Name: 研究成年斑马鱼尾柄骨骼肌再生的冷冻损伤模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-07T12:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: 了解成年斑马鱼尾柄骨骼肌再生的冷冻损伤模型。该方法使用定制不锈钢冷冻探针诱导肌肉损伤，通过组织学分析评估损伤与修复过程，为研究肌肉再生机制及开发人类肌肉损伤治疗策略提供有效工具。

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感谢 V. Zimmermann 对鱼类饲养的贡献，以及 Thomas Bise 博士、Catherine Pfefferli 博士和 Lea Gigon 在本项目启动阶段的工作和初步成果。本研究由瑞士国家科学基金会资助，资助编号为 310030_208170。

本研究符合所有相关的伦理规范。斑马鱼的繁殖、饲养和维护均遵循欧洲实验动物科学协会联合会（FELASA）指南25。动物饲养及所有实验程序均经瑞士弗里堡州兽医办公室批准。
1. 仪器设备与设置
<ol>
	<li>在能够为科研制造仪器的技术车间中，安排制作一个不锈钢冷冻探针。 
	注意：提供带有具体尺寸的仪器设计图（图1A）。</li>
	<li>为避免在操作过程中因接触探针而造成冻伤，将手柄插入移液器吸头中，并用胶带包裹固定。</li>
	<li>准备一个烧杯用于盛装麻醉工作液，另备一把勺子用于转移斑马鱼，一块湿润的海绵，以及一个装有系统用水的水箱，以便在操作后让鱼恢复。</li>
	<li>每次实验前均需新鲜配制工作液。配制工作液时，将4 mL Tricaine储备液加入100 mL系统用水中，混匀。 
	注意：麻醉储备液的配制方法为：将4 g Tricaine溶解于980 mL蒸馏水中，用1 M Tris-HCl（pH 9）调节pH至7，再用蒸馏水定容至1 L。该储备液对光敏感，应置于琥珀瓶中，4 ˚C避光保存。</li>
</ol>
2. 肌肉冷冻损伤实验步骤
<ol>
	<li>将探针浸入液氮中至少 3 min 以开始操作。用系统水润湿海绵，并将其放置在平坦的表面上。</li>
	<li>将一条成年斑马鱼转移至 Tricaine 工作液中，1 min 或 2 min 后用勺子轻轻触碰鱼体，确认其无反应性。如果鱼仍有反应，需再等待一段时间。</li>
	<li>将麻醉后的鱼放置在湿润的海绵上。定位尾柄部，该区域位于肛鳍后方、尾鳍前方。</li>
	<li>从液氮中取出冷冻探针。轻轻摇晃探针，确保其尖端无残留液氮。</li>
	<li>将刮匙边缘垂直于鱼体置于尾柄部（图 1C）。保持探针在此位置 6 s，期间不施加压力（图 1D）。 
	注意：冷冻探针自身的重量足以确保仪器与组织之间的接触。</li>
	<li>将冷冻探针从组织上移开，并将鱼转移至盛有系统水的水族箱中。</li>
	<li>观察鱼在麻醉苏醒后恢复呼吸和游泳的情况。若 30 s 后仍未出现鳃盖运动，可通过移液器向鳃部滴加系统水以刺激鱼体，直至其自主开始呼吸。 
	注意：鱼应在恢复水族箱中几分钟内恢复游泳。 
	&#8203;注意：在接下来的几天内，可对鱼进行录像以监测其游泳活动（视频 1 和 视频 2）。在录像前，将对照组和损伤组的鱼转移至透明的交配缸中，使其适应环境至少 1 min。</li>
</ol>
3. 尾柄采集与固定
<ol>
	<li>准备 2 mL 的 4% 甲醛或其他适用于后续检测的固定液，以及培养皿、镊子和手术剪。</li>
	<li>根据当地兽医主管部门的法律规定，在冷冻损伤后的选定时间点处死斑马鱼。 
	注意：通过过量的三卡因溶液（300 mg/L）处理约 10 分钟进行安乐死。鳃部运动消失以及尾鳍夹捏反射消失可确认死亡。安乐死的时间点应根据再生阶段选择：例如，冷冻损伤后 1 天（dpci）至 3 dpci 用于伤口清除；3 dpci 至 10 dpci 用于肌肉再生的启动；10 dpci 至 30 dpci 用于再生进程的推进；30 dpci 之后用于组织修复的完成。因此，为评估肌肉退变与再生的不同阶段及生物学过程，需在冷冻损伤后的多个时间点分别处死各组鱼类。</li>
	<li>将已处死的鱼置于盛有去离子水的培养皿中。使用剪刀在尾柄前后部位进行体壁切割（图 1E）。让组织在培养皿的去离子水中充分放血。</li>
	<li>取下尾柄组织，并用镊子将其转移至已准备好的微量离心管中的固定液中。 
	&#8203;注意：轻轻反复倒置离心管数次，并于 4 ˚C 下静置过夜。</li>
</ol>
4. 固定尾柄部
<ol>
	<li>将固定好的组织在1× PBS中于摇床上洗涤10分钟。随后将其转移至含有预冷的30%蔗糖（溶于去离子水）的2 mL微量离心管中，4 ˚C条件下轻轻颠倒混匀数次。将微量离心管直立放置，在4 ˚C下至少孵育24小时。 
	注：尾柄部最初会漂浮在蔗糖溶液表面，随着组织脱水逐渐下沉。</li>
	<li>在包埋模具中加入约5 mm厚的O.C.T.包埋介质。用镊子将尾柄部调整至介质中，使其位于模具底部，并根据需要调整为横切面或冠状面方向（图1F）。</li>
	<li>将模具置于干冰盒中使介质迅速冷冻。一旦组织在理想位置固定，立即在O.C.T.完全冻结前加满模具其余部分。将模具在−80 ˚C条件下至少保存1小时。 
	&#8203;注：在此条件下，组织样本可保存数月之久。</li>
</ol>
5. 使用冷冻切片机切片
<ol>
	<li>设置切片机，切片厚度为 25 µm。调节舱室温度至 −26 ˚C，样本温度至 −24 ˚C，切削角度为 12 ˚。</li>
	<li>将带有标本的冷冻组织块放入冷冻切片机中，并固定其方向，以便平行于组织块底部进行切片。切片至接近标本时，修整组织块以方便后续样本收集。</li>
	<li>准备六张黏附载玻片。按顺序对载玻片进行编号，以制备样品的重复样本。</li>
	<li>开始切片，并将组织切片收集到标记好的粘附载玻片上。根据后续实验需求，在载玻片上合理排列切片。</li>
	<li>室温下干燥载玻片1小时。将载玻片置于密闭盒中，于−20 °C保存。 
	注意：载玻片在此条件下可安全保存长达1年。</li>
</ol>

