小鼠辅助生殖过程中，为了成功获得仔鼠，必须使用假孕雌鼠1。CM 方法是一种有效的假孕雌鼠制备手段，但该过程的关键第一步是同步受体雌鼠的动情周期阶段。动情周期同步可显著减少为准备潜在受体所需使用的雌鼠数量，并有助于按需定时获得高质量的假孕雌鼠。在 CD1 小鼠中，使用低剂量激素似乎不会对活产仔鼠的获得产生不利影响。但对于其他品系，必须谨慎选择合适的激素种类及其浓度组合，以获得最适合胚胎或精子移植的高质量受体雌鼠。动情周期同步可通过使用 PMSG 和 hCG 实现16，但能够诱导超数排卵的激素剂量可能并不适合维持后续妊娠17。
为了确定雌性动物是否处于动情期，本研究进行了细胞学评估。动情周期阶段也可通过观察阴道开口来判断11,18。尽管该方法非常有用，可单独使用或作为辅助确认手段，但其主观性较强，不如细胞学方法客观。未经染色的阴道细胞学检查快速且有效，因为角化的上皮细胞易于识别，有助于筛选处于动情期的雌性个体。在本方案中，细胞学评估在交配（CM）前进行，以确定潜在的受体动物。在CM前进行细胞学检查非常重要，因为交配操作本身可能导致阴道脱落细胞破碎，从而增加识别难度。假孕或妊娠的细胞学评估可在交配后3.5至11.5天（dpcm）连续3天进行。处于正常动情周期的雌性动物应至少有一天出现大量角化上皮细胞浸润的现象。而假孕或妊娠的雌性动物则应连续3天呈现发情间期（diestrus）的细胞学特征（以白细胞为主，细胞总数可能较低）。
随着机械刺激发情（CM）技术的发展，发现某些小鼠对该操作的接受程度高于其他个体。CD1品系雌鼠因其性情温顺且育幼本能优异，是理想的选择。该品系易于操作，在CM及非手术辅助生殖技术中表现良好。相比之下，C57Bl/6品系小鼠通常更具攻击性且育幼行为较弱。尽管本方案可有效利用CM技术诱导C57Bl/6雌鼠进入假孕状态，但它们对该操作的接受程度较低，且个体间一致性较差。这种差异似乎与CM操作时所处的动情周期阶段有一定关联。处于动情期或动情前期的雌鼠对操作更为敏感。使用环境丰富化管让动物自行进入，既便于操作者接触阴道，也有助于安抚雌鼠情绪。该操作本身并不完全限制雌鼠活动，因此动物可在任何时候主动脱离。若发生此类情况，可重新调整位置后继续操作。当雌鼠走开时，操作计时应暂停；待操作恢复后，计时再继续。操作成功的关键因素包括动情周期的阶段（动情前期晚期和动情期）以及刺激棒与子宫颈的接触。剃毛器的振动可提供标准化的机械刺激。为确保刺激棒与子宫颈充分接触，需对刺激棒施加轻柔压力，并通过小幅前后移动确认其已正确抵住子宫颈。
使用CM改进了NSAI方案，可在精子移植前选择处于动情周期合适阶段的雌性个体，从而不再依赖与输精管结扎雄性小鼠的交配。人工授精的动情周期同步化时间安排使得卵母细胞成熟与第4天早晨的精子移植相匹配。该方案成功的关键在于调整排卵时间，以确保受精能够发生。必须注意在预计进行精子移植前15–17小时注射hCG，此时间点建议参照所用方案中的具体 timing 安排 体外 受精1精子样本的质量将直接影响人工授精的结果。经过获能处理的新鲜精子表现最佳。高质量的冷冻保存精子也可产生受精胚胎。 体内然而，在直接转移解冻后的精子时需谨慎，因为残留的冷冻保护剂若被带入子宫角，可能会抑制胚胎着床（未发表观察结果）。
将细胞学检测（CM）与胚胎移植结合使用在概念上是一种简单的适应性方法。发情周期同步化可减少产生受体群体所需的雌性动物数量。在进行细胞学检测前确定受体的发情阶段，可提高获得假孕受体的可能性。该方法的一个缺点是，在胚胎移植时受体的细胞学状态处于动态变化之中。如果雌性动物正处于从发情期向假孕状态过渡的阶段，则所有类型的细胞均会存在，而假孕状态只有在连续数天监测细胞学变化后才能明确判断。根据CD1和C57Bl/6小鼠从发情期成功过渡至假孕状态的结果（成功率&#62;80%），该方法预期适用于胚胎移植受体的筛选。初步结果显示，采用有限的非手术胚胎移植已取得良好效果。总体而言，非手术胚胎移植的效率与手术法相当4,5，且在囊胚阶段可替代手术移植。对于更早期的胚胎，则需先进行胚胎培养至囊胚阶段。然而，若倾向于采用手术移植，也可调整细胞学检测的时间，以匹配获得合适假孕受体所需的正确时机2。通常情况下，胚胎受体的发育阶段比胚胎本身晚1天。例如，囊胚从供体的3.5 dpc（受精后天数）获取，并移植至2.5 dpc的受体中。因此，细胞学检测需安排在适当时间点，以确保受体处于比胚胎发育程度更低的假孕状态。
