无需使用输精管结扎雄鼠诱导雌鼠假孕以进行非手术胚胎移植或人工授精

我们的主要研究方向是开发辅助生殖技术，以实现动物实验“3R原则”中的优化与减量。我们已建立了小鼠的非手术胚胎移植和非手术人工授精技术，以及大鼠的非手术胚胎移植技术。结合用于获得假孕雌鼠的宫颈操作技术，我们在啮齿类动物中实现了符合3R原则的改进与辅助生殖技术的应用。

本文所述方案提供了利用非手术胚胎移植和人工授精方法在小鼠中高效获得仔鼠的简化流程。宫颈操作方案优化了用于辅助生殖技术的假孕雌性受体的制备步骤，减少了作为假孕受体所需的雌性个体数量，并消除了对结扎输精管雄性小鼠的需求。

此处概述的方案可用于实验动物设施的策略性管理。这些方案可与冷冻保存、体外受精、重新繁育、年龄匹配队列的制备以及基因修饰动物的制备相结合使用。为开始进行细胞学评估以确认ESRA周期同步，使用预先湿润的小棉签轻轻在CD1小鼠阴道壁上滚动，收集阴道细胞。

将收集的阴道细胞涂抹在载玻片上20微升无菌水的液滴中，然后空气干燥。在显微镜下，使用100倍放大倍数和明场照明，观察是否存在角化上皮细胞。对于宫颈操作，将受体雌鼠放置在带有金属网架的笼子顶部，于授精前约0.5小时开始，使小鼠能够抓紧笼子的栏杆表面。

用拇指和食指抓住小鼠尾部基部，将尾部向上倾斜以固定动物。将一根小型塑料棒的钝端插入阴道，接触宫颈，并通过与震颤装置接触振动30秒。进行非手术精子移植以实施人工授精时，将授精装置置于调至40 µL的P200移液器上，并取下保护盖。

从置于37摄氏度、5%二氧化碳环境中的获能精子样品中取出一份等分试样，转移至37摄氏度下无油的35毫米组织培养皿中。将移液器按钮压至第一档位，将导管尖端插入精子样品中，缓慢吸取40 µL样品至转移装置内。

将移液器放置一旁前，使用吸水纸擦拭授精装置外部残留的油渍。接着，将受体雌鼠置于金属丝网笼盖上。用拇指和食指捏住雌鼠尾根部将其固定，使尾部向上倾斜，同时稳定动物体位。

将小型窥阴器置入阴道，将授精装置导管经窥阴器通过宫颈插入子宫。当装置接头接触窥阴器时，按下移液器推杆至第一停点以释放精子。操作完成后，取出授精装置及窥阴器。

在第6天对CD1小鼠进行非手术胚胎移植，将20微升M2培养基滴加到组织培养皿的盖子上。在显微镜下使用反射光源，用标准的胚胎操作移液管将10至20个囊胚转移到M2培养基液滴中。将非手术胚胎移植装置固定在设定为1.8微升的P2移液器上，并取下保护性导管套。

将移液器的推杆按压至第一档，将导管尖端插入培养基中，然后缓慢将胚胎吸入装置的导管尖端内。随后将导管从培养基中取出。接下来，将移液器体积调至 2.0 µL，在导管尖端处形成一个小的气泡。

将装有胚胎的移液器轻轻放置在小鼠笼旁。将受体雌鼠放在金属丝网笼顶上，用食指和拇指捏住其尾根部以固定小鼠位置，同时将尾巴向上倾斜以稳定动物。将一个小的阴道扩张器插入阴道，然后将移植装置导管经扩张器通过宫颈插入子宫。

当装置手柄接触窥器时，按下移液器按钮至第一档，释放胚胎。避免将额外空气注入子宫角。取出装置和窥器。