Caudal Peduncle Cryoinjury in Adult Zebrafish

<ol><li>Muneoka, K., Allan, C. H., Yang, X., Lee, J., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+regeneration+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+Part+C%3A+Embryo+Today%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mammalian regeneration and regenerative medicine.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 84 (4), 265-280 (2008).</li>
<li>Carlson, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+principles+of+regeneration+in+mammalian+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomical+Record.+Part+B%2C+New+Anatomist%22%5BJournal%5D)">Some principles of regeneration in mammalian systems.</a> Anatomical Record. Part B, New Anatomist. 287 (1), 4-13 (2005).</li>
<li>Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. -C., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells+and+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Satellite cells and skeletal muscle regeneration.</a> Comprehensive Physiology. 5 (3), 1027-1059 (2015).</li>
<li>Relaix, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Perspectives on skeletal muscle stem cells.</a> Nature Communications. 12 (1), 692(2021).</li>
<li>Tulenko, F. J., Currie, P. Zebrafish myology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTulenko%2C+FJ+%22The+Zebrafish+in+Biomedical+Research%22">The Zebrafish in Biomedical Research</a>. Cartner, S. C. , Academic Press. Cambridge, MA. 115-121 (2020).</li>
<li>Siegel, A. L., Gurevich, D. B., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+myogenic+precursor+cell+that+could+contribute+to+regeneration+in+zebrafish+and+its+similarity+to+the+satellite+cell%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">A myogenic precursor cell that could contribute to regeneration in zebrafish and its similarity to the satellite cell.</a> The FEBS Journal. 280 (17), 4074-4088 (2013).</li>
<li>Corona, B. T., Wenke, J. C., Ward, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+volumetric+muscle+loss+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cells+Tissues+Organs%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of volumetric muscle loss injury.</a> Cells Tissues Organs. 202 (3-4), 180-188 (2016).</li>
<li>Pfefferli, C., Jaźwińska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+art+of+fin+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Regeneration%22%5BJournal%5D)">The art of fin regeneration in zebrafish.</a> Regeneration. 2 (2), 72-83 (2015).</li>
<li>Sehring, I. M., Weidinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advancements+in+understanding+fin+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22WIREs+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Recent advancements in understanding fin regeneration in zebrafish.</a> WIREs Developmental Biology. 9 (1), 367(2020).</li>
<li>Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Heart regeneration in zebrafish.</a> Science. 298 (5601), 2188-2190 (2002).</li>
<li>Sanz-Morejón, A., Mercader, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+insights+into+zebrafish+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Recent insights into zebrafish cardiac regeneration.</a> Current Opinion in Genetics & Development. 64, 37-43 (2020).</li>
<li>Chassot, B., Pury, D., Jaźwińska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+fin+regeneration+after+cryoinjury-induced+tissue+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Zebrafish fin regeneration after cryoinjury-induced tissue damage.</a> Biology Open. 5 (6), 819-828 (2016).</li>
<li>Chablais, F., Veit, J., Rainer, G., Jaźwińska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+heart+regenerates+after+cryoinjury-induced+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The zebrafish heart regenerates after cryoinjury-induced myocardial infarction.</a> BMC Developmental Biology. 11, 21(2011).</li>
<li>Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+cryoinjury+induced+necrotic+heart+lesions+in+zebrafish+is+associated+with+epicardial+activation+and+cardiomyocyte+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation.</a> PLoS One. 6 (4), e18503(2011).</li>
<li>Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+scar+formation+and+regression+during+heart+regeneration+after+cryoinjury+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish.</a> Development. 138 (9), 1663-1674 (2011).</li>
<li>Ryan, R., Moyse, B. R., Richardson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+cardiac+regeneration-Looking+beyond+cardiomyocytes+to+a+complex+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish cardiac regeneration-Looking beyond cardiomyocytes to a complex microenvironment.</a> Histochemistry and Cell Biology. 154 (5), 533-548 (2020).</li>
<li>Jaźwińska, A., Sallin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+versus+scarring+in+vertebrate+appendages+and+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Regeneration versus scarring in vertebrate appendages and heart.</a> Journal of Pathology. 238 (2), 233-246 (2016).</li>
<li>Alexander, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orientation+of+muscle+fibres+in+the+myomeres+of+fishes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Marine+Biological+Association+of+the+United+Kingdom%22%5BJournal%5D)">The orientation of muscle fibres in the myomeres of fishes.</a> Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 49, 163-290 (1969).</li>
<li>Morin-Kensicki, E. M., Melancon, E., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmental+relationship+between+somites+and+vertebral+column+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Segmental relationship between somites and vertebral column in zebrafish.</a> Development. 129 (16), 3851-3860 (2002).</li>
<li>Berberoglu, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite-like+cells+contribute+to+pax7-dependent+skeletal+muscle+repair+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Satellite-like cells contribute to pax7-dependent skeletal muscle repair in adult zebrafish.</a> Developmental Biology. 424 (2), 162-180 (2017).</li>
<li>Montandon, M., Currie, P. D., Ruparelia, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examining+muscle+regeneration+in+zebrafish+models+of+muscle+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Examining muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.</a> Journal of Visualized Experiments. (167), e62071(2021).</li>
<li>Pipalia, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+dynamics+of+regeneration+reveals+role+of+two+distinct+Pax7+stem+cell+populations+in+larval+zebrafish+muscle+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Cellular dynamics of regeneration reveals role of two distinct Pax7 stem cell populations in larval zebrafish muscle repair.</a> Disease Models & Mechanisms. 9 (6), 671-684 (2016).</li>
<li>Ratnayake, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+provide+a+transient+muscle+stem+cell+niche+via+NAMPT+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Macrophages provide a transient muscle stem cell niche via NAMPT secretion.</a> Nature. 591 (7849), 281-287 (2021).</li>
<li>Kaliya-Perumal, A. -K., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Musculoskeletal+regeneration%3A+A+zebrafish+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Musculoskeletal regeneration: A zebrafish perspective.</a> Biochimie. 196, 171-181 (2022).</li>
<li>Aleström, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+Housing+and+husbandry+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: Housing and husbandry recommendations.</a> Laboratory Animals. 54 (3), 213-224 (2019).</li>
<li>Saera-Vila, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocyte+dedifferentiation+drives+extraocular+muscle+regeneration+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Myocyte dedifferentiation drives extraocular muscle regeneration in adult zebrafish.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (8), 4977-4993 (2015).</li>
<li>Baust, J. G., Gage, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+cryosurgery%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+International%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of cryosurgery.</a> BJU International. 95 (9), 1187-1191 (2005).</li>
<li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+cell+death%3A+recommendations+of+the+Nomenclature+Committee+on+Cell+Death+2018%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2018.</a> Cell Death and Differentiation. 25 (3), 486-541 (2018).</li>
<li>Chablais, F., Jaźwińska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+myocardial+infarction+in+adult+zebrafish+using+cryoinjury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Induction of myocardial infarction in adult zebrafish using cryoinjury.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), e3666(2012).</li>
<li>Chablais, F., Jaźwińska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regenerative+capacity+of+the+zebrafish+heart+is+dependent+on+TGFbeta+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The regenerative capacity of the zebrafish heart is dependent on TGFbeta signaling.</a> Development. 139 (11), 1921-1930 (2012).</li>
<li>Bise, T., Sallin, P., Pfefferli, C., Jaźwińska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+cryoinjuries+modulate+the+efficiency+of+zebrafish+heart+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Multiple cryoinjuries modulate the efficiency of zebrafish heart regeneration.</a> Scientific Reports. 10 (1), 11551(2020).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

