Name: 检测小鼠卵母细胞中的DNA双链断裂 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T12:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: 了解如何使用免疫荧光和共聚焦显微镜检测小鼠卵母细胞中的DNA双链断裂。该方法通过γH2AX标记准确识别损伤位点，揭示卵母细胞的DNA损伤修复能力。

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我们感谢本项目对这项工作的支持 &#34;建立生物医学研究中的“能力建设”基础设施（BIOMED-20）&#34; （MIS 5047236），该计划在行动中实施 &#34;加强研究与创新基础设施&#34;，由运营计划资助 &#34;竞争力、创业与创新&#34; （NSRF 2014-2020），由希腊和欧盟（欧洲区域发展基金）共同资助。

所有小鼠实验均经当地主管部门（希腊约阿尼纳地区）批准，并依照欧洲共同体理事会指令2010/63/EU进行。实验过程中严格遵守3R原则。实验所用的所有CD-1小鼠均饲养于希腊约阿尼纳大学动物实验中心，饲养环境温度恒定22 °C）和湿度（60%）条件下饲养，并喂食 随意摄取动物房持有运营许可证，可用于动物繁育（EL33-BIObr01）、供应（EL33-BIOsup01）和实验（EL33BIO-exp01）。
1. 试剂的准备
<ol>
	<li>将3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）粉末（参见材料表）溶于二甲基亚砜（DMSO）（参见材料表）中，配制成终浓度为200 mM的溶液。分装为每份10 µL，于−20 °C保存。溶液需在1个月内使用完毕。 
	注意：IBMX粉末应保存在−20 °C。</li>
	<li>配制所有免疫荧光缓冲液，并于4 °C保存。
	<ol>
		<li>将一块磷酸盐缓冲液（PBS）片剂（参见材料表）溶于200 mL去离子水（ddH2Ο）中，制备无菌磷酸盐缓冲液（PBS）。</li>
		<li>在磁力搅拌器（参见材料表）搅拌下，向80 mL去离子水（ddH2Ο）中加入0.59575 g HEPES、1.81422 g PIPES、0.38035 g EGTA和0.04066 g MgCl2（参见材料表），同时缓慢加入NaOH（参见材料表），直至pH值达到6.9（使用pH/ORP计检测，参见材料表）。然后用去离子水（ddH2Ο）定容至100 mL，即得PHEM缓冲液。</li>
		<li>在加热并磁力搅拌的条件下，将多聚甲醛（PFA）粉末（参见材料表）溶于PHEM缓冲液中，配制成终浓度为4%的多聚甲醛-吐温-100（PFA-Tx-100）缓冲液。随后使用注射器和0.2 µm滤膜（参见材料表）过滤该缓冲液，并加入0.5% Tx-100（参见材料表）。每次实验约需配制10 mL PFA-Tx-100缓冲液（含0.4 g PFA和50 µL Tx-100）。该缓冲液最多可在4 °C保存1周。 
		​警告：操作PFA时应佩戴手套，避免接触皮肤和眼睛。</li>
		<li>在PBS中加入牛血清白蛋白（终浓度：0.5% w/v BSA）（参见材料表），机械搅拌，配制洗涤缓冲液。再以1:1,000的比例加入10% w/v NaN3缓冲液（叠氮化钠），以降低真菌和细菌污染的风险。配制10% w/v NaN3缓冲液的方法为：将1 g NaN3粉末（参见材料表）溶于10 mL去离子水（ddH2O）中；NaN3缓冲液可于室温保存。</li>
		<li>在PBS中加入BSA（终浓度：3% w/v），机械搅拌，配制封闭缓冲液。再以1:1,000的比例加入10% NaN3缓冲液。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 从解剖的卵巢中收集GV期卵母细胞并诱导DNA双链断裂
注意：所有工具和溶液均应无菌。卵母细胞的操作需在体视显微镜下使用口控移液管进行（参见材料表），所有液滴均需用矿物油覆盖（参见材料表和图1E）。
<ol>
	<li>向小鼠腹腔注射7国际单位（IU）孕马血清促性腺激素（PMSG）（参见 材料表在通过颈椎脱位处死小鼠前 46-48 小时。 
	注意：所有使用的小鼠应为8至12周龄。</li>
	<li>过滤M2培养基（参见 材料表) 用注射器和 0.2 µm 过滤，并加入IBMX至终浓度200 mM 200 µM 在14 mL圆底试管中（参见 材料表) 以使卵母细胞停滞在第一次减数分裂前期。然后，在塑料组织培养皿中制备M2-IBMX培养基液滴（参见 材料表），并将其置于加热块上（参见 材料表在 37 °C 至少30分钟后再进行卵母细胞分离。将M2保存于 4 °C.</li>
