Name: 在宏观水凝胶中包埋无细胞蛋白质合成反应的方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: 学习将无细胞蛋白质合成反应包埋于琼脂糖水凝胶中的方法，利用大肠杆菌裂解液表达eGFP和mCherry荧光蛋白。该技术为开发生物可降解诊断设备提供了新途径，可实现实验室外的分子检测功能。

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作者非常感谢生物技术和生物科学研究理事会资助项目 BB/V017551/1（S.K.、T.P.H.）和 BB/W01095X/1（A.L.、T.P.H.），以及工程与物理科学研究理事会—国防科学技术实验室资助项目 EP/N026683/1（C.J.W.、A.M.B.、T.P.H.）的支持。支持本出版物的数据在以下网址公开提供：10.25405/data.ncl.22232452。为了实现开放获取，作者已对由此产生的任何作者接受稿版本应用了知识共享署名（CC BY）许可。

1. 细胞裂解缓冲液和培养基的制备
<ol>
	<li>2x YT+P 琼脂和培养基的制备
	<ol>
		<li>通过称取 16 g/L 胰蛋白胨、10 g/L 酵母提取物、5 g/L NaCl、40 mL/L 1 M K2HPO4、22 mL/L 1 M KH2PO4 和 15 g/L 琼脂来制备 2x YT+P 琼脂。对于 2x YT+P 液体培养基，采用上述相同成分但不加琼脂。</li>
		<li>将 2x YT+P 培养基或琼脂通过高压灭菌进行灭菌。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>S30A 缓冲液的制备
	<ol>
		<li>使用 5.88 g/L 谷氨酸镁、12.195 g/L 谷氨酸钾和 25 mL/L 2 M Tris 配制 S30A 缓冲液，并用乙酸调节 pH 至 7.7。</li>
		<li>S30A 缓冲液可在 4 °C 下保存最多 1 周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>S30B 缓冲液的制备
	<ol>
		<li>使用 5.88 g/L 谷氨酸镁和 12.195 g/L 谷氨酸钾配制 S30B 缓冲液，并用 2 M Tris 调节 pH 至 8.2。</li>
		<li>S30B 缓冲液可在 4 °C 下保存最多 1 周。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 细胞裂解液制备（4天方案）
<ol>
	<li>第1天
	<ol>
		<li>将2x YT+P倒入添加了100 µg/mL氨苄青霉素的琼脂平板中。</li>
		<li>划线 E. coli 从-80 °C甘油菌种中取菌，并在37 °C过夜培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第2天
	<ol>
		<li>从2x YT+P平板上挑取单菌落，接种于1 L有挡板的三角瓶中的400 mL 2x YT+P液体培养基（添加氨苄青霉素）中。</li>
		<li>37 °C、220 rpm 振荡培养 24 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第3天
	<ol>
		<li>测量并记录 OD600 24小时培养物；在OD值达到足够生长时600 3-4 
		注意：取1 mL细菌培养液，用培养基（2x YT+P肉汤）进行系列稀释后再测定OD600 nm。计算OD时需考虑稀释效应600.</li>
		<li>将培养物均匀转移至预冷的500 mL离心管中。</li>
		<li>在 4,500 x g 4 °C下离心15分钟，弃去上清液。</li>
		<li>离心的同时，向先前配制的 S30A 缓冲液中加入 2 mL/L 的 1 M DTT，混匀后置于冰上保存。</li>
		<li>用200 mL S30A缓冲液重悬细胞沉淀。</li>
		<li>剧烈涡旋振荡瓶子，直至整个沉淀完全溶解，尽可能保持细胞处于冰上。</li>
		<li>在 4,500 x g 4 °C下离心15分钟，弃去上清液。</li>
		<li>重复步骤 2.3.5 至 2.3.7（包含）。</li>
		<li>向每个离心瓶中加入40 mL S30A缓冲液，重悬沉淀，转移至预先称重的50 mL离心管中。</li>
		<li>4,000 × g 离心 g 4 °C下离心15分钟。倾去上清液，并用移液器吸除残留的上清液，操作过程中尽量保持样品处于冰上。</li>
		<li>重新称量离心管，记录新的质量，并计算沉淀物的质量。</li>
		<li>将沉淀物在液氮中速冻，并于 −80 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第4天
	<ol>
		<li>将沉淀物在冰上解冻。</li>
		<li>每克菌体沉淀物中加入以下成分：1.2 mL S30A缓冲液（使用前添加DTT）、275 µL蛋白酶抑制剂（8 mM储备液）和25 µL溶菌酶（10 mg/mL储备液）。</li>
		<li>剧烈涡旋直至沉淀物完全溶解，无任何残留团块，并尽可能保持在冰上。</li>
		<li>在50 mL离心管中，以120 W、20 kHz、30%振幅，采用20秒开启/40秒关闭的脉冲模式，对细胞悬液进行5分钟的超声处理。</li>
		<li>4,000 × g 离心 g 在 4 °C 下离心 1 小时以沉淀细胞碎片。</li>