总之，本文所述的CM技术在与其他小鼠辅助生殖技术结合方面展现出良好的应用前景。我们已提供了采用非手术方法进行人工授精和胚胎移植的成功方案。综合来看，CM技术具有3R原则的优势，包括：（1）减少实验动物使用数量，无需使用输精管切除雄鼠；（2）优化技术流程，以非手术方法替代传统手术操作。

辅助生殖技术可用于制备基因修饰小鼠模型、从冷冻保存中恢复品系、对健康状况受损的品系进行重新繁育，以及包括生成年龄匹配队列在内的实验动物设施战略管理。所有小鼠辅助生殖技术均需要使用假孕雌性受体来支持胚胎发育。传统上，假孕受体通过与不育雄鼠交配获得，这些雄鼠通常经过手术结扎输精管或具有遗传性不育特性，并在次日早晨检查是否存在交配栓1。最近，已开发出一种用于原核期或两细胞小鼠胚胎手术移植的声刺激方案2。我们还开发了一种宫颈操作（CM）方案，可用于人工授精及囊胚的非手术胚胎移植。该方法的应用目的在于遵循“3R原则”，减少所需实验动物数量（不再需要雄鼠），并对技术进行优化（不再需要对雄鼠实施手术结扎输精管）。本文对该方案的描述同时包含了相关的辅助生殖技术，以帮助将CM整合到常规工作流程中。CM方法的总体目标是取代在辅助生殖技术（包括人工授精和胚胎移植）中为获得假孕雌鼠而使用雄鼠的做法。
本文所述的CM方案最初是为了辅助小鼠的人工授精而开发的。最初描述的人工授精方案可达到50%的妊娠率，平均每窝产仔7只3。CD1受体小鼠在授精前47小时，通过低剂量激素（包括孕马血清促性腺激素（PMSG）和人绒毛膜促性腺激素（hCG））进行动情周期同步化处理。动情周期同步化的一个优势在于，可使该方案在正常工作时间内进行。人工授精后，立即让雌鼠与输精管结扎的雄鼠合笼，通过观察到交配栓的存在来确认交配成功。据报道，受体鼠交配率不稳定是该操作中的一个难点。因此，研究人员寻求了除交配以外的其他方法来诱导假孕状态。
本研究介绍了一种标准化的宫颈刺激（CM）技术，以提高假孕雌性动物制备的效率。对于处于动情期或动情前期的雌性动物，将小型塑料棒的钝端经阴道插入至宫颈部位，并通过与剃须刀接触振动30秒。该操作在顶部为金属网的笼具上进行，无需使用麻醉或镇痛药物。CM技术操作简便，可用于制备假孕雌性动物，使其在接受非手术人工授精后能够产下幼仔，而无需与输精管结扎雄鼠交配。此外，CM技术也可用于制备作为胚胎移植受体的假孕雌性动物。具体而言，CM技术可与本文所述的非手术胚胎移植方法联合使用。已有研究表明，非手术方法在小鼠4,5和大鼠6,7囊胚期胚胎移植中具有良好的效果。由于该非手术方法是手术法的有效替代方案，因此被视为符合3R原则的技术优化。根据既往研究，以粪便皮质酮水平作为应激指标的结果表明，该非手术操作不会增加啮齿类动物的应激水平7,8。该操作技术难度低于手术胚胎移植，且操作速度显著更快。由于胚胎被直接移植至子宫，&#160;因此必须选择适合子宫发育阶段的胚胎进行移植。对于小鼠，应将囊胚移植至交配后2.5天（dpc）的假孕受体中。
本文所述两种非手术技术中，激素给药与交配控制（CM）技术的实施时机有所不同。相对于发情期的CM操作时间对成功至关重要，因为该操作替代了自然交配，用于制备假孕受体。通过消除对输精管结扎雄性动物诱导假孕的需求，该方法在减少实验动物使用数量的同时，避免了对雄性动物进行外科手术改造，从而实现了3R原则的福利优势。该操作本身快速（30秒），无需麻醉或镇痛处理。该技术显著提高了在辅助生殖过程中获得假孕雌性动物的可靠性和可预测性。

<table><tbody><tr><td>囊胚期胚胎</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CARD Fertiup 预孵育培养基（PM）</td><td>CosmoBio</td><td>KYD-002-EX</td><td>用于精子获能</td></tr><tr><td>胚胎操作移液管</td><td>Cook Medical</td><td>K-FPIP-1120-10BS</td><td>Flexipet 提供多种直径规格</td></tr><tr><td>胚胎操作移液管组件</td><td>Paratechs</td><td>90010</td><td></td></tr><tr><td>雌性小鼠，Crl:CD1(ICR)</td><td>Charles