斑马鱼作为一种无羊膜脊椎动物模型，可用于研究肌肉再生的机制。目前大多数已有的损伤方法，如激光消融或穿刺损伤，仅导致相对轻微的组织破坏20,21,22,23。虽然已有对眼外肌进行大范围切除的研究26，但此类手术方法由于需要切开体壁，可能对侧部肌群造成较大的健康风险，因而不太适用。为避免此类侵入性操作，本实验方案描述了一种较为温和的损伤方式，但仍可导致尾柄部严重的组织损伤。该方法依赖于表层操作，能够精确地针对身体一侧的少数几个肌节进行处理。冷冻损伤模型的优势在于其可重复性强，并能引发广泛的肌肉退变；基于这些优势，该模型为研究机体如何应对显著的肌肉丧失提供了新的途径。
应用极低温会导致热休克，从而破坏受影响肌肉组织中的质膜和细胞器27。因此，受损的肌纤维会发生&#34;意外&#34;性细胞死亡28。随后，受损组织可通过自然的伤口清除机制被吸收。斑马鱼对冷冻损伤操作耐受良好，在本研究中，只要预冷探针在体表的位置正确且作用时间精确，存活率几乎可达100%。然而，如果损伤范围过大（例如施加压力过大或冷冻损伤时间过长），鱼类在操作后不久可能出现异常游动行为，此时应以人道终点为原则实施安乐死。对于其他鱼类物种，暴露于冷冻探针的时间应根据其体型大小进行相应调整。
冷冻损伤后，鱼类可以恢复游泳活动，且无任何异常运动症状。然而，与对照组鱼类相比，冷冻损伤的鱼类游泳活动性较低，表明存在轻微的功能障碍。需要在冷冻损伤后的不同时间点进一步量化鱼类行为，以确定游泳能力随时间变化的情况。
冷冻损伤方法对尾柄部其他非肌肉组织的影响仍有待阐明。显然，该操作会损伤最外层的体表组织（即皮肤）。在此背景下，冷冻损伤方法可为研究伤口愈合、鳞片再生以及色素模式的恢复提供新的策略。此外，肌节的血管系统和神经支配也可能受到冷冻损伤的影响，这些方面尚需进一步研究。
冷冻损伤模型此前已被用于研究斑马鱼心脏再生13,14,15,29。与心室切除法相比，该方法具有一些优势10，因其会短暂形成富含胶原蛋白的瘢痕，更接近人类心肌梗死后愈合的反应30。值得注意的是，斑马鱼在经历多次冷冻损伤后仍能实现心脏再生31。有趣的是，冷冻损伤也已被应用于斑马鱼鳍，导致组织溶解过程的发生12。与经典的鳍切除不同，冷冻损伤后残留的残肢具有结构紊乱的边缘，其中包含坏死物质与存活细胞的混合物。对斑马鱼心脏和鳍这两个器官的研究揭示了其在遭受广泛组织损伤后，仍能恢复原有功能结构的强大能力。冷冻损伤的骨骼肌是否激活了修复与再生过程之间的相互作用，仍有待进一步研究。