	<li>通过颈椎脱位处死小鼠，解剖取出卵巢，并将其置于5 mL圆底管中（参见 材料表) 与 M2-IBMX。</li>
	<li>将卵巢转移至含有1.5 mL M2-IBMX的塑料培养皿盖中，去除卵巢周围脂肪组织或输卵管片段，并使用27 G针头对卵巢进行机械穿刺以释放卵丘-卵母细胞复合体（COCs）（参见 材料表 和 图1A- C).</li>
	<li>将COCs转移至含有M2-IBMX液滴的培养皿中（每滴约25-30 µL 每个），并使用窄口玻璃巴斯德移液管通过反复吹打去除卵丘细胞（参见 材料表 和 图1D).</li>
	<li>选择SN GV期卵母细胞，并将其转移至一滴液滴中（25 µLM2-IBMX 培养基于热块上 37 °C 避光图1F).
	<ol>
		<li>根据生发泡（GV）的位置区分SN与NSN卵母细胞：SN卵母细胞体积较大，生发泡位于中央；而NSN卵母细胞的生发泡位于核周或边缘区域21在对GV卵母细胞类型（SN或NSN）做出最终判断之前，务必在共聚焦显微镜下观察DNA构型。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用依托泊苷诱导DSB（参见 材料表）。将GV期卵母细胞置于液滴中（25 µL 每种遗传毒性试剂在加热块上处理1小时 37 °C 在黑暗条件下。 
	注意：依托泊苷是一种拓扑异构酶II抑制剂，可向DNA引入双链断裂（DSBs）22. 将依托泊苷保存在 10 µL 20 mg/mL 的等分试样，于室温避光保存。已测试的浓度为 5 µg/mL, 20 µg/mL，以及 50 µg/mL.</li>
	<li>为了使GV期卵母细胞长时间维持在阻滞状态，将卵母细胞置于M16培养液滴中（参见 材料表) 加入补充 400 µM IBMX 在培养箱中（参见 材料表) 在 37 °C 和5% CO2. 将 M16 储存于 4 °C，使用注射器和滤器过滤培养基 0.2 µm 过滤，并在使用前孵育至少1小时。</li>
</ol>
<img alt="组织样本显微镜观察和实验室分析装置，包括菌落生长观察和研究阶段。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65494/65494fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：卵母细胞分离过程。（A）在含IBMX的M2培养基中，从卵巢组织上切除卵巢周围脂肪组织及残留的输卵管片段。图像通过体视显微镜目镜拍摄。比例尺 = 1 mm。（B）在含IBMX的M2培养基中的分离卵巢组织。图像通过体视显微镜目镜拍摄。比例尺 = 1 mm。（C）使用27 G针头在含IBMX的M2培养基中对卵巢进行机械穿刺。图像通过体视显微镜目镜拍摄。比例尺 = 1 mm。（D）穿刺后在含IBMX的M2培养基中从卵巢释放出的卵丘-卵母细胞复合体（COCs）。图像通过体视显微镜目镜拍摄。比例尺 = 100 µm。（E）使用口控移液管收集卵母细胞。（F）去除周围卵丘细胞后的裸卵母细胞，置于含IBMX的M2培养基中。图像通过体视显微镜目镜拍摄。比例尺 = 100 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65494/65494fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
3. 卵母细胞固定与免疫荧光染色
注意：卵母细胞操作需在体视显微镜下使用口吸管进行，所有液滴均需用矿物油覆盖。
<ol>
	<li>将对照组和依托泊苷处理的GV期卵母细胞分别置于含有PFA-Tx-100缓冲液的不同塑料培养皿中，室温孵育40分钟。</li>
	<li>将卵母细胞在三滴不同的洗涤缓冲液中依次洗涤（50 µL 室温下分别放置5分钟，每滴中孵育卵母细胞5分钟。</li>
	<li>将卵母细胞置于阻断缓冲液的液滴中（25 µL 每个样品在热块上于65°C孵育1小时 37 °C.</li>
	<li>制备识别 γH2AX（兔抗磷 酸化 H2A.X）（Ser139）的一抗（参见 材料表）（储存液：1 mg/mL）。用封闭缓冲液按1:200稀释，将卵母细胞置于含一抗的液滴中（15 µL 每个）在 4 °C 过夜。 
	注意：磷酸化Η2ΑΧ（γH2AX）是检测体细胞和GV期卵母细胞中DNA双链断裂（DSBs）的常用标志物18,23.</li>
	<li>次日，将卵母细胞在三滴不同的洗涤缓冲液中清洗50 µL 室温下分别放置5分钟。每滴液滴中孵育卵母细胞5分钟。</li>