		<li>将上清液转移至新的50 mL离心管中。</li>
		<li>37 °C、220 rpm 条件下孵育试管 80 分钟。</li>
		<li>在S30B缓冲液中加入1 mL/L的1 M DTT以准备透析材料。混匀后取900 mL加入1 L无菌烧杯中，放入磁力搅拌子，并置于4 °C保存。</li>
		<li>跑流反应结束后，将步骤 2.4.7 中的细胞提取物转移至 2 mL 微离心管中，在 20,000 x g 4 °C 下离心 10 分钟。</li>
		<li>将无沉淀的上清液在冰上合并至50 mL离心管中。</li>
		<li>确定所制备细胞提取物体积总量，并将所需数量的10K MWCO透析盒浸入S30B中浸泡2分钟以进行水化。</li>
		<li>加载盒式组件 通过 一支最多可装3 mL提取物的注射器。每1 L烧杯中最多放入三个透析盒，在4 °C下搅拌透析3小时。</li>
		<li>透析完成后，提取液变得澄清，此时将提取液转移至2 mL 微型离心管中。在20,000 x g 4 °C 下离心 10 分钟。</li>
		<li>将澄清的提取物合并至预冷的离心管中，置于冰上，短暂涡旋混匀。</li>
		<li>使用荧光计测定提取物的蛋白质浓度。</li>
		<li>使用预冷的ddH₂O将提取物稀释至浓度为44.5 mg/mL2O.</li>
		<li>分装为每份200 µL，液氮中速冻，于−80 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 冻干水凝胶的制备（方法 A）
<ol>
	<li>称取 0.75 g 琼脂糖，加入 ddH2O 至总体积为 100 mL，置于微波炉中高温加热，每次 30 秒，反复加热至琼脂糖完全熔化，制成熔融琼脂糖母液。</li>
	<li>使用移液器将 50 µL 熔融琼脂糖转移至 1.5 mL 微量离心管中，静置 20–30 分钟使其聚合（若将凝胶置于冰箱中，可加快聚合速度）。</li>
	<li>将含有已聚合凝胶的微量离心管在液氮中速冻。</li>
	<li>取下离心管盖，用石蜡膜覆盖离心管口，并用针头或移液器吸头在膜上刺若干小孔。</li>
	<li>将含有已聚合凝胶的微量离心管转移至 −80 °C 保存 1–2 小时。</li>
	<li>从 −80 °C 取出离心管，放入冷冻干燥机中，确保管内完全干燥。</li>
	<li>启动冷冻干燥机，设置参数如下：温度：−20 °C，压力：0.1 mbar。</li>
	<li>使凝胶在冷冻干燥机中过夜干燥。</li>
	<li>从冷冻干燥机中取出凝胶，放入 −80 °C 保存，待用。 
	&#8203;注意：凝胶在冷冻干燥状态下可保存长达 1 年。</li>
</ol>
4. 14倍能量溶液储备液的制备
<ol>
	<li>在冰上将所有反应组分（表1）加入一个15 mL离心管中，配制14倍能量溶液。</li>
	<li>将14倍能量溶液分装至1.5 mL微量离心管中，于−80 °C保存（也可使用更小体积的分装量）。 
	&#8203;注意：若避免反复冻融，14倍能量溶液可在−80 °C保存数月。</li>
</ol>
4倍氨基酸母液的配制
<ol>
	<li>在冰上解冻 RTS 氨基酸试剂盒中的全部 20 种氨基酸组分。涡旋振荡氨基酸溶液，确保其完全溶解。</li>
	<li>在 50 mL 离心管中混合全部 20 种氨基酸，并加入 12 mL 无菌 ddH2O。涡旋振荡至溶液澄清，仅保留轻微的乳白色浑浊。</li>
	<li>将 4 倍浓度的氨基酸溶液分装至 1.5 mL 微量离心管中（每管 500 µL）。</li>
	<li>用液氮瞬时冷冻 4 倍浓度的氨基酸溶液分装样品，并将样品转移至 −80 °C 保存。</li>
</ol>
6. 无细胞缓冲液校准
注意：用于水凝胶反应的CFPS缓冲液，其DTT、Mg-谷氨酸盐和K-谷氨酸盐浓度的优化参照Banks等人的方案34，该方案经Sun等人35修改而来。通过实验设计（DOE）方法选择校准反应的组分，针对K-谷氨酸盐（200 mM、400 mM、600 mM、1,000 mM、1,200 mM、1,400 mM）、Mg-谷氨酸盐（0 mM、10 mM、20 mM、30 mM、40 mM、50 mM、60 mM）和DTT（0 mM、5 mM、10 mM、15 mM、20 mM、25 mM、30 mM）储备液分别设定了七个因素水平。使用JMP Pro 15生成自定义DOE设计方案（表2），并进行分析以确定各因素的最佳浓度。
<ol>
	<li>从 −80 °C 保存条件下取出无细胞提取物，并在冰上解冻。</li>
	<li>在冰上解冻 4x 氨基酸、14x 能量溶液、40% PEG-8000、质粒 DNA、3 M K-谷氨酸盐、100 mM Mg-谷氨酸盐和 100 mM DTT 储液。</li>
	<li>通过混合 12.5 µL 4x 氨基酸、3.57 µL 14x 能量溶液、2.5 µL 40% PEG-8000、3 µg 质粒 DNA 和 10 µL 无细胞提取物（44.5 mg/mL），用 ddH2O 补足至每反应 35 µL，配制校准主混合液。</li>
	<li>将 35 µL 主混合液分装至黑色 384 孔微孔板的各孔中。</li>
	<li>根据实验设计（DOE），向每个反应中加入适量的 Mg-谷氨酸盐、K-谷氨酸盐和 DTT，并用 ddH2O 补足至每反应 50 µL。</li>
	<li>将微孔板转移至酶标仪中，按照所述酶标仪设置（针对 mCherry）进行荧光检测与分析：激发波长 587 nm，发射波长 610 nm，波长带宽 12 nm，光学模式：顶部读数，温度：37 °C，每 5 分钟采集一次荧光信号，总读数时间为 4 小时。在 60 rpm 脉冲振荡条件下孵育微孔板。</li>