在脊椎动物中，各种组织的受损部分在其生命周期中会经历稳态更新与修复。这种更新与修复能力通常依赖于具有功能的干细胞的存在，或成熟细胞的增殖能力1,2。骨骼肌由终末分化的肌纤维组成，这些肌纤维与一种称为卫星细胞的局部干细胞相关联3,4,5,6。因此，该组织具备有效的细胞来源，可用于封闭连续性中断的区域或修复轻微损伤。然而，哺乳动物骨骼肌的大范围体积缺失通常会导致非再生性修复，例如纤维化7。动物模型可能为促进严重损伤器官再生的生物学机制提供新的认识。
斑马鱼是一种具有高度再生能力的成熟模式生物。成年斑马鱼能够再生其尾鳍的截肢部分或心脏心室被切除的顶端8,9,10,11。此外，已有研究采用冷冻损伤法来研究斑马鱼的鳍和心脏再生12,13,14,15。对于内脏器官而言，冷冻损伤法的优势在于可在不破坏器官完整性的前提下诱导细胞死亡，从而模拟生理状态下的损伤情况16,17。组织碎片会在伤口愈合过程中通过自然清除机制被分解，随后启动修复过程。然而，该方法是否适用于骨骼肌的再生研究仍有待证实。
在鱼类中，侧部肌群能够实现游泳时躯干的左右弯曲18。骨骼肌以体节为单位组织成肌节（myomeres），肌节之间由结缔组织分隔5,19。斑马鱼在发生轻微组织损伤（例如激光消融或刺伤所致）后能够再生肌肉20,21,22,23,24，但大面积损伤后是否能够再生完整的肌节仍不清楚。这一知识空白可能源于缺乏合适的损伤模型。本方案建立了一种诱导骨骼肌广泛损伤的新方法，该损伤可跨越多个肌节。所述的冷冻损伤方法基于使用预冷的不锈钢工具对肌纤维进行快速冷冻和解冻。尽管损伤范围广泛，鱼类的健康状况并未受到严重损害。完整的肌节能够得以恢复，因此本研究为探讨成年斑马鱼肌肉再生机制提供了一个新的模型系统。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;程序&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>美国国立卫生研究院 (NIH)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photoshop 版本 23.5.3</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;材料/设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35/10 mm 培养皿</td><td>Greiner Bio-one</td><td>货号：627102</td><td></td></tr><tr><td>相机</td><td>Sony</td><td>/</td><td>HDR-PJ410</td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Histcom</td><td>HRA C50</td><td></td></tr><tr><td>甲醛 ~36%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47630</td><td></td></tr><tr><td>Macro 50 mm f/2.8 EX DG 镜头</td><td>Sigma</td><td>/</td><td>已停产镜头</td></tr><tr><td>Peel-A-Way 包埋用截短模具 T8</td><td>Polyscience, Inc.</td><td>18985</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus 载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>海绵</td><td>任意</td><td>任意</td><td>扁平海绵，约 7 cm × 3 cm × 1 cm</td></tr><tr><td>不锈钢冷冻探针</td><td>定制</td><td>/</td><td>具体参数见文章</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>手术剪</td><td>任意</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>TCS SP2</td><td>Leica</td><td>/</td><td>已停产产品</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>三卡因（麻醉剂）</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;染料与抗体&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dapi</td><td>Sigma</td><td>10236276001</td><td>浓度：1/2000</td></tr><tr><td>Phalloidin-Atto-565（F-肌动蛋白）</td><td>Sigma</td><td>94072</td><td>浓度：1/500</td></tr><tr><td>原肌球蛋白（TPM1）</td><td>DHSB</td><td>CH1</td><td>浓度：1/50</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;配方/溶液&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1× PBS</td><td>123 mM NaCl</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>2.7 mM KCl</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>10 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>1.8 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>AFOG 溶液</td><td>3 g 品红</td><td>Fisher Scientific</td><td></td></tr><tr><td></td><td>2 g 橙黄 G</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>1 g 苯胺蓝</td><td>Fulka AG</td><td></td></tr><tr><td></td><td>200 ml 酸化蒸馏 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O（pH 1.1）</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

成年斑马鱼尾柄骨骼肌再生研究的冷冻损伤模型

A Cryoinjury Model for Studying Skeletal Muscle Regeneration of the Caudal Peduncle in Adult Zebrafish

骨骼肌在受到轻微损伤后，可通过激活类似卫星细胞的干细胞实现自我更新与修复。然而，肌肉的严重损伤在人类中常导致纤维化。与哺乳动物相比，斑马鱼具有更强的器官再生先天能力，为研究器官在遭受广泛损伤后的组织修复提供了有力的模型。本文描述了一种冷冻损伤模型，用于在成年斑马鱼尾柄区域诱导四个肌节的严重损伤。研究人员设计了一种定制的冷冻探针，使其贴合鱼体形状，并可重复地从皮肤至中线处损伤侧部肌组织。重要的是，鱼体结构完整性得以保持，鱼类仍能继续游动。通过组织切片的组织学染色以及肌节蛋白的荧光染色，评估骨骼肌的变化。该方法将为研究骨骼肌退变如何诱导修复反应，以及成年斑马鱼中肌源性程序的重新激活，开辟新的研究途径。