	<li>制备二抗，Alexa Fluor 488 标记的山羊抗兔（见 材料表）（储存液：2 mg/mL）。在封闭缓冲液中按1:200稀释，将卵母细胞置于含有二抗的液滴中（15 µL 每个样品在热块上于65°C孵育1小时 37 °C 避光。</li>
	<li>将卵母细胞转移至含有 DRAQ7 的液滴中25 µL 各)（储备液：0.3 mM；参见 材料表），这是一种远红荧光DNA染料，仅对透化细胞中的DNA进行染色。使用洗涤缓冲液按1:250稀释，室温避光孵育10分钟。</li>
	<li>将卵母细胞在三滴不同的洗涤缓冲液中依次洗涤（50 µL 室温下分别放置，每滴中孵育5分钟，然后转移至小滴（约 5 µL 每次加入洗涤缓冲液至35 mm玻璃底培养皿中（见 材料表）用于共聚焦显微镜（图2A). 
	注意：DNA 染色剂和二抗的洗涤步骤同时进行。</li>
</ol>
4. 共聚焦显微镜
注意：应立即进行共聚焦显微镜观察，以避免卵母细胞置于玻璃底培养皿后荧光强度减弱。需要使用配备电动载物台的共聚焦显微镜（参见材料表）。
<ol>
	<li>显微镜设置
	<ol>
		<li>在共聚焦系统中，打开激光控制器、激光器、显微镜控制器、透射光光源以及计算机（图2B，D）。</li>
		<li>启动共聚焦软件，并选择40倍油镜。</li>
		<li>将培养皿放入样品架中，使用操纵杆移动载物台的XY和Z轴，尝试对卵母细胞进行聚焦（图2C）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>卵母细胞扫描
	<ol>
		<li>为每个实验单独设置激光功率、增益和针孔大小，以尽量减少信号饱和。</li>
		<li>针对每个卵母细胞，设定感兴趣区域，特别是细胞核中的DNA区域。定义DNA区域的边界，并将z轴步进大小调整为3 µm，然后开始扫描。</li>
		<li>将每个细胞的图像保存至选定的文件夹中。</li>
		<li>扫描完成后，退出软件，关闭计算机，并关闭激光控制器、激光器、显微镜控制器以及透射光光源。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="用于分析微滴的显微镜实验装置、显微镜图像和微流控结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65494/65494fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：共聚焦显微镜。（A）完成免疫荧光实验流程并进行DNA染色后的固定卵母细胞，置于洗涤缓冲液的不同液滴中，上覆矿物油，放置于玻璃底培养皿中，准备进行共聚焦显微成像。每个液滴包含不同的实验组别。图像通过体视显微镜目镜获取。比例尺 = 1 mm / 放大区域100 µm。（B）置于共聚焦显微镜载物台上的玻璃底培养板。（C）通过共聚焦显微镜获得的卵母细胞明场图像。比例尺 = 100 µm。（D）共聚焦显微镜系统。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65494/65494fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
5. 成像分析
<ol>
	<li>在浏览器中下载 Fiji ImageJ-win64（https://imagej.net/software/fiji/downloads），打开软件，并以 TIFF 图像序列文件形式导入数据。 
	注意：每个卵母细胞文件需单独打开。</li>
	<li>点击 图像 | 颜色 | 拆分通道，将所有通道拆分。</li>
	<li>点击 LUT（查找表），为每个通道选择合适的颜色。</li>
	<li>点击 图像 | 颜色 | 合并通道，合并 γH2AX 和 DNA 通道；明场通道保持未合并状态。</li>
	<li>在非周围染色质型（NSN）卵母细胞以及 DNA 损伤水平较低的周围染色质型（SN）卵母细胞中，γH2AX 以 DNA 区域内的焦点形式被检测到。此时，请点击 “多点”或“点” 工具，选择每一个与 DNA 重叠的 γH2AX 焦点。对所有图像序列重复此步骤。</li>
	<li>在 DNA 损伤水平较高的 SN 卵母细胞中，γH2AX 信号遍布整个 DNA 区域。此时，请点击 图像 | 图像序列 | Z 投影，然后使用 自由手选区 工具，选中整个 DNA 区域。</li>
	<li>为测量 γH2AX 荧光强度，请点击 分析 | 测量，并将测量结果复制到 .xlsx 文件中。随后计算平均荧光强度，对数值进行归一化处理，并在绘制图表前统计焦点数量。</li>
	<li>点击 分析 | 设置标尺 以设定比例尺，然后点击 分析 | 工具 | 添加标尺，在各通道图像上添加比例尺。</li>
</ol>