	<li>将结果上传至 JMP 实验设计（DOE）中，生成预测轮廓图，以确定 K-谷氨酸盐、Mg-谷氨酸盐和 DTT 的最佳浓度水平，响应变量为本实验中的最大荧光强度和反应速率。</li>
	<li>按照 表 3 所示组合试剂，配制 2X CFPS 缓冲液。</li>
	<li>分装并储存于 −80 °C。</li>
</ol>
7. 再水化冻干水凝胶中的无细胞蛋白合成（方法 A）
注意：CFPS 反应中使用的质粒是利用 EcoFlex 模块化工具包中的组分构建的 E. coli36 并在Whitfield等人中描述过11&#160;mCherry 和 eGFP 受组成型 JM23100 启动子调控。这些组分可从 Addgene 获取。
<ol>
	<li>从 −80 °C 保存条件下取出无细胞提取物，在冰上解冻约 20 分钟。</li>
	<li>取出 2x CFPS 缓冲液和质粒 DNA，并在冰上解冻。</li>
	<li>取出冻干水凝胶，将其置于实验台面上静置 15 分钟，使其升至室温。</li>
	<li>将水凝胶转移至 1.5 mL 微离心管中，必要时使用手术刀修剪水凝胶，以便其适配孔位。</li>
	<li>在 1.5 mL 微离心管中，加入 10 µL 无细胞提取物、25 µL 2x CFPS 缓冲液和 4 µg 质粒 DNA，再用 ddH2O 补充至总体积 50 µL，配制 CFPS 溶液。</li>
	<li>用移液器将 CFPS 溶液滴加到冻干水凝胶上。</li>
	<li>在室温下让水凝胶在 CFPS 体系中浸泡 5–10 分钟。</li>
	<li>使用刮铲将水凝胶转移至黑色 384 孔微孔板中。</li>
	<li>将微孔板转移至酶标仪中，按照步骤 6.6 所述的酶标仪设置进行荧光检测与分析。代表性结果可参见先前的研究31,33。</li>
</ol>
8. 可部署水凝胶中的无细胞蛋白质合成（方法 B）
<ol>
	<li>从−80 °C保存条件下取出无细胞提取物，在冰上解冻约20分钟。</li>
	<li>收集质粒DNA，并在冰上解冻。</li>
	<li>在冰上的一个1.5 mL微量离心管中，将10 µL无细胞提取物与3 µg质粒DNA和25 µL 2x缓冲液混合&#160;CFPS 缓冲液，&#160;制作&#160;最终体积加至37.5 µL。</li>
	<li>测量 3&#160;克琼脂糖，加入100毫升去离子水2O缓冲液配制3%琼脂糖。</li>
	<li>将3%琼脂糖以高功率微波加热，每次30秒。</li>
	<li>将12.5 µL熔化的琼脂糖用移液器加入含有CFPS反应混合物的1.5 mL微量离心管中，总体积为50 µL。</li>
	<li>将熔化的琼脂糖置于50 °C的加热块中，使其冷却但不发生聚合。</li>
	<li>将融化的琼脂糖与CFPS溶液混合；混匀 通过 用移液枪头进行移液和搅拌，并迅速操作，以避免在CFPS溶液混合前发生凝胶聚合。</li>
	<li>让凝胶在室温下冷却并聚合约2分钟。</li>
	<li>用刮勺将聚合好的琼脂糖转移至1.5 mL 微量离心管中，并在液氮中速冻。</li>
	<li>将闪冻的水凝胶置于 −80 °C 条件下保存 1 小时。</li>
	<li>从储存中取出凝胶；打开微量离心管盖，用封口膜覆盖管口，并刺穿封口膜以使水分挥发。</li>
	<li>启动冷冻干燥机，设置参数如下：温度：−20 °C，压力：0.1 mbar，冷冻干燥18小时（过夜）。</li>
	<li>将冻干的CFPS装置保存于−80 °C条件下，直至使用。</li>
	<li>冻干的CFPS装置，其近似湿体积为50 µL，可用50 µL的ddH₂O重悬复水2O，避免过量液体。重悬约需30分钟。</li>
	<li>使用刮铲将凝胶转移至黑色384孔微孔板中。</li>
	<li>将微量滴定板转移至酶标仪，使用第6.6步所述的酶标仪设置进行荧光检测与分析。代表性结果可参见先前发表的文献。31,33.</li>
</ol>

Embedding CFPS Reactions in a Variety of Hydrogel Matrices

<ol><li>Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+synthetic+biology%3A+Engineering+in+an+open+world%5BTitle%5D)+AND+%22Synthetic+and+System+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free synthetic biology: Engineering in an open world.</a> Synthetic and System Biotechnology. 2 (1), 23-27 (2017).</li>
<li>Perez, J. G., Stark, J. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+synthetic+biology%3A+Engineering+beyond+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-free synthetic biology: Engineering beyond the cell.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (12), e023853(2016).</li>