冷冻损伤后对鱼类的监测 
为了确定肌节冷冻损伤对动物的影响，对对照组和接受冷冻损伤的鱼类在冷冻损伤后1天（dpci）和5 dpci时进行了视频记录。每组包含五条鱼。在1 dpci时，冷冻损伤组的鱼类游泳活动减少，但未表现出任何异常运动行为，例如打转、抽搐或平衡能力下降（视频 1）。在养殖系统中，它们在水箱中的位置和摄食情况与未受伤鱼类相似。随后数天内其行为保持正常，5 dpci时的视频即为典型示例（视频 2）。综上所述，尾柄部位的冷冻损伤操作并未显著影响动物的健康状况。
尾柄切片的组织学分析 
为了评估损伤程度，选择伤后4天（4 dpci）作为时间点，因为此时伤口中的肌纤维碎片已被完全吸收。为了分析冷冻损伤沿身体背腹轴和前后轴的影响，使用了两组鱼类（即分别为尾柄的冠状切面和横切面）（图1F）。
采用由苯胺蓝、酸性品红和橙G组成的三色染色法（AFOG）对切片进行分析。使用该试剂组合时，完整的肌肉呈橙色，脊髓呈深红色，胶原基质呈蓝色。为了确定受损肌节（即鱼类肌肉的体节性结构单位）的数量，分析了一系列切片（图2）。肌节之间的边界（称为肌隔）可通过染成蓝色的胶原沉积物加以识别。受损区域则表现为缺乏橙色染色。对具有明显肌隔结构的样本进行进一步观察发现，连续约四个肌节出现损伤，依据为橙色染色的缺失（n，鱼类数量 = 4；图3A，A'）。同一条鱼未受损的一侧作为内部对照。
为了观察垂直于体轴方向的伤口深度，使用了受伤后4天和7天的斑马鱼制备横截面样本。后者对应肌源性程序的激活，即肌肉再生的起始阶段。这些样本的AFOG染色显示，在冷冻损伤的体侧区域几乎完全缺乏橙色染色，从而界定出骨骼肌退变的区域（图3B、C）。在受伤后4天和7天，伤口区域从皮肤延伸至垂直隔膜。这表明冷冻损伤方法深度影响了尾柄的一侧半部，使其在手术后7天内均无功能性肌肉存在。综上所述，尾柄一侧的四个肌节受到了严重损伤。
横切面免疫荧光分析 
为评估肌肉再生的动态过程，实验组鱼类分别在损伤后第4天、第7天、第10天和第30天实施安乐死。对尾柄部位的横切面进行多色荧光染色，所用试剂包括鬼笔环肽（可结合丝状肌动蛋白[F-actin]）、Tropomyosin-1抗体（用于检测肌节蛋白）以及DAPI（用于标记细胞核）。在所有时间点，未损伤的半侧鱼体均作为内部对照；在未损伤的对照区域中，F-actin和Tropomyosin 1均呈现强信号，表明组织未受损伤（图4）。
在损伤后4天，尾柄受伤侧含有大量DAPI阳性细胞，但几乎未观察到F-肌动蛋白和原肌球蛋白1的免疫荧光信号，表明该区域肌肉已退化（图4A-B'）。在损伤后7天，可在靠近身体垂直中线的伤口部分检测到原肌球蛋白1和F-肌动蛋白的表达（图4C-D'），该表达模式标示了尾柄中新肌纤维开始形成的部位。在损伤后10天，两种肌肉标志物均向体表方向扩展，提示骨骼肌正在持续再生（图4E-F'）。在损伤后30天，身体两侧的F-肌动蛋白染色分布相似（图4G-H'），该结果表明尾柄经冷冻损伤后，骨骼肌已得到有效恢复。
<img alt="斑马鱼冷冻损伤实验，显示操作步骤的示意图，90°探针应用，组织采集。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65491/65491fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：肌节冷冻损伤的实验装置。（A）定制的不锈钢冷冻探针的尺寸。仪器的远端部分为一带凹边的铲状结构，凹陷深度为 1 mm，以适应斑马鱼身体的曲率。工具的中部为一个圆柱体，既作为配重，也作为维持铲状部分在操作过程中低温的储冷腔。仪器的近端为细金属手柄。（B、C）置于湿润海绵上的麻醉成年鱼，冷冻探针位于尾柄部。探针处于室温。（B）探针边缘水平放置于尾柄部附近，以显示鱼与工具之间的相对大小。（C）进行冷冻损伤时，工具尖端垂直于鱼体放置。（D）从鱼腹侧观察冷冻损伤操作的示意图，以全面展示操作过程。冷冻探针预先在液氮中冷却，随后立即置于鱼体一侧持续 6 s。（E）在冷冻损伤后的特定时间点处死鱼，并采集其尾柄部用于固定。（F）固定后的组织经组织学处理，沿冠状面或横断面切片。