Identifying DNA Damage in Prophase-Arrested Oocytes of Mice

<ol><li>Wang, X., Pepling, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+meiotic+prophase+one+in+mammalian+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of meiotic prophase one in mammalian oocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 667306(2021).</li>
<li>Filatov, M., Khramova, Y., Semenova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+prophase+I+meiotic+arrest+maintenance+and+meiotic+resumption+in+mammalian+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Sciences%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of prophase I meiotic arrest maintenance and meiotic resumption in mammalian oocytes.</a> Reproductive Sciences. 26 (11), 1519-1537 (2019).</li>
<li>Adhikari, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+phosphorylation+of+Cdk1+mediates+prolonged+prophase+I+arrest+in+female+germ+cells+and+is+essential+for+female+reproductive+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Inhibitory phosphorylation of Cdk1 mediates prolonged prophase I arrest in female germ cells and is essential for female reproductive lifespan.</a> Cell Research. 26 (11), 1212-1225 (2016).</li>
<li>Sun, S. C., Kim, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+asymmetric+division+in+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of asymmetric division in oocytes.</a> Microscopy and Microanalysis. 19 (4), 883-897 (2013).</li>
<li>Jones, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+egg+activation%3A+From+Ca2%2B+spiking+to+cell+cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Mammalian egg activation: From Ca2+ spiking to cell cycle progression.</a> Reproduction. 130 (6), 813-823 (2005).</li>
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<li>Parfenov, V., Potchukalina, G., Dudina, L., Kostyuchek, D., Gruzova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+antral+follicles%3A+oocyte+nucleus+and+the+karyosphere+formation+%28electron+microscopic+and+autoradiographic+data%29%5BTitle%5D)+AND+%22Gamete+Research%22%5BJournal%5D)">Human antral follicles: oocyte nucleus and the karyosphere formation (electron microscopic and autoradiographic data).</a> Gamete Research. 22 (2), 219-231 (1989).</li>
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<li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+nonsurrounded+nucleolus+and+surrounded+nucleolus+oocytes+on+chromatin+accessibility+using+ATAC-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of nonsurrounded nucleolus and surrounded nucleolus oocytes on chromatin accessibility using ATAC-seq.</a> Molecular Reproduction and Development. 90 (2), 87-97 (2023).</li>
<li>Zuccotti, M., Bellone, M., Longo, F., Redi, C. A., Garagna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully-mature+antral+mouse+oocytes+are+transcriptionally+silent+but+their+heterochromatin+maintains+a+transcriptional+permissive+histone+acetylation+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Assisted+Reproduction+and+Genetics%22%5BJournal%5D)">Fully-mature antral mouse oocytes are transcriptionally silent but their heterochromatin maintains a transcriptional permissive histone acetylation profile.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 28 (12), 1193-1196 (2011).</li>
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</ol>

作者无利益冲突。

通过使用此处描述的方法，我们检测了哺乳动物卵母细胞中的双链断裂（DSBs）。该方法可用于检测和研究卵母细胞中的DNA修复过程。相同的实验方案也可用于分析参与哺乳动物卵母细胞生理过程的其他蛋白质。深入研究卵母细胞对潜在DNA损伤的响应机制，对于更好地理解人类女性亚生育力的成因具有重要意义。
研究哺乳动物卵母细胞中的DNA损伤应答具有挑战性，因为卵母细胞极为敏感。卵母细胞操作需要特定的温度和CO₂条件，以维持其生理状态并防止非特异性应激反应。2 和 O2 浓度。同时，卵母细胞必须避光保护。 &#913;所有操作均应使用玻璃移液管进行，且不得&#959; 狭窄，因为这可能对卵母细胞有害，但也不应过于&#959; 较宽，因为这可能导致固定液被稀释，从而对固定步骤产生不利影响。在固定的每一步中，均使用数滴缓冲液以尽量减少稀释效应。观察双链断裂的另一种方法是彗星试验。24尽管该技术更为灵敏，但也更加复杂。同时，使用彗星试验无法检测到DNA损伤发生的具体区域，而在富含RNA分子的细胞（如GV期卵母细胞）中25，背景信号可能增强，导致出现假性的DNA损伤信号26.
通过使用此处所述的免疫荧光方案，我们可以准确检测GV期卵母细胞中的双链断裂（DSBs），并根据γH2AX荧光随时间的减弱来评估其修复进程。然而，该方法的一个局限性在于，某些抗体可能在整个卵质中呈现非特异性分布，从而导致图像背景荧光较高。我们采用PFA-Tx-100缓冲液而非依次使用PFA和Tx-100，因为我们发现该缓冲液可改善固定效果，减少背景和非特异性荧光信号。使用γH2AX检测DSB的第二个局限性是，在生发泡破裂（GVBD）之后无法再评估DNA损伤，因为在减数分裂过程中γH2AX会发生自发性磷酸化23。
在此免疫荧光实验方案中，卵母细胞需保持在液体缓冲液中，无法储存在载玻片内。这一特点使得在加入二抗数天后难以完好保存固定后的细胞。为了获得高质量的图像并避免信号丢失，建议在加入二抗后的数小时内完成成像。还应注意，通过Z轴对细胞核进行扫描时，可能因过度曝光而导致信号减弱。因此，建议降低激光功率并提高扫描速度。
最后，免疫荧光实验方案的另一个局限性在于其仅适用于固定细胞或非活细胞。因此，我们只能估计特定时间点因子的存在与否，而无法了解其浓度是否随时间发生波动，或其行为是否发生变化。这一问题可通过活细胞成像结合荧光标记的分子标记物来克服。

