Name: 一种适用于表征放线菌噬菌体感染的基于光密度的微孔板测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T12:45:00.000+00:00
Duration: 3 min 33 s
Description: 了解基于光密度的微孔板测定方法，用于表征放线菌噬菌体感染动态。该技术可实现慢生长细菌与噬菌体的长期共培养，生成生长曲线等感染指标，为研究噬菌体与宿主协同进化提供可靠工具。

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本研究得到了美国国家科学基金会DBI生物学综合研究所（BII）项目（资助号：2119968；首席研究员：Ceballos）以及阿肯色州INBRE项目的支持，后者资助来自美国国立卫生研究院下属的国立普通医学科学研究所（NIGMS），项目编号P20 GM103429。作者同时感谢奥阿希塔浸信会大学Patterson暑期本科生研究项目提供的支持。

尽管本实验方案是针对 Gordonia terrae 编写的，但也已成功应用于 Gordonia lacunae、Gordonia rubripertincta 和 Gordonia westfalica。
1. 细菌制备
<ol>
	<li>在生物安全柜中，采用良好的微生物操作规范17 接种单个菌落 Gordonia terrae 将CAG3转入含200 mL蛋白胨酵母钙肉汤的1 L无菌带挡板烧瓶中18(PYCa) 培养基中含 0.01 mg/mL 放线菌酮（见 材料表).</li>
	<li>在30 °C、250 rpm振荡条件下培养烧瓶，直至菌液达到饱和状态或培养3天7.</li>
	<li>连续稀释饱和溶液 G. terrae 在PYCa肉汤中培养，并分别取100 µL的10⁻⁶稀释液涂布平板−4, 10−5，和10−6 PYCa 平板上的稀释19,20将未稀释的饱和培养物置于4 °C冰箱中冷藏。</li>
	<li>将涂布平板倒置于30 °C培养3天。</li>
	<li>孵育后，鉴定一个 &#34;可计数平板&#34;，选择一个含有20-200个菌落的平板。计数该平板上的菌落数量，并计算每毫升的菌落形成单位（cfu/mL）19,20.</li>
	<li>用PYCa肉汤将饱和培养物稀释至4.0 x 106 cfu/mL 细菌</li>
</ol>
2. 噬菌体的制备
注意：所报告的代表性结果使用的是溶原性噬菌体 Gordonia phage DelRio21 获得的，该噬菌体分离自 G. terrae。这些方法也已成功应用于其他 Gordonia 噬菌体。
<ol>
	<li>从分离的噬菌体开始，用噬菌体缓冲液对噬菌体样品进行系列稀释7 至 1 × 10−8 稀释。进行双层琼脂噬菌体滴定实验7 通过感染0.3 mL的饱和培养物 G. terrae 加入10 µL每种噬菌体稀释液进行培养。室温孵育5-10分钟后，将细菌-噬菌体混合物与3 mL PYCa顶层琼脂混合，倾注至PYCa琼脂平板上。</li>
	<li>将平板倒置于30 °C培养3天，或培养至噬菌斑形成7.</li>
	<li>孵育后，鉴定一个 &#34;可计数平板&#34;，选择一个含有20-200个噬菌斑的平板。计数该平板上的噬菌斑数量，并计算每毫升噬菌斑形成单位（pfu/mL）7.</li>
</ol>
3. 微孔板制备
注意：本方法应使用平底96孔微孔板（参见材料表）。所有板的制备和加样操作必须在生物安全柜中进行，并应遵循良好的微生物操作规范17。
<ol>
	<li>通过将100 µL Triton-X 100、40 mL 100%异丙醇和160 mL去离子水混合，配制防雾盖涂层溶液22。搅拌混匀后，室温保存。</li>
	<li>在生物安全柜中，将6 mL涂层溶液加入无菌96孔微孔板盖的内表面，用手捏住盖子边缘并旋转，确保溶液覆盖整个内表面。让溶液在盖上静置20秒，然后倒出溶液，将盖子倒置在高压灭菌的纸巾上并倾斜放置，直至完全干燥，通常需要35–45分钟。操作时务必仅捏住盖子边缘。</li>
	<li>为每个96孔微孔板配制20 mL 0.1%琼脂糖水溶液，使用微波炉加热至琼脂糖完全溶解。</li>
	<li>当琼脂糖溶液冷却至50–60 °C时，用移液器向板上各孔之间的所有空隙加入100 µL 0.1%琼脂糖，并向A行、H行以及第1、2、11和12列的孔中各加入200 µL琼脂糖23（图1）。</li>
</ol>
4. 用细菌和噬菌体加样到平板
注意：所有平板制备和加样操作必须在生物安全柜中进行，并应遵循良好的微生物操作规范17。
<ol>
	<li>96 孔板中每孔将含有 75 µL 浓度为 2.0 × 106 cfu/mL 的细菌9。将浓度为 4.0 × 106 cfu/mL 的细菌培养物用 2× PYCa 培养基按 1:1 比例稀释，得到浓度为 2.0 × 106 cfu/mL 的菌液。每块 96 孔板准备 5 mL。</li>
	<li>使用噬菌体缓冲液7 对噬菌体裂解液进行稀释，分别配制 1 mL 浓度为 2.0 × 106 pfu/mL、2.0 × 105 pfu/mL 和 2.0 × 104 pfu/mL 的溶液。这将在微孔板中实现感染复数（MOI）分别为 1、0.1 和 0.01 的条件9。</li>
	<li>在加样时，取已用防雾溶液和琼脂糖处理过的 96 孔板，按照 图 1 所示，向第 3 至第 10 列每孔加入 75 µL 浓度为 2.0 × 106 cfu/mL 的细菌溶液。</li>
	<li>向第 3 列和第 4 列的每孔中各加入 75 µL 无菌噬菌体缓冲液，作为无噬菌体的阳性对照，操作参照 图 1，每次加样后需上下吹打混匀。向第 5 列和第 6 列每孔加入 75 µL 浓度为 2.0 × 106 pfu/mL 的噬菌体，向第 7 列和第 8 列每孔加入 75 µL 浓度为 2.0 × 105 pfu/mL 的噬菌体，向第 9 列和第 10 列每孔加入 75 µL 浓度为 2.0 × 104 pfu/mL 的噬菌体，每次加样后均需上下吹打混匀。</li>