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65491/65491fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="鱼类尾柄冠状切片，AFOG染色，骨骼肌与胶原，冷冻损伤后4天（dpci）" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65491/65491fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：从身体背侧至腹侧位置的尾柄部受损肌节的组织学分析。 冷冻损伤后4天（dpci）一系列冠状切片的AFOG染色结果。切片位置从最背侧至最腹侧排列，如第一和最后一个图面板顶部所示。各切片非连续相邻，其间距约为150 µm。未受损肌肉呈橙色染色，而受损组织缺乏此染色，呈现灰白色（虚线圈出区域）。含胶原的组织（如皮肤）被染成蓝色。脊髓呈杆状结构，染为红色。实验鱼类数量，n = 4。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65491/65491fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="脊髓横切面、冷冻损伤、胶原染色、组织学分析，500 µm 比例尺。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65491/65491fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：利用AFOG染色评估尾柄部损伤深度。（A，A'）冠状切面位于脊髓水平（红色染色的水平条状结构）。下方图像显示上图中方框内区域的放大图像。连续的肌节边界呈斜向排列的胶原条带（蓝色），相对于脊髓呈斜向分布（放大图像 A' 中的红色箭头所示）。（B，C）横切面显示未损伤侧体壁为橙色染色的肌肉，冷冻损伤侧则呈灰白色染色。损伤区域以黑色虚线圈出。垂直隔膜（红色虚线所示）将身体分为对照侧和冷冻损伤侧。每时间点样本鱼数量，n = 4。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65491/65491fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="不同损伤后时间点的F-actin共聚焦显微镜图像，用于观察肌肉修复过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65491/65491fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：冷冻损伤后肌肉蛋白的免疫荧光检测。 横截面在损伤后第4天（4 dpci）、第7天（7 dpci）、第10天（10 dpci）和第30天（30 dpci）的荧光染色结果，如各图左侧和顶部所示（A-B'）。在4 dpci时，受损组织（以虚线圈出）DAPI染色阳性（蓝色），但无Phalloidin染色（绿色）或Tropomyosin-1免疫反应信号（红色），提示冷冻损伤后肌纤维发生退变。（C-D'）在7 dpci时，两种肌肉标志物在损伤区域逐渐出现，表明再生过程正在进行；在新生肌纤维中，Tropomyosin-1的信号强于F-actin。（E-F'）在10 dpci时，损伤区域已被新生肌纤维填充，且Tropomyosin-1免疫反应强度高于F-actin。（G-H'）在30 dpci时，身体两侧均检测到相似的肌纤维分布模式。图中A、C、E和H的框内区域在右侧相邻图像中被放大显示。使用Adobe Photoshop去除了肌节外皮肤鳞片产生的荧光信号。每时间点鱼类数量，n = 4。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65491/65491fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案描述了一种冷冻损伤模型，用于诱导成年斑马鱼多个尾部肌节发生严重损伤。该方法为研究非哺乳脊椎动物在组织严重丧失后骨骼肌的再生提供了一种新途径。