哺乳动物雌性生殖细胞的减数分裂过程在出生前于卵巢中启动。卵母细胞的总数主要在胚胎发生期间于卵巢中建立。卵母细胞进入减数分裂后，会停滞在减数第一次分裂前期1。在青春期开始后，随着促卵泡激素（FSH）和黄体生成素（LH）的产生及其内分泌作用，卵母细胞可重新启动并完成减数分裂2。在人类中，前期停滞可持续长达50年3。进入减数第一次分裂后的细胞分裂是不对称的，产生一个体积较小的极体和一个保持原有大小的卵母细胞。因此，在早期胚胎发生过程中，大多数细胞质成分被保留在卵质中4。随后，卵母细胞进入减数第二次分裂，此时不重新形成细胞核，也不解凝染色体，并停滞在减数第二次分裂中期，直至受精发生5。
卵母细胞区别于体细胞的一个独特特征是其处于第一次减数分裂前期的停滞状态，此时卵母细胞具有完整的细胞核（生发泡 [GV] 停滞），该阶段被称为 GV 期6。根据染色质的组织方式，GV 期卵母细胞可分为两类：核仁非包绕型（NSN）和核仁包绕型（SN）7,8。在 NSN 型 GV 期卵母细胞中，染色质分布于整个核区，转录活动活跃；而在 SN 型卵母细胞中，染色质形成致密环状结构，包绕在核仁周围，转录处于沉默状态9。两种类型的 GV 期卵母细胞均具备减数分裂能力，进入减数分裂的速率相同，但 NSN 型卵母细胞的发育潜能较低，无法发育至二细胞期胚胎之后10。
前期I期长期停滞的状态增加了DNA损伤累积的发生率11。因此，卵母细胞中的DNA损伤应答机制对于产生具有遗传完整性的配子，并确保所形成的胚胎具有正常的染色体组成至关重要。
DNA损伤应答的核心环节是DNA修复。真核细胞中双链断裂（DSB）修复的主要通路包括非同源末端连接（NHEJ）、同源重组（HR）以及替代性NHEJ12,13,14,15。NHEJ是一种较快但更容易出错的修复机制，而HR完成所需时间较长，但具有高保真性16。
关于卵母细胞用于DNA损伤修复的机制，目前了解尚不充分。研究表明，使用遗传毒性试剂（如依托泊苷、多柔比星或UVB及电离辐射）在完全成熟的哺乳动物卵母细胞中诱导的DNA损伤，并不影响其从第一次减数分裂前期阻滞状态退出的时间和速率。17. 即使存在高水平的DNA损伤，卵母细胞仍可能发生生发泡破裂（GVBD）。这种损伤可通过观察γH2AX的荧光信号来确定 &#947;H2AX。这种H2AX的磷酸化形式（&#947;&#919;2&#913;&#935;γH2AX 是一种双链断裂（DSB）标志物，定位于断裂位点，可作为支架促进修复因子和蛋白质在断裂末端的聚集18.
DNA损伤后细胞周期阻滞的缺失是由于DNA损伤检测点功能不足，导致未修复DNA的卵母细胞重新进入减数分裂。在高水平DNA损伤情况下，检测点可通过激活ATM/Chk1依赖性通路来维持前期阻滞状态。对双链断裂（DSBs）的检测点反应有限，其原因是ATM的激活程度有限17,19。在减数分裂I的M期，研究表明DNA损伤可能激活由纺锤体组装检测点（SAC）诱导的减数分裂I检测点，从而抑制E3泛素连接酶——后期促进复合物/环体（APC/C）的活性，因此阻止M期的退出。此外，SAC蛋白的缺失可克服M期阻滞状态，凸显了SAC在建立减数分裂I检测点中的重要作用20。
正如先前的研究明确表明，双链断裂（DSBs）无法在小鼠卵母细胞中诱导出强大的前期检查点。如果此类损伤未被修复，可能导致胚胎携带染色体异常。因此，研究雌性配子发生不同阶段的DNA损伤应答机制，对于深入理解卵母细胞应对潜在遗传损伤的独特通路具有重要意义。