River Laboratories</td><td>22</td><td>&gt;8 周龄</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11053-10</td><td>带齿，用于解剖</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11052-10</td><td>弯头，用于解剖</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>Dumont #5</td><td>精细，用于解剖</td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Fisher Scientific</td><td>267110</td><td>可选</td></tr><tr><td>人绒毛膜促性腺激素（hCG）</td><td>Prospec</td><td>hor-250</td><td>用于动情周期同步</td></tr><tr><td>培养箱，37 &amp;deg;C，5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>台式培养箱，37 &amp;deg;C</td><td>Cook</td><td>K-MINC-1000</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes 纸巾</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td>吸水性擦拭纸</td></tr><tr><td>M2 培养基</td><td>Millipore</td><td>MR-015-D</td><td>胚胎操作用培养液</td></tr><tr><td>雄性小鼠，Crl:CD1(ICR)</td><td>Charles River Laboratories</td><td>22</td><td>&gt;8 周龄</td></tr><tr><td>mC&amp;I 装置</td><td>ParaTechs</td><td>60020</td><td>用于精子转移，包含扩张器</td></tr><tr><td>mCM 棒</td><td>ParaTechs</td><td>90050</td><td>表面光滑、钝端，直径约 3 mm</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td>20× 和 40× 放大倍数，配备透射与反射光源，适用于胚胎操作和解剖</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>ACCU-SCOPE</td><td>3032</td><td>100× 放大倍数，配备明场照明</td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>mNSET 装置</td><td>ParaTechs</td><td>60010</td><td>用于胚胎移植，包含扩张器</td></tr><tr><td>针头，26 G</td><td>Exel</td><td>26402</td><td></td></tr><tr><td>Papanicolaou 染色系统</td><td>VWR</td><td>76265-730</td><td>可选</td></tr><tr><td>石蜡油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18512</td><td></td></tr><tr><td>移液器，P200</td><td>Corning</td><td>4074</td><td>适配 C&amp;I 装置用于精子转移</td></tr><tr><td>移液器，PR-2</td><td>Rainin</td><td>17008648</td><td>适配 NSET 