含免疫组分的基础三维（3D）肠道模型系统

本研究的目的是利用这些体外三维人源细胞系模型，探究对肠道组织具有益作用及其他有益化合物的效果。这些模型可用于进一步深入理解相关机制，也可作为基础的药物研究模型。通过使用植物来源的化合物亚精胺和丁香酚，分别及联合以补充剂形式处理，利用这些模型检测自噬水平的有益提升以及炎症反应的变化。

此外，我们还证实了从小麦某些品种中提取的麸质对肠道组织可能产生的有害作用。目前，我们正在采用一种价格经济、标准化且易于重复的体外系统，该系统更能反映人类肠道的生理特性，可作为动物模型的替代方案。由于我们使用的是商业化的人源细胞系而非植物来源的细胞，研究所得的结果更适用于一般人群。

该方案完全基于三种不同细胞系的使用，这使得模型更加标准化且可重复。此外，同时培养三种不同的细胞系——肠上皮细胞、成纤维细胞和免疫系统细胞，能够获得更接近患者体内实际情况的细胞反应。

首先，选择一个含有0.4微米滤膜插件的24孔板。使用移液器，在滤膜插件下方和上方各加入500 µL的HBSS。然后盖好培养板，将其放入培养箱中孵育2小时。孵育结束后，小心吸去板中的HBSS。

在冰上，于无菌的50毫升离心管中用DMEM配制无细胞的胶原溶液。在膜过滤器上方加入250微升胶原溶液，并盖上培养板盖子。让溶液在室温下聚合。

接下来，从培养箱中取出L929成纤维细胞培养物。向培养瓶中加入2毫升预热的胰蛋白酶-EDTA溶液，放入培养箱中孵育3至5分钟。将细胞悬液转移至无菌的15毫升离心管中，在645 ×g下离心5分钟。

使用真空泵吸除上清液，并将沉淀物重悬于 1 毫升 DMEM 中。取 20 微升细胞悬液加入含有 20 微升台盼蓝溶液的离心管中，使用细胞计数板评估细胞密度。接着，从培养箱中取出 U937 单核细胞培养物。

离心细胞悬液，并将沉淀重悬于1毫升RPMI培养基中。确保细胞均匀悬浮后，使用细胞计数板进行计数。接着，分别在50微升DMEM培养基中制备含有50,000个L929细胞和15,000个U937细胞的细胞悬液。

将每份50微升细胞悬液加入450微升胶原蛋白中，充分混匀。用500微升胶原细胞溶液覆盖预先包被的无细胞固有层。盖好培养板，放入培养箱中孵育2小时，使溶液凝固。

接下来，从培养箱中取出 Caco-2 细胞培养物。使用真空泵吸去培养基，并用 10 毫升 PBS 洗涤细胞。加入 5 毫升 PBS 胰蛋白酶-EDTA 溶液，放入培养箱中孵育 5 至 8 分钟。

然后离心细胞悬液，并将沉淀重悬于1毫升DMEM中。计数后，制备含有150,000个Caco-2细胞和50微升DMEM的细胞悬液。将培养板置于超净工作台中10分钟，然后转移至培养箱中。

30分钟后，在重建模型上方和滤膜下方各加入500微升DMEM，并将培养板放回培养箱。第二天，小心更换培养基，在滤膜上方和下方分别加入500微升新鲜DMEM。对于细胞的石蜡包埋，将石蜡包埋机设置为58摄氏度。

使用镊子将膜插件转移至无菌24孔板的洁净孔中。在滤膜上方加入500微升37%缓冲福尔马林和PBS，滤膜下方加入1毫升。盖上盖子，将板置于通风橱中静置两小时。

当固有层从膜插件上分离后，将肠黏膜转移至含有25毫升35%乙醇的烧杯中，孵育10分钟。经过脱水并逐步提高乙醇浓度后，将样本置于50毫升二甲苯或组织透明剂中，处理10至20分钟。待样本变得透明后，将其放入金属组织包埋盒中，并浸入加热装置内的液体石蜡中。

45分钟后，使用切片机切割四微米厚的切片。将切下的切片置于载玻片上，并在37摄氏度的烘箱中干燥24小时。一个可接受的三维肠道等效黏膜模型由Caco-2细胞在富含细胞外基质的固有层上方形成紧密且规则的单层结构构成。

不合格的模型包括显示过度生长、上皮层结构紊乱、形态异常或缺乏上皮层形成的模型。高麸质含量的小麦蛋白具有促炎作用，会破坏细胞单层结构，并导致上皮层厚度较对照组降低。与暴露于麸质蛋白的组相比，对照组中的闭合蛋白（occludin）含量显著更高。对U937单核细胞进行CD14和CD11b染色显示，高麸质含量的小麦蛋白可激活单核细胞，并诱导其迁移和分化为巨噬细胞。

在脂多糖刺激下，Caco-2 细胞增加了黏液产生以及炎症标志物中期素的释放。