	<li>使用 0.5 英寸标签胶带封闭板子的两个短边，以部分密封微孔板，同时允许气体交换。</li>
</ol>
5. 孵育与吸光度测定
<ol>
	<li>将细菌和噬菌体加入平板后，置于微孔板摇床中，以 250 rpm 振荡，并在 30 °C 下孵育。</li>
	<li>孵育平板 96 小时，从第 16 小时开始，每隔 8 小时使用微孔板读板仪在 600 nm 处测定一次光密度。每次测定后将平板放回摇床继续振荡。 
	注意：已评估从感染后 0 小时开始、间隔 4 小时、6 小时、8 小时和 12 小时的测量周期，结果表明，从感染后 16 小时开始、每 8 小时取样一次，最能准确反映 Gordonia 与噬菌体之间的相互作用。</li>
	<li>在整个实验过程中监测盖子上的冷凝情况。若观察到冷凝现象，应更换为按照步骤 3.2 所处理的另一新盖子。</li>
	<li>按照第 6 节实验方案绘制对照组和感染组的生长曲线。</li>
</ol>
6. 数据分析
<ol>
	<li>使用电子表格程序计算每种噬菌体稀释度的平均值和标准差，电子表格布局参照 Stacy-Ceballos-Index GitHub 仓库（https://github.com/eichristenson/Stacy-Ceballos-Index）中的设置。</li>
	<li>使用 R 软件（见材料表）并加载 DescTools24、dplyr25、ggplot226 和 readxl27 软件包，结合 Stacy-Ceballos-Index GitHub 仓库（https://github.com/eichristenson/Stacy-Ceballos-Index）中的 R 脚本，绘制对照组和感染组的生长曲线，并计算感染相关指标。
	<ol>
		<li>AUCcon 表示未感染对照组曲线下的面积，AUCinf 表示感染组曲线下的面积16。先计算曲线下面积（AUC），然后根据曲线下面积值计算基于面积的生长抑制率 PIAUC16，计算公式如下： 
		(&#8203;1&#160;- [AUCinf/AUCcon]) × 100</li>
		<li>每条曲线上虚线水平线表示最大生长量，未感染组的最大生长量标记为 Nasymptote(con) ，感染组的最大生长量标记为 Nasymptote(inf)。确定 Nasymptote 的数值后，基于这些峰值计算生长抑制率 PImax16，计算公式如下： 
		(1&#160;- [Nasymptote(inf)/ Nasymptote(con)]) × 100</li>
		<li>根据 PIAUC 和 PImax 的值计算 Stacy-Ceballos 指数 ISC16，计算方法如下： 
		(PIAUC × PImax)0.5 
		通过将 Stacy-Ceballos 指数对时间积分，计算相对毒力16。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Characterizing Actinobacteriophage Infection Using an Adapted Optical Density Assay

<ol><li>Mushegian, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+there+1031+virus+particles+on+Earth%2C+or+more%2C+or+fewer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Are there 1031 virus particles on Earth, or more, or fewer.</a> Journal of Bacteriology. 202 (9), e00052-e00020 (2020).</li>
<li>Chevallereau, A., Pons, B. J., van Houte, S., Westra, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+bacterial+and+phage+communities+in+natural+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Interactions between bacterial and phage communities in natural environments.</a> Nature Reviews Microbiology. 20 (1), 49-62 (2022).</li>
<li>Olszak, T., Latka, A., Roszniowski, B., Valvano, M. A., Drulis-Kawa, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+life+cycles+behind+bacterial+biodiversity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Phage life cycles behind bacterial biodiversity.</a> Current Medicinal Chemistry. 24 (36), 3987-4001 (2017).</li>
<li>Weitz, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage-bacteria+infection+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Phage-bacteria infection networks.</a> Trends in Microbiology. 21 (2), 82-91 (2013).</li>