装置用于胚胎移植</td></tr><tr><td>孕马血清促性腺激素（PMSG）</td><td>Prospec</td><td>hor-272</td><td>用于动情周期同步</td></tr><tr><td>电子天平</td><td>American Weigh Scales</td><td>LB-1000</td><td></td></tr><tr><td>剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14068-12</td><td>用于解剖</td></tr><tr><td>剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14081-09</td><td>斜口，用于解剖</td></tr><tr><td>棉签，Constix</td><td>Contec</td><td>SC-4</td><td>用于阴道细胞学检查</td></tr><tr><td>注射器，1 cc</td><td>Becton Dickenson and Company</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>组织培养皿，35 mm</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>组织培养皿，60 mm</td><td>Falcon</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>动物毛发修剪器</td><td>Wahl</td><td>ChroMini T-Cut</td><td></td></tr><tr><td>带网盖小鼠笼</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

无需使用输精管结扎雄鼠诱导雌鼠假孕以进行非手术胚胎移植或人工授精

Inducing Pseudopregnancy in Female Mice Without the Need for Vasectomized Males Prior to Non-Surgical Embryo Transfer or Artificial Insemination

为了通过胚胎移植或人工授精成功维持妊娠，&#160;雌性受体小鼠必须被诱导进入假孕状态。传统方法是将雌鼠与输精管结扎的雄鼠过夜配对，次日清晨检查是否存在交配栓。为了提高获得假孕雌鼠的效率，目前已标准化了一种宫颈操作技术，可与小鼠的非手术胚胎移植或人工授精技术联合使用。该方法将小型塑料棒的钝端经阴道插入至宫颈部位，并通过与剃须刀接触振动30秒。该操作快速，无需麻醉或镇痛。该技术提高了获得假孕雌鼠的可靠性和可重复性，并完全避免了对输精管结扎雄鼠的需求。在CD1小鼠中，采用宫颈操作诱导假孕的成功率为83%（处于动情期的雌鼠，N = 76），而使用输精管结扎雄鼠交配时，仅有38%的动情期雌鼠形成交配栓（N = 24）。在CD1小鼠中实施人工授精时，通过激素同步动情周期、进行宫颈操作并经子宫内注入精子完成。接受宫颈操作的人工授精受体雌鼠（N = 76）妊娠率达到72%，平均每窝产仔数为8.3只。该方法也可用于为非手术胚胎移植制备假孕雌鼠。因此，在实施非手术辅助生殖技术时，通过宫颈操作诱导假孕是一种简便且高效的替代方案，可取代与输精管结扎雄鼠交配的方法。采用宫颈操作在辅助生殖技术中具有3R（替代、减少和优化）优势，能够减少所需实验动物数量，并消除对经手术改造雄鼠的依赖。

由于电刺激9和声刺激10宫颈已被用于在大鼠中诱导假孕，本研究提出了一种可在小鼠中应用的标准化机械操作方法。阴道细胞学检测有助于识别处于不同动情周期阶段的雌性小鼠。为确认雌性小鼠是否进入假孕状态，也采用了相同的方法。首先，比较了CD1和C57Bl/6小鼠在整个动情周期、妊娠期以及交配或机械刺激（CM）诱导的假孕期的阴道细胞学图谱。采集雌性小鼠的阴道拭子样本，并使用巴氏染色系统进行染色（见材料表）。在明场照明下以100倍放大倍数观察细胞。所观察到的细胞类型包括白细胞、有核上皮细胞和无核角化上皮细胞。动情周期阶段的判定依据是各类细胞所占的相对百分比11,12。动情期以角化上皮细胞占主导为特征。当动情期结束时，动情后期开始，白细胞开始出现，而角化上皮细胞逐渐减少。动情间期细胞数量中等至较低，以白细胞为主，同时开始出现有核上皮细胞。动情前期的特征是白细胞消失，有核上皮细胞增多，并出现角化上皮细胞。动情前期结束后进入动情期，周期随之继续。