<table><tbody><tr><td>3 mL 拉西氏吸管（LDPE 材质，带刻度）</td><td>APTACA</td><td>1502</td><td></td></tr><tr><td>10 cc 注射器</td><td>SoftCare</td><td>114.104.21</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 标记的山羊抗兔二抗</td><td>Biotium</td><td>20012</td><td></td></tr><tr><td>抗磷酸化-H2A.X（Ser139）</td><td>默克密理博</td><td>07-164</td><td></td></tr><tr><td>ARE 加热磁力搅拌器</td><td>VELP Scientifica</td><td>F20500162</td><td></td></tr><tr><td>BD FALCON 5 mL 聚苯乙烯圆底管</td><td>BD 生物科学</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>BD Microlance 3 针头 27 G - 0.40 × 13 mm</td><td>Becton Dickinson</td><td>300635</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白第五组分</td><td>罗氏</td><td>10735078001</td><td></td></tr><tr><td>DMSO 无水</td><td>Biotium</td><td>90082</td><td></td></tr><tr><td>DRAQ7 DNA 染料</td><td>生物状态</td><td>DR71000</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378-25G</td><td></td></tr><tr><td>EMSURE MgCl₂·6H₂O</td><td>默克密理博</td><td>1058330250</td><td></td></tr><tr><td>依托泊苷</td><td>CHEMIPHARM</td><td>L01CB01</td><td></td></tr><tr><td>FALCON 14 mL 聚苯乙烯圆底管</td><td>康宁科学</td><td>532057</td><td></td></tr><tr><td>FALCON 细胞培养皿，易握型，35 × 10 mm 型号</td><td>康宁科学</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>玻璃底培养皿（35 mm 培养皿 / 14 mm 微孔，No. 0 盖玻片）</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6147-25G</td><td></td></tr><tr><td>HERACELL 150i CO2 培养箱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>50116048</td><td></td></tr><tr><td>IBMX 粉末</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Leica M125 体视显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M16 培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7292</td><td></td></tr><tr><td>M2 培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7167</td><td></td></tr><tr><td>矿物油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5310</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>霍尼韦尔</td><td>13412H</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>默克密理博</td><td>1064981000</td><td></td></tr><tr><td>尼康AX ECLIPSE Ti2共聚焦显微镜</td><td>尼康公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>尼康 SMZ800N 体视显微镜</td><td>尼康公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德移液管，玻璃，长型，230 mm</td><td>DURAN WHEATON KIMBLE</td><td>357335</td><td></td></tr><tr><td>pH/氧化还原电位计&amp;nbsp;</td><td>Hanna Instruments Ltd</td><td>HI2211</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液片剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1851</td><td></td></tr><tr><td>PMSG 蛋白冻干粉</td><td>Genway Biotech（现为 AVIVA Systems Biology）</td><td>GWB-2AE30A（现为OPPA01037）</td><td></td></tr><tr><td>QBD4 干式金属浴</td><td>Grant Instruments (Cambridge) Ltd</td><td>A25218</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Puradisc 25 mm 0.2 &amp;mu;m 滤光片</td><td>GE Healthcare</td><td>6780-2502</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠卵母细胞中dna双链断裂的检测

Detection of DNA Double-Stranded Breaks in Mouse Oocytes

卵母细胞是女性体内体积最大且寿命最长的细胞之一。它们在胚胎发育期间于卵巢中形成，并长期停滞在减数第一次分裂的前期。这种静止状态可能持续数年，直到卵母细胞接收到生长刺激，并获得恢复减数分裂的能力。这种长期的停滞状态使其极易积累DNA损伤，从而影响雌性配子的遗传完整性，进而影响未来胚胎的遗传稳定性。
因此，开发一种准确检测DNA损伤的方法至关重要，因为这是建立DNA损伤应答机制的第一步。本文描述了一种常用实验方案，用于检测在20小时期间内处于前期停滞状态的卵母细胞中DNA损伤的存在及其进展。具体而言，我们解剖小鼠卵巢，获取卵丘-卵母细胞复合体（COCs），从COCs中去除卵丘细胞，并将卵母细胞培养于含有3-异丁基-1-甲基黄嘌呤的Μ2培养基中，以维持其停滞状态。随后，用细胞毒性抗肿瘤药物依托泊苷处理卵母细胞，以诱导双链断裂（DSBs）。
通过使用免疫荧光和共聚焦显微镜技术，我们检测并定量核心蛋白γH2AX的水平，该蛋白是组蛋白H2AX的磷酸化形式。在DNA损伤后，H2AX会在双链断裂（DSB）位点发生磷酸化。卵母细胞中DNA损伤后无法恢复DNA完整性，可能导致不孕、出生缺陷以及自然流产率升高。因此，理解DNA损伤应答机制，同时建立一套完整的方法来研究这些机制，对于生殖生物学研究至关重要。