<li>Turner, P. E., Draghi, J. A., Wilpiszeski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+of+growth+differences+among+phage+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis of growth differences among phage strains.</a> Journal of Microbiological Methods. 88 (1), 117-121 (2012).</li>
<li>Storms, Z. J., Teel, M. R., Mercurio, K., Sauvageau, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+virulence+index%3A+A+metric+for+quantitative+analysis+of+phage+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22PHAGE%22%5BJournal%5D)">The virulence index: A metric for quantitative analysis of phage virulence.</a> PHAGE. 1 (1), 27-36 (2020).</li>
<li>Poxleitner, M., Pope, W., Jacobs-Sera, D., Sivanathan, V., Hatfull, G. Phage Discovery Guide. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://seaphagesphagediscoveryguide.helpdocsonline.com/home">https://seaphagesphagediscoveryguide.helpdocsonline.com/home</a> (2012).</li>
<li>Martinez-Soto, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHIDA%3A+A+high+throughput+turbidimetric+data+analytic+tool+to+compare+host+range+profiles+of+bacteriophages+isolated+using+different+enrichment+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">PHIDA: A high throughput turbidimetric data analytic tool to compare host range profiles of bacteriophages isolated using different enrichment methods.</a> Viruses. 13 (11), 2120-2137 (2021).</li>
<li>Rajnovic, D., Muñoz-Berbel, X., Mas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+phage+detection+and+quantification%3A+An+optical+density-based+approach%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Fast phage detection and quantification: An optical density-based approach.</a> PLoS One. 14 (5), e0216292(2019).</li>
<li>Xie, Y., Wahab, L., Gill, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+microtiter+plate-based+assay+for+determination+of+bacteriophage+host+range+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a microtiter plate-based assay for determination of bacteriophage host range and virulence.</a> Viruses. 10 (4), 189-204 (2018).</li>
<li>Sørensen, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+in+vitro+phage-host+population+growth+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Classification of in vitro phage-host population growth dynamics.</a> Microorganisms. 9 (12), 2470-2486 (2021).</li>
