一种可验证的微滴数字聚合酶链式反应检测方法用于腺相关病毒载体在泪液生物脱落研究中的检测

本方案可对复杂基质中的腺相关病毒载体进行定量。准确的检测与定量对于评估其在临床试验中的表现至关重要。该方案旨在填补当前在符合良好实验室规范的分子学研究设计中存在的监管空白。

作为病毒载体开发的一部分，监管机构要求对载体的生物排泄进行评估。数字滴落式PCR（ddPCR）是用于此类评估的一种有前景的技术，因其能够在无需标准曲线的情况下实现准确定量，并且相较于qPCR具有更高的灵敏度。在临床环境中遇到的复杂基质（如泪液）中进行准确定量，可能因PCR干扰和抑制作用而难以验证。

临床样本量有限时，若检测方法的灵敏度不足，也可能限制对稀有事件的检测能力。本方法建立了一种可重复且可灵活调整的基于数字滴落式PCR（ddPCR）的验证框架，用于确认检测方法在受监管研究中的适用性。该方法避免了特定的DNA提取步骤，从而实现更简化的验证流程，并提供了明确的评价标准，以评估检测方法的性能，确保其稳健性和可重复性。

该方案不仅可用于本文所述的泪液中腺相关病毒（AAV）检测，还有望应用于任何病毒载体脱落研究。它提供了一个稳健且可重复的框架，可在此基础上开发多种符合特定用途的规范性项目。首先，在室温下取解冻的液滴数字PCR（ddPCR）主混合液，并向其中加入探针、正向引物和反向引物。

根据屏幕上显示的建议组分，为每个扩增靶标配制主混合液，并根据需要调整引物和探针的浓度。充分涡旋混匀后，在小型离心机中短暂离心。加入限制性内切酶，颠倒混匀。

接下来，向 PCR 板的每个孔中加入 16.5 微升已配制好的预混液，并用透明粘性封膜密封 PCR 板。使用样本稀释缓冲液作为稀释液，按照本表中列出的方案配制质控（QC）稀释液，该表列出了用于验证准确性和精密度实验的推荐浓度。在 0.2 毫升 PCR 管中，用样本稀释缓冲液以 1 比 10 的比例稀释泪液样本。

然后密封管子。将样品在PCR仪中于95摄氏度加热10分钟，随后在4摄氏度保持至少5分钟。移除含有预混液的数字PCR板上的粘性封膜，按照板图所示，向96孔板的相应孔中加入5.5微升的QC稀释液。

然后向各孔中加入 5.5 µL 样品。向无模板对照（NTC）孔中加入 5.5 µL 样品稀释缓冲液。使用无核酸酶水将 2x ddPCR 缓冲液对照按 1 比 2 的比例稀释。

向某一列中的任何空孔加入22微升缓冲液。在板上加一层可穿刺的铝箔封膜，然后将板放入板封仪中。在180摄氏度下密封5秒钟。

将培养板在最大转速下涡旋至少30秒，并在平板离心机中短暂离心。在自动液滴生成仪的触摸屏上，选择平板图中包含样品的列。

仪器的载台会亮起指示灯，以提示所需的耗材。从后向前装载液滴发生器。当耗材充足时，黄灯会变为绿灯以示提示。

将一个预冷的金属块放入液滴板支架中。确保该金属块完全呈现蓝色，无任何粉红色可见。将一块新的96孔数字PCR板放入该预冷金属块中。

将制备好的PCR板放入样品板架中。关闭仪器盖，按下“开始”按钮进行液滴生成。30分钟内，从冷区取出含有液滴的反应板。

将可穿刺的铝箔封膜贴在板上，并将板放入板封仪中。在180摄氏度下密封五秒钟。然后将板放入适配的热循环仪中，并设置屏幕上显示的循环条件。

将反应板装入液滴读数仪，确保读数仪内有足够的读数油，且废液容器有足够空间。最后，按下软件上的“读取”按钮以开始读取液滴。计算每次检测中各浓度的板内均值，并以此评估检测的精密度和准确度。

在所有质控水平中，批内精密度的平均值为7.7%，批内绝对准确度的平均值为4.2%。批间准确度和精密度则通过计算每批中各质控水平的批内均值来确定。结果显示，批内精密度范围为4%至8.5%，批内绝对准确度范围为1%至3.2%。

同样，对于层级样本，在高浓度加标水平下的平均批内精密度为3.7%，低浓度加标水平下为12.2%；在高浓度水平下的平均批内绝对准确度为11.3%，低浓度水平下为8.1%。在批内计算的情况下，高浓度水平的精密度为5.5%，低浓度水平为7.1%；绝对准确度在高浓度水平为11.3%，低浓度水平为8.1%。