为建立基础特征谱，每只雌性小鼠（CD1品系N = 20，C57Bl/6品系N = 20）在交配前均记录至少两个完整的动情周期的阴道细胞学数据。小鼠之间的周期长度和个体谱型存在差异；然而，观察到了预期的总体趋势。CD1和C57Bl/6小鼠动情周期的平均长度为3.8天，范围为3至5天。在自然交配发生前一天，所有雌性小鼠均处于动情前期。交配后，自交配后1.5天（dpc）起再次进行细胞学检查，直至动情周期恢复。图2展示了与输精管结扎雄鼠交配后假孕的CD1和C57Bl/6雌性小鼠的细胞学谱型。
<img alt="比较 CD1 和 C57BL/6 品系在不同交配后天数（DPC）期间细胞类型百分比的柱状图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65477/65477fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：假孕雌性小鼠的细胞学特征。 显示了白细胞、有核上皮细胞和角化上皮细胞在交配后天数（DPC）过程中的平均百分比变化，分别对应于（A）CD1（N = 20）和（B）C57Bl/6（N = 20）小鼠。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65477/65477fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
本研究建立了一种标准化的宫颈刺激（CM）技术，以提高假孕雌性动物制备的效率。对于处于动情期或动情前期的雌性小鼠，将一根小型塑料棒的钝端经阴道插入至接触宫颈部位，并通过与剃须刀接触使其振动30秒。该操作在顶部为金属网的笼具上进行，无需使用麻醉或镇痛药物。为评估CM操作的有效性，比较了雌性CD1（N = 20）和C57Bl/6（N = 20）小鼠在与输精管结扎雄鼠交配后以及接受CM处理后（总计N = 40）的阴道细胞学特征。结果显示，由CM诱导的假孕细胞学图谱与交配诱导的假孕图谱相似，如图3所示。
<img alt="细胞类型百分比图表；比较交配和宫颈操作后的白细胞、上皮细胞、角化细胞。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65477/65477fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图3：宫颈操作（CM）后假孕雌性小鼠的细胞学特征。 白细胞、有核上皮细胞和角化上皮细胞各类细胞的百分比以交配后天数（DPC）或宫颈操作后天数（DPCM）为函数进行展示。图中显示了CD1和C57Bl/6小鼠（N = 40）与输精管结扎雄鼠交配（A）或仅接受宫颈操作（B）后的平均细胞类型百分比。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65477/65477fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
为了确定宫颈刺激（CM）技术是否足以在辅助生殖过程中建立妊娠，本研究在CD1品系雌性小鼠中，将CM作为非手术人工授精（NSAI）方案的一部分进行操作。人工授精方案包括在精子移植前，使用低剂量的PMSG和hCG激素对雌性小鼠进行动情周期同步化处理。CM在精子移植前立即实施。对于处于动情期的CD1小鼠（N = 76），采用该技术通过CM诱导假孕的成功率为83%。在对照实验中，仅38%的动情期雌性小鼠（N = 24）与输精管结扎雄鼠交配后形成阴栓。接受宫颈刺激的人工授精受体（N = 76）妊娠率为72%，平均每窝产仔8.3只。因此，在进行非手术人工授精时，采用CM诱导假孕是一种简便且高效的替代与输精管结扎雄鼠交配的方法。使用CM处理处于动情期的CD1受体（N = 4），并进行新鲜CD1囊胚的非手术胚胎移植，实现了100%的妊娠率。移植9至15枚胚胎后，获得三窝健康仔鼠，出生率为45%，平均每窝6只。相比之下，通过与输精管结扎雄鼠交配以诱导假孕的CD1受体（N = 20），在移植20枚新鲜B6C3F2囊胚后，妊娠率为80%，出生率为46%。