<li>Konopacki, M., Grygorcewicz, B., Dołęgowska, B., Kordas, M., Rakoczy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PhageScore%3A+A+simple+method+for+comparative+evaluation+of+bacteriophages+lytic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Engineering+Journal%22%5BJournal%5D)">PhageScore: A simple method for comparative evaluation of bacteriophages lytic activity.</a> Biochemical Engineering Journal. 161, 107652(2020).</li>
<li>Holt, J. G., Krieg, N. R., Sneath, P. H. A., Staley, J. T., Williams, S. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHolt%2C+JG+%22Bergey%27s+Manual+of+Determinative+Bacteriology.%2C+9th+edition%22">Bergey's Manual of Determinative Bacteriology., 9th edition</a>. , Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia, PA. (1994).</li>
<li>Fusconi, R., Godinho, M. J. L., Bossolan, N. R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+exopolysaccharide+production+from+sugarcane+molasses+by+Gordonia+polyisoprenivorans+CCT+7137%2C+isolated+from+contaminated+groundwater+in+Brazil%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Culture and exopolysaccharide production from sugarcane molasses by Gordonia polyisoprenivorans CCT 7137, isolated from contaminated groundwater in Brazil.</a> World Journal of Microbiology and Biotechnology. 24 (7), 937-943 (2007).</li>
<li>Bujold, A. R., Lani, N. R., Sanz, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-to-strain+variation+of+Rhodococcus+equi+growth+and+biofilm+formation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Strain-to-strain variation of Rhodococcus equi growth and biofilm formation in vitro.</a> BMC Research Notes. 12 (1), 519(2019).</li>
<li>Ceballos, R. M., Stacy, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+relative+virulence%3A+When+%C2%B5max+fails+and+AUC+alone+just+is+not+enough%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Quantifying relative virulence: When µmax fails and AUC alone just is not enough.</a> Journal of General Virology. 102 (1), 001515(2021).</li>
<li>Siddiquee, S. The basic concept of microbiology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSiddiquee%2C+S+%22Practical+Handbook+of+the+Biology+and+Molecular+Diversity+of+Trichoderma+Species+from+Tropical+Regions%22">Practical Handbook of the Biology and Molecular Diversity of Trichoderma Species from Tropical Regions</a>. , Springer. Cham, Switzerland. 1-15 (2017).</li>
<li>Petrovski, S., Seviour, R. J., Tillett, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+and+characterization+of+the+Tsukamurella+bacteriophage+TPA2%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Genome sequence and characterization of the Tsukamurella bacteriophage TPA2.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (4), 1389-1398 (2011).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