骨骼肌在轻微损伤后通过激活类似卫星细胞的干细胞进行更新和修复。严重损伤的……

斑马鱼模型有助于我们理解高效器官再生的自然机制。我们实验室先前已建立了一种冷冻损伤方法，用于研究斑马鱼如何修复其心脏和鳍。通过本新方案，我们旨在将研究拓展至另一器官，即肌肉组织。我们尚未理解为何斑马鱼的器官再生能力比人类更强。尽管斑马鱼体内的伤口相对较大，本方案为研究肌肉组织的成功修复提供了一种有前景的方法。该冷冻损伤模型至少具有三个优势。首先，肌肉组织会迅速受损，但不会破坏身体的完整性。其次，所造成的伤口具有可重复性，并可通过自然愈合过程清除。最后，鱼类在冷冻损伤后仍能正常游动，表明该操作对动物的影响较轻。我们的研究将斑马鱼尾柄引入再生生物学领域。这一研究方向将有助于解析指导成年斑马鱼复杂肌肉组织重建的肌生成程序的分子机制。对斑马鱼进行肌节冷冻损伤操作时，应使用定制的不锈钢冷冻探针。在操作过程中，为避免因接触探针而造成冻伤，可将探针手柄插入移液器吸头中，并用胶带缠绕固定。在开始冷冻损伤操作前，准备一个用于盛装麻醉工作液的烧杯、一把用于操作斑马鱼的勺子、一块湿润的海绵，以及一个装有系统水的水箱，用于操作后鱼类的恢复。按照屏幕上显示的步骤配制麻醉剂储备液。然后将4毫升配制好的储备液加入到100毫升系统水中，于烧杯中配制三卡因工作液。开始冷冻损伤操作时，将探针浸入液氮中至少三分钟。用系统水润湿海绵，并将其放置在平坦表面上。然后，将一条成年斑马鱼转移至工作浓度的三卡因溶液中约一到两分钟后，用勺子轻轻触碰鱼体，确认其无反应。将已麻醉的鱼置于湿润的海绵上。找到位于肛门鳍后方与尾鳍前方之间的尾柄部位。在此阶段，将冷冻探针从液氮中取出。轻轻摇动探针，确保探针尖端无残留液氮。将刮铲的边缘垂直于鱼体，置于尾柄处。将探针保持在此位置6秒，期间不施加压力，然后将冷冻探针从组织中释放，接着将鱼转移到恢复箱的系统水中。观察鱼在从麻醉中苏醒后恢复呼吸和游动的情况。如果30秒后仍未出现鳃盖运动，可通过移液器向鳃部滴加系统水以刺激鱼体，直至其自主开始呼吸。在冷冻损伤后一天（DPCI）对对照组和冷冻损伤鱼类进行的视频记录显示，尽管冷冻损伤鱼类的游动活跃度较低，但并未出现漩涡状运动、抽搐或平衡能力下降等异常行为。在养殖系统中，它们在水箱中的位置和摄食情况与未受伤鱼类相似。在DPCI第5天观察到，正常行为仍然持续，表明冷冻损伤操作并未显著影响动物的健康状况。首先，准备 2 毫升 4% 的甲醛溶液或其他合适的固定液。同时，在开始操作前准备好培养皿、镊子和手术剪。将经适当安乐死处理的冷冻损伤鱼类置于含有去离子水的培养皿中。使用剪刀，在尾柄的前后部位穿过鱼体进行剪切。将组织置于培养皿内的去离子水中，使其血液流出。用镊子收集尾柄，并转移至已准备好的固定液中，放入微量离心管内。轻轻翻转离心管数次。在装片前，将固定好的组织置于摇床上，用 PBS 洗涤 10 分钟。然后将其转移至含有 30% 蔗糖（溶于去离子水）溶液的 2 毫升微量离心管中，该溶液需预先冷却至 4°C，并轻轻翻转离心管数次。将离心管直立放置于 4°C 环境中至少 24 小时。在包埋模具中加入 5 毫米厚的 OCT 包埋介质。使用镊子将尾柄置于模具底部，并调整其方向以进行横切或冠状切面切片。将组织置于干冰盒中使包埋介质冻结。一旦组织固定在理想位置，需在OCT完全冻结前将模具其余部分填满。在使用冷冻切片机切片前，将模具于-80°C条件下保存至少一小时。通过三色染色法（由苦味酸亮蓝、酸性品红和橙G组成）对冷冻损伤后不同天数（DPCI）的尾柄部切片进行分析，以评估冷冻损伤的程度。损伤区域通过缺乏橙色染色来确定。在冷冻损伤后第4天和第7天，横截面显示身体受冻侧的骨骼肌出现广泛变性。免疫荧光分析表明，在冷冻损伤后第4天，尾柄部损伤侧存在大量DAPI阳性细胞，但F-actin和原肌球蛋白1极少甚至缺失，提示肌肉已发生变性。在损伤后第7天，可在靠近身体垂直中线的伤口处检测到原肌球蛋白1和F-肌动蛋白，表明新的肌纤维开始形成。在损伤后第30天，身体两侧的F-肌动蛋白染色分布相似，表明骨骼肌已有效恢复。