辅助生殖技术的结果可能具有品系特异性，因为超数排卵过程中激素给药的剂量和时间等变量已被发现依赖于小鼠品系13。此外，受体的年龄和体重等因素也会影响其对激素的反应14。在本研究中，进行宫颈刺激（CM）人工授精时，仅处于晚发情前期或发情期的雌性小鼠表现出反应性。通常，为了增加群体中可用受体的数量，首先使用低剂量激素对雌性小鼠进行发情同步化处理3。在本研究中，使用2.5 IU的PMSG和hCG对11–14周龄的CD1雌性小鼠（N = 27）进行发情同步化，有效率为78%；对18–32周龄的C57Bl/6雌性小鼠（N = 22）的有效率为60%。采用宫颈刺激法诱导CD1发情期雌性小鼠（N = 76）假孕的成功率为83%，对C57Bl/6发情期雌性小鼠（N = 100）的成功率为82%。

本文介绍的宫颈操作方法可诱导小鼠假孕，无需使用输精管结扎雄鼠与雌鼠交配。假孕的诱导对于非手术胚胎移植和非手术人工授精的成功至关重要，这两种技术在本文中均有介绍。

为成功通过胚胎移植或人工授精维持妊娠，必须将雌性受体小鼠诱导至假孕状态……

我们的主要研究方向是开发辅助生殖技术，以实现动物实验“3R原则”中的优化与减量。我们已建立了小鼠的非手术胚胎移植和非手术人工授精技术，以及大鼠的非手术胚胎移植技术。结合用于获得假孕雌鼠的宫颈操作技术，我们在啮齿类动物中实现了符合3R原则的改进与辅助生殖技术的应用。本文所述方案提供了利用非手术胚胎移植和人工授精方法在小鼠中高效获得仔鼠的简化流程。宫颈操作方案优化了用于辅助生殖技术的假孕雌性受体的制备步骤，减少了作为假孕受体所需的雌性个体数量，并消除了对结扎输精管雄性小鼠的需求。此处概述的方案可用于实验动物设施的策略性管理。这些方案可与冷冻保存、体外受精、重新繁育、年龄匹配队列的制备以及基因修饰动物的制备相结合使用。为开始进行细胞学评估以确认ESRA周期同步，使用预先湿润的小棉签轻轻在CD1小鼠阴道壁上滚动，收集阴道细胞。将收集的阴道细胞涂抹在载玻片上20微升无菌水的液滴中，然后空气干燥。在显微镜下，使用100倍放大倍数和明场照明，观察是否存在角化上皮细胞。对于宫颈操作，将受体雌鼠放置在带有金属网架的笼子顶部，于授精前约0.5小时开始，使小鼠能够抓紧笼子的栏杆表面。用拇指和食指抓住小鼠尾部基部，将尾部向上倾斜以固定动物。将一根小型塑料棒的钝端插入阴道，接触宫颈，并通过与震颤装置接触振动30秒。进行非手术精子移植以实施人工授精时，将授精装置置于调至40 µL的P200移液器上，并取下保护盖。从置于37摄氏度、5%二氧化碳环境中的获能精子样品中取出一份等分试样，转移至37摄氏度下无油的35毫米组织培养皿中。将移液器按钮压至第一档位，将导管尖端插入精子样品中，缓慢吸取40 µL样品至转移装置内。将移液器放置一旁前，使用吸水纸擦拭授精装置外部残留的油渍。接着，将受体雌鼠置于金属丝网笼盖上。用拇指和食指捏住雌鼠尾根部将其固定，使尾部向上倾斜，同时稳定动物体位。将小型窥阴器置入阴道，将授精装置导管经窥阴器通过宫颈插入子宫。当装置接头接触窥阴器时，按下移液器推杆至第一停点以释放精子。操作完成后，取出授精装置及窥阴器。在第6天对CD1小鼠进行非手术胚胎移植，将20微升M2培养基滴加到组织培养皿的盖子上。在显微镜下使用反射光源，用标准的胚胎操作移液管将10至20个囊胚转移到M2培养基液滴中。将非手术胚胎移植装置固定在设定为1.8微升的P2移液器上，并取下保护性导管套。将移液器的推杆按压至第一档，将导管尖端插入培养基中，然后缓慢将胚胎吸入装置的导管尖端内。随后将导管从培养基中取出。接下来，将移液器体积调至 2.0 µL，在导管尖端处形成一个小的气泡。将装有胚胎的移液器轻轻放置在小鼠笼旁。将受体雌鼠放在金属丝网笼顶上，用食指和拇指捏住其尾根部以固定小鼠位置，同时将尾巴向上倾斜以稳定动物。将一个小的阴道扩张器插入阴道，然后将移植装置导管经扩张器通过宫颈插入子宫。当装置手柄接触窥器时，按下移液器按钮至第一档，释放胚胎。避免将额外空气注入子宫角。取出装置和窥器。

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