这种基于光密度的微孔板方法可用于研究噬菌体的宿主范围和感染动态11，并展示了Stacy-Ceballos指数16作为衡量噬菌体毒力指标的有效性。尽管该方法可适用于任何噬菌体-宿主系统，但其设计初衷是专门针对生长较慢的细菌（如放线菌）对快速微孔板生长检测法9,10,11进行优化。对于生长缓慢的细菌，若不进行针对蒸发和盖板冷凝问题的改进，便无法使用快速微孔板检测法。本方法详细描述了这些必要的改进措施，并首次展示了如何利用Stacy-Ceballos指数及相关指标16来描述噬菌体感染过程。
在多日96孔板生长曲线实验中，蒸发可能是一个重大挑战；本方法通过在边缘孔及孔间区域添加琼脂糖来解决这一问题。结合防雾盖处理22，琼脂糖边缘可在微孔板内维持必要的湿度，从而实现可靠的光密度测量。若缺乏额外湿度，在所需的长时间孵育过程中会发生显著的边缘效应蒸发23，导致光密度读数虚高。防雾盖处理是一项必要的改进，因为盖子上的冷凝水同样会人为抬高光密度值。在孵育期间振荡微孔板是一项推荐的改进措施，因为放线菌在生长过程中可能发生聚集，导致光密度值虚高，并有效降低感染复数。
在表征感染动态的实验中，细菌与噬菌体的比例至关重要，因为噬菌体的数量必须足够以显示出感染效应，但又不能过多，以免宿主细菌种群立即崩溃9，或溶原化频率显著升高28。在本方法中，获得稳定结果的最有效比例为感染复数（MOI）等于1，但使用MOI为0.1和0.01时也可得到可用的结果。实施该方法时，建议选择一种细菌浓度，并在MOI范围为0.01–1的区间内测试多种噬菌体浓度9,10,11。
本文所述技术使得能够在高通量微孔板检测中评估噬菌体与宿主细菌的相互作用，而无需在每次测量时间点从较大的培养瓶中进行取样分析29。此外，通过展示如何改进微孔板生长检测方法9,10,11，该技术提高了其他基于微孔板的噬菌体检测方法在生长缓慢细菌研究中的适用性，包括噬菌体表征5,6,12和进化研究30,31。最后，本方法展示了如何使用Stacy-Ceballos指数16来描述噬菌体感染过程。该指标最初基于一种古菌病毒模型系统的数据开发，通过光密度值计算得出，因此在多种不同的病毒系统中具有广泛的应用价值。

噬菌体（或称噬菌体）是感染细菌的病毒。它们是地球上数量最多的生物实体1，普遍认为噬菌体影响细菌的进化过程和生态系统功能2,3,4。目前已有多种方法用于描述、测量和分析噬菌体的宿主范围8及感染动态5,6，包括基于琼脂的方法（如双层琼脂法）7和基于光密度的微量板法8,9,10,11,12。每种方法都有其优缺点。由于效率较高，采用双层琼脂法的涂布实验被公认为宿主范围测定的&#34;金标准&#34;，但该方法耗时且劳动强度大9。快速微量板法可在24小时或更短时间内获得结果，对于大肠杆菌（Escherichia coli）等生长迅速的细菌宿主可获得良好结果9,10,11,12，但对于放线菌等生长较慢的细菌宿主，该方法持续时间过短，难以充分展示噬菌体感染的动态进程7,13,14,15。
基于光密度的微孔板检测方法适用于快速生长的细菌，但在慢速生长的宿主细菌中，若需进行多天检测以表征感染动态，则会发生蒸发，导致细菌密度被高估。因此，要获得可比较的、关于噬菌体感染动态的高通量数据，必须针对慢速生长细菌采用专门优化的技术。
本文介绍的微孔板方法可减少蒸发，从而允许生长缓慢的细菌与噬菌体共培养长达96小时，便于研究噬菌体感染动态及宿主范围。该方法还展示了Stacy-Ceballos指数16，这是一种基于光密度的指标，可用于不同宿主-病毒系统间的毒力比较。

<table><tbody><tr><td>琼脂糖</td><td>Omni-Pur</td><td>2090</td><td>用于填充微孔板边缘孔&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Costar 96 孔板盖 低蒸发角切口</td><td>康宁</td><td>3931</td><td>替换用微孔板盖</td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Fisher Chemical</td><td>A461-4</td><td>用于盖子涂层</td></tr><tr><td>微孔板读板仪</td><td>Tecan Spark 20M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>带4位平台的微孔板摇床</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88-861-023</td><td>在孵育期间振荡培养板</td></tr><tr><td>非组织培养处理板 96孔</td><td>Falcon（康宁品牌）</td><td>351172</td><td>用于生长曲线测定的微孔板</td></tr><tr><td>胰蛋白胨酵母提取物钙（PYCa）琼脂</td><td>自制</td><td></td><td>1 克胰蛋白胨&lt;br/&gt; 15 g 酵母提取物&lt;br/&gt; 15 g 琼脂&lt;br/&gt; 990 mL dd H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 4.5 mL 1 M CaCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; 2.5 mL 40%葡萄糖&lt;br/&gt; 1 mL 10 mg/mL 放线菌酮</td></tr><tr><td>胰蛋白胨酵母提取物钙（PYCa）肉汤</td><td>自制，来自参考文献16</td><td></td><td>1 克胰蛋白胨&lt;br/&gt; 