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研究成年斑马鱼尾柄骨骼肌再生的冷冻损伤模型

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利用低温损伤法在成年斑马鱼中诱导心肌梗死

本文所述方法包括利用高能激光脉冲对活体斑马鱼胚胎进行精确损伤，并随后随时间推移分析这些损伤及其恢复过程。我们还展示了如何在激光诱导损伤期间及之后，对经基因标记的单个或成组骨骼肌细胞进行追踪。...

斑马鱼胚胎骨骼肌激光损伤

脊髓横断后，成年斑马鱼在损伤后六周内可实现功能恢复。为了利用幼鱼的透明特性以及更快的恢复速度，我们介绍了一种横断斑马鱼幼体脊髓的方法。横断后，我们观察到感觉功能在损伤后2 天开始恢复，损伤后3天出现C形弯曲运动。...

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成年斑马鱼损伤模型用于研究泼尼松龙在骨组织再生中的作用

骨骼肌再生由组织驻留的肌肉干细胞驱动，这些细胞在多种肌肉疾病（如肌营养不良症）中功能受损，导致肌肉无法再生。本文介绍了一种可在斑马鱼肌肉疾病模型中研究肌肉再生的实验方案。...

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成年斑马鱼在脊髓损伤后具有功能恢复能力，是阐明神经再生内在机制的首选模型系统。本文中，我们描述了游泳耐力和游泳行为检测方法，作为脊髓再生功能的评估指标。...

成年斑马鱼游泳耐力与游泳行为的评估

本实验方案描述了一种利用激光损伤系统结合用于幼鱼处理的自动化微流控平台，在斑马鱼幼鱼中诱导组织特异性且高度可重复损伤的方法。...

用于研究斑马鱼幼鱼脊髓再生的可控半自动激光诱导损伤

Xenopus tropicalis 是再生研究的理想模型，因为其许多器官具有显著的再生能力。本文介绍了一种通过心尖切除法构建 X. tropicalis...

成年个体中的顶端切除模型 Xenopus tropicalis 心脏

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利用双光子激光消融发育期斑马鱼幼鱼中的成骨细胞

了解成年斑马鱼尾柄骨骼肌再生的冷冻损伤模型。该方法使用定制不锈钢冷冻探针诱导肌肉损伤，通过组织学分析评估损伤与修复过程，为研究肌肉再生机制及开发人类肌肉损伤治疗策略提供有效工具。

成年斑马鱼尾柄骨骼肌再生研究的冷冻损伤模型

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