按照本实验所示方法，分离小鼠卵巢，去除脂肪组织，并收集完全成熟的GV期卵母细胞。随后，使用细口径移液器反复吹打去除卵丘细胞，将卵母细胞置于新鲜M2-IBMX培养基液滴中，并在37 °C加热板上以矿物油覆盖（图1A-F）。使用20 mg/mL的依托泊苷母液配制三种不同浓度的工作液（5 µg/mL、20 µg/mL和50 µg/mL）。将GV期卵母细胞分别置于含上述三种依托泊苷浓度的液滴中，在37 °C、避光、矿物油覆盖条件下孵育1小时。随后按照实验方案部分详细描述的免疫荧光流程进行操作，将卵母细胞转移至玻璃底培养皿中，通过共聚焦显微镜观察（图2）。
在SN GV期卵母细胞中，DNA损伤发生后，所有依托泊苷浓度（5 µg/mL、20 µg/mL和50 µg/mL）下γH2AX的信号均增强，且γH2AX分布于整个DNA区域（图3）。通过观察DNA位点处γH2AX的荧光强度来进行DSB的定量与评估。γH2AX荧光强度随依托泊苷浓度的增加而呈比例增强。此外，在长期的前期阻滞（依托泊苷处理20小时后），GV期卵母细胞表现出减少γH2AX焦点数量和荧光强度的能力，提示GV期阻滞的卵母细胞中存在活跃的DNA修复过程（图3E）。
与SN卵母细胞中γH2AX荧光分布在DNA整个区域不同，在用20 µg/mL依托泊苷处理后，NSN卵母细胞中的γH2AX立即呈现为焦点状分布。我们估算了与DNA区域重合的焦点数量，计算了每个焦点的荧光强度，并展示了所有卵母细胞的平均荧光强度。两种卵母细胞类别的焦点荧光强度和数量均表现出统计学上的显著差异（图4）。
共聚焦显微镜可提供不同Z轴层面上焦点数量和强度的信息，从而有助于识别DNA损伤的存在以及在不同时间点的修复动态。伽利略扫描能够实现高精度扫描，具有较低的背景信号，可对扫描图像进行更佳的分析。
<img alt="依托泊苷处理后卵母细胞中的γH2AX荧光；共聚焦显微镜，实验设置，数据图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65494/65494fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：延长生发泡阻滞期后，经三种不同浓度依托泊苷处理的SN GV期卵母细胞中γH2AX的减少。（A）SN GV期卵母细胞在依托泊苷处理后0小时的γH2AX荧光。在所有依托泊苷浓度下，暴露后γH2AX立即增加，且增加呈浓度依赖性（绿色：γH2AX，品红色：DNA）。图像为Z轴投影图，各通道的亮度/对比度使用Fiji / ImageJ进行调整。比例尺 = 10 µm。（B）SN GV期卵母细胞在不同浓度依托泊苷处理后0小时的γH2AX荧光图。数据表示为均值 ± 标准误（SEM）。每个点代表一个卵母细胞（卵母细胞数量显示在图中）（ns = 无显著性差异，** p &lt; 0.005，**** p &lt; 0.0001，采用Tukey多重比较检验的单因素方差分析）。（C）SN GV期卵母细胞在依托泊苷处理后20小时的γH2AX荧光。在所有依托泊苷浓度下，暴露20小时后γH2AX减少（绿色：γH2AX，品红色：DNA）。图像为Z轴投影图，各通道的亮度/对比度使用Fiji/ImageJ进行调整。比例尺 = 10 µm。（D）SN GV期卵母细胞在不同浓度依托泊苷处理后20小时的γH2AX荧光图。数据表示为均值 ± 标准误（SEM）。每个点代表一个卵母细胞（卵母细胞数量显示在图中）（ns = 无显著性差异，* p &lt; 0.05，** p &lt; 0.005，*** p &lt; 0.0005，**** p &lt; 0.0001，采用Tukey多重比较检验的单因素方差分析）。（E）在依托泊苷处理的卵母细胞中，经历前期阻滞后SN GV期卵母细胞γH2AX荧光减少的柱状图。每根柱上方的数字表示γH2AX荧光下降的百分比。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65494/65494fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="γH2AX检测：荧光显微镜观察与图表；依托泊苷诱导的卵母细胞DNA损伤" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65494/65494fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4NSN GV期卵母细胞经依托泊苷处理后Η2ΑΧ的磷酸化 20 µg/mL. (A代表性共聚焦图像显示一个对照组NSN GV期卵母细胞（绿色：γH2AX，品红色：DNA）。图像为Z轴层扫投影，使用Fiji/ImageJ对各通道的亮度/对比度进行了调整。比例尺 = 10 µm. (B) 一例经依托泊苷处理的非浓缩型生发泡期卵母细胞的代表性共聚焦图像（绿色：γH2AX，品红色：DNA）。卵母细胞在依托泊苷处理后0小时被固定。图像为Z轴层扫投影，使用Fiji/ImageJ对各通道的亮度/对比度进行了调整。比例尺 = 10 µm. (CNSN GV期卵母细胞中标准化的γH2AX荧光 20 µg/mL 依托泊苷处理。数据表示为均值 ± 标准误（SEM）。每个点代表一个卵母细胞（卵母细胞数量显示在图中），数据来自两次独立实验（**** p &lt; 0.0001，非配对非参数检验 t-检验，Mann-Whitney U-测试）。 (DNSN GV期卵母细胞中γH2AX焦点数量 20 µg/mL 依托泊苷处理。数据表示为均值 ± 标准误（SEM）。每个点代表一个卵母细胞（卵母细胞数量显示在图中），数据来自两次独立实验（**** p &lt; 0.0001，非配对非参数检验 t-检验，Mann-Whitney U-测试）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65494/65494fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