15 g 酵母提取物&lt;br/&gt; 990 mL dd H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 4.5 ml 1 M CaCl₂&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; 2.5 mL 40%葡萄糖&lt;br/&gt; 1 mL 10 mg/mL 放线菌酮</td></tr><tr><td>胰蛋白胨酵母提取物钙（PYCa）上层琼脂</td><td>自制</td><td></td><td>1 克胰蛋白胨&lt;br/&gt; 15 g 酵母提取物&lt;br/&gt; 4 g 琼脂&lt;br/&gt; 990 mL dd H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 4.5 mL 1M CaCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; 2.5 mL 40%葡萄糖</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td>用于测定细菌浓度和噬菌体滴度</td></tr><tr><td>噬菌体缓冲液</td><td>自制，来自参考文献7</td><td></td><td>10 mL 1 M Tris，pH 7.5&lt;br/&gt; 10 mL 1 M MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; 4 g NaCl&lt;br/&gt; 980 ml dd H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>R 软件</td><td>https://www.r-project.org/</td><td>4.3.0 版本</td><td></td></tr><tr><td>无菌一次性PETG锥形瓶 带挡板底 配通气盖</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4116-1000</td><td>用于细菌培养</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9036-19-5</td><td>用于盖子涂层</td></tr></tbody></table>

一种改良的基于光密度的微孔板检测法用于表征放线菌噬菌体感染

An Adapted Optical Density-Based Microplate Assay for Characterizing Actinobacteriophage Infection

噬菌体是自然环境中的重要组成部分，具有显著调控细菌种群的能力。为了理解单个噬菌体如何与放线菌等生长缓慢的细菌宿主相互作用，亟需一种简便且可靠的定量方法，用于检测噬菌体存在条件下细菌的长期生长情况。分光光度酶标仪可实现高通量的重复测量，但小体积样品长时间培养可能带来技术挑战。本实验方案对标准的96孔酶标板进行了优化，使其能够在不进行取样操作的情况下，连续共培养噬菌体与细菌达96小时，并每隔8小时利用分光光度吸光度值记录细菌生长情况。这些光密度值通过R语言进行分析，以获得包括生长抑制率、相对毒力以及Stacy-Ceballos指数在内的感染性指标。本文所述方法为开展和分析长时间酶标板生长曲线实验提供了有效途径，并包含了减少蒸发和盖子冷凝的改进措施。这些实验方案有助于基于酶标板开展生长缓慢的细菌宿主与其噬菌体之间相互作用的研究。

如果最终的生长曲线显示阳性对照细菌种群数量随时间增加，且吸光度无突然波动，则实验成功。MOI 为 1 时，分别在有和无 productive 噬菌体感染情况下的成功实验示例如图 2和图 3所示。MOI 为 0.01 时的 productive 感染情况见于图 4。在所有三幅图中观察到的阳性对照生长模式（绿色曲线）表明细菌正在正常生长，生长过程中未发生聚集，且无污染存在。单个时间点出现异常高的吸光度提示可能发生聚集或污染。在实验过程中，标准差通常会逐渐增大；然而，若标准差急剧上升，或对照组与感染组曲线的标准差出现重叠，则可能提示一个或多个孔中存在污染或聚集现象。
显示噬菌体有效感染的生长曲线（如图2所示）表明，加入噬菌体的孔中细菌吸光度随时间逐渐降低。如果该细菌不在噬菌体的宿主范围之内，则不会出现细菌密度的下降，如图3所示。
所有代表性实验的感染指标均显示，有效感染的实验中图2和图4的ISC相对较大，而未能有效感染宿主细菌的噬菌体在图3中的ISC 非常小。
<img alt="ELISA 板示意图，带有点状图案；蛋白质检测结果；检测；免疫检测测试。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65482/65482fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图 1：微孔板布局。 灰色区域填充有 0.1% 琼脂糖。第 3 列和第 4 列中的空白孔为无噬菌体的阳性对照孔，仅含有噬菌体缓冲液和 2.0 × 106 cfu/mL 细菌。点状孔含有噬菌体和 2.0 × 106 cfu/mL 细菌；第 5 列和第 6 列中的大点表示感染复数（MOI）为 1，噬菌体浓度为 2.0 × 106 pfu/mL；第 7 列和第 8 列中的中等大小点表示 MOI 为 0.1，噬菌体浓度为 2.0 × 105 pfu/mL；第 9 列和第 10 列中的小点表示 MOI 为 0.01，噬菌体浓度为 2.0 × 104 pfu/mL。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65482/65482fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细菌生长曲线；感染后吸光度随时间（小时）变化；显示实验数据的图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65482/65482fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：噬菌体在感染复数（MOI）为 1 时成功感染宿主细菌的生长曲线实验。 图中显示了未感染细菌（绿色）和添加噬菌体的细菌（蓝色）的平均吸光度值（± 标准差）。缩写：AUC = 曲线下面积；PIAUC = 基于曲线下面积计算的生长抑制百分比；Nasymptote = 最大生长值；PImax = 基于最大生长值计算的生长抑制百分比；ISC = Stacy-Ceballos 指数。该图展示了温和型Gordonia噬菌体DelRio感染其分离宿主菌G. terrae的实验结果。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65482/65482fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="吸光度生长曲线图；OD 600nm 与感染后小时数；感染模型的数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65482/65482fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：以感染复数（MOI）为 1 的噬菌体进行的一次成功的生长曲线实验，该噬菌体未能有效感染宿主细菌。 图中显示了未感染细菌（绿色）和添加噬菌体的细菌（蓝色）的平均吸光度值（± 标准差）。缩写：AUC = 曲线下面积；PIAUC = 基于曲线下面积计算的生长抑制百分比；Nasymptote = 峰值生长值；PImax = 基于峰值生长值计算的生长抑制百分比；ISC = Stacy-Ceballos 指数。本图展示了 DelRio 噬菌体对 G. rubripertincta 的感染情况。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65482/65482fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细菌生长曲线分析，OD 600nm 与时间关系图，包含感染后的吸光度数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65482/65482fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：以 0.01 的感染复数（MOI）进行噬菌体生长曲线实验的成功示例。 图中显示了未感染细菌（绿色）和添加噬菌体后细菌（蓝色）的平均吸光度值（± 标准差）。缩写：AUC = 曲线下面积；PIAUC = 基于曲线下面积计算的生长抑制百分比；Nasymptote = 生长峰值；PImax = 基于生长峰值计算的生长抑制百分比；ISC = Stacy-Ceballos 指数。本图展示了 DelRio 噬菌体对 G. terrae 的感染情况。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65482/65482fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文描述了一种基于光密度的微孔板方法，用于量化噬菌体存在下细菌的长期生长情况，适用于放线菌及其他生长缓慢的细菌。该方法包含减少蒸发和盖子冷凝的改进措施，以及用于计算病毒感染指标的R代码，包括曲线下面积、最大生长量和相对毒力。

噬菌体是自然环境的重要组成部分，具有显著调控细菌种群的能力。为了理解单个……

最终，我们的研究兴趣在于噬菌体与宿主的相互作用。本实验方案能够对生长缓慢的细菌中的噬菌体感染进行测量，并获得描述性感染参数。该方法在研究噬菌体与生长缓慢的放线菌之间宿主共进化过程中具有重要作用。快速微孔板方法对生长迅速的细菌宿主效果极佳，但对于放线菌等生长较慢的细菌宿主，该方法持续时间过短，无法充分展示噬菌体感染的进程。我们的方法针对生长缓慢的细菌进行了优化，使细菌与噬菌体可共同培养多天，以充分表征噬菌体感染的动力学特征。本方案可在微孔板中评估噬菌体与生长缓慢细菌之间的相互作用，而无需从较大的培养瓶中进行分段取样。本方案使用 readily available 的材料，适用于延长培养时间，并可在单个微孔板中接种多个重复样本。首先，将六毫升 lid coating 溶液加入无菌 96 孔微孔板盖的内表面，操作时握住盖子边缘。旋转盖子以确保溶液完全覆盖内表面。将溶液静置20秒后倒出。将盖子倾斜倒置在已灭菌的纸巾上，干燥35至45分钟。将融化的琼脂糖冷却至50至60摄氏度。然后将100微升0.1%琼脂糖溶液移液至板孔之间的空隙中。再将200微升琼脂糖移液至位于A行、H行、第1列、第2列、第11列和第12列的孔中。取一块先前准备好的含有防雾溶液和琼脂糖的微孔板。将75微升细菌加入第3至第10列中。接着，在第3和第4列的孔中各加入75微升无菌噬菌体缓冲液，作为无噬菌体的阳性对照。每次加入后，通过上下吹打混匀溶液，然后向各列中加入不同浓度的75微升噬菌体，并在每次加入后再次通过上下吹打混匀每种溶液。使用 0.5 英寸标签纸将培养板的两个短边粘合，以部分封闭培养板同时允许气体交换。将培养板置于微量板摇床上孵育，并使用微量板读数仪测量光密度。然后根据光密度测量结果，绘制对照组和感染组的生长曲线。生长曲线显示了噬菌体的有效感染，表现为加入噬菌体的孔中细菌吸光度随时间降低；如果细菌不在噬菌体的宿主范围内，则不会观察到细菌密度的下降。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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