维持卵母细胞基因组的完整性对于确保胚胎遗传信息的准确性至关重要。本文介绍了一种用于检测哺乳动物雌性生殖细胞中DNA双链断裂的精确方案。

小鼠卵母细胞中DNA双链断裂的检测

卵母细胞是女性体内体积最大、寿命最长的细胞之一。它们在胚胎发育期间于卵巢中形成，并长期保持……

我们的研究旨在阐明哺乳动物卵母细胞及着床前胚胎中细胞周期的调控机制。研究的一个关键方面是检测卵母细胞在不同成熟阶段以及着床前胚胎中的DNA修复能力与DNA损伤应答。我们尤其关注在发生潜在DNA损伤后，细胞周期检验点如何响应，以及哪些修复机制被激活。本实验室首次从机制上研究了哺乳动物卵母细胞中的DNA损伤应答。我们证实了哺乳动物卵母细胞中缺乏G2前期DNA损伤检查点，并观察到纺锤体组装检查点在DNA损伤后建立中期阻滞中的重要性。通过使用本方案，可准确检测DNA双链断裂，判断卵母细胞是否存在DNA损伤，以及DNA损伤是否正在被修复。本方案涉及免疫荧光技术的应用，该技术可使我们确定 DNA 损伤的精确位点。首先，在塑料组织培养皿中制备 M2 IBMX 培养基液滴，并将培养皿置于 37 摄氏度的加热块上，至少预热 30 分钟，然后再进行卵母细胞的分离。解剖处死小鼠的卵巢，并将其置于含有 M2 IBMX 的 5 毫升圆底离心管中。将卵巢转移至含有1.5毫升M2 IBMX的塑料培养皿盖中。去除卵巢周围的脂肪组织或输卵管片段，并使用27号针头对卵巢进行机械穿刺，释放卵丘-卵母细胞复合体。将卵丘-卵母细胞复合体转移至含有M2 IBMX液滴的培养皿中，使用细口玻璃巴斯德移液管反复吹打，去除卵丘细胞。选择周围有核仁的生发泡（GV期）卵母细胞，并将其转移至置于37摄氏度加热板上、避光条件下的M2 IBMX液滴中。使用依托泊苷诱导双链断裂后，将GV期卵母细胞置于黑暗中的加热板上，在含有基因毒性试剂的液滴中孵育1小时。向卵母细胞中添加含有400微摩尔IBMX的M16培养液液滴，以维持其长期停滞状态。将培养皿置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中。将对照组和依托泊苷处理的生发泡或GV期卵母细胞分别放入含有PFA-Tx-100缓冲液的不同塑料组织培养皿中，在室温下固定40分钟。在室温下用三份不同的50微升洗涤缓冲液冲洗卵母细胞，然后将其置于25微升封闭缓冲液中，在加热金属块上封闭1小时。接下来，准备识别γH2AX的一抗。用封闭缓冲液按1:200的比例稀释一抗，并将卵母细胞浸入15微升液滴中，在4摄氏度下孵育过夜。用三份不同的50微升洗涤缓冲液清洗卵母细胞。配制 Alexa Fluor 488 标记的山羊抗兔二抗。用封闭缓冲液稀释后，将卵母细胞浸入含有15 µL抗体的液滴中，在37 °C金属浴中避光孵育1小时。取远红荧光DNA染料DRAQ7，在室温避光条件下将卵母细胞转移至其中染色10分钟，随后用三种不同的洗涤缓冲液清洗卵母细胞。在用于共聚焦显微镜观察的35毫米玻璃底培养皿中，向卵母细胞加入少量洗涤缓冲液。打开共聚焦系统的激光控制器和激光器。开启显微镜控制器和光源后，启动共聚焦成像软件，并选择40倍油镜。将含有卵母细胞的培养皿放入样品托中，使用操纵杆移动载物台的 X、Y 和 Z 轴，尝试对卵母细胞进行聚焦。针对每个实验，独立设置激光功率、增益和针孔大小，以尽量减少信号饱和。对于每个卵母细胞，将感兴趣区域（ROI）特异性地设定在细胞核的 DNA 区域。定义DNA区域的边界，并将Z轴步长调整为3微米。然后开始扫描。将所选文件夹中每个细胞的图像保存。打开 ImageJ 软件，依次点击图像（Image）、颜色（Color）和拆分通道（Split Channels）以拆分所有通道。点击查找表（Lookup Table）并为每个通道选择偏好的颜色。点击图像（Image）、颜色（Color）和合并通道（Merge Channels）以合并 γH2AX 和 DNA 的通道。对于DNA损伤水平较高的核周卵母细胞，点击图像、堆栈、Z轴投影，然后使用自由手选工具选择整个DNA区域。接着点击分析，再选择测量，以测定γ-H2AX荧光强度，并将测量结果复制到Excel文件中。本图显示了依托泊苷处理后0小时核周卵母细胞GV期的γ-H2AX荧光强度。在所有依托泊苷浓度处理后，gamma H2AX 立即升高，且升高程度呈浓度依赖性。此处显示的是依托泊苷处理后 20 小时周围卵母细胞生发泡期（GV 阶段）核中的 gamma H2AX 荧光。在所有依托泊苷浓度处理后 20 小时，gamma H2AX 减少。经过长时间的前期阻滞，GV期卵母细胞表现出减少γ-H2AX焦点数量和强度的能力，提示在GV期阻滞的卵母细胞中存在活跃的修复过程。

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关键词：转基因小鼠，卵母细胞，显微注射，基因修饰，胚胎操作

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