<li>Jiang, L., Zhao, J., Lian, J., Xu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis+enabled+rapid+prototyping+for+metabolic+engineering+and+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Synthetic+and+System+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis enabled rapid prototyping for metabolic engineering and synthetic biology.</a> Synthetic and System Biotechnology. 3 (2), 90-96 (2018).</li>
<li>Kopniczky, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis+as+a+prototyping+platform+for+mammalian+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis as a prototyping platform for mammalian synthetic biology.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (1), 144-156 (2020).</li>
<li>Pandi, A., Grigoras, I., Borkowski, O., Faulon, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+cell-free+biosensors+to+monitor+enzymatic+production%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Optimizing cell-free biosensors to monitor enzymatic production.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (8), 1952-1957 (2019).</li>
<li>Khambhati, K., Bhattacharjee, G., Gohil, N., Braddick, D., Kulkarni, V. S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+potential+of+cell-free+protein+synthesis+for+extending+the+abilities+of+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Exploring the potential of cell-free protein synthesis for extending the abilities of biological systems.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 248(2019).</li>
<li>Focke, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+in+vitro+folding+with+cell+free+protein+synthesis+for+membrane+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Combining in vitro folding with cell free protein synthesis for membrane protein expression.</a> Biochemistry. 55 (30), 4212-4219 (2016).</li>
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</ol>

本文概述了两种将基于大肠杆菌（E. coli）细胞裂解液的无细胞蛋白表达系统（CFPS）反应整合到琼脂糖水凝胶中的实验方案。这些方法可实现基因在材料内部的同步表达。该方案可适用于其他CFPS系统，并已成功结合市售CFPS试剂盒以及本文详述的实验室制备细胞裂解液进行操作。重要的是，该方案可在无需外源液相的条件下实现基因表达，这意味着系统为自包含式，无需额外的无细胞反应浴。与以往在水凝胶内进行CFPS反应的方法不同，本方法无需外部缓冲液和反应容器。预计这些方法将帮助研究人员探索利用水凝胶材料作为无细胞合成生物学装置的底盘，最终推动此类装置走出实验室并实现实际应用。
两种方法成功的关键在于使用高质量的细胞裂解液。高质量的细胞裂解液应具有高蛋白浓度（&#62;40 mg/mL），在整个制备过程中需保持低温，且不应经历多次冻融循环。此外，DNA模板的高纯度也至关重要。为实现这一点，应使用高纯度、高得率的质粒提取试剂盒从细胞中提取质粒，以确保转录反应能在无细胞蛋白合成（CFPS）环境中顺利进行。这些关键步骤适用于所有CFPS应用，并非本方法所独有。然而，CFPS组分的制备对实...

合成生物学融合了多种工程学科，旨在设计和构建具有自然界中不存在功能的生物部件、装置和系统。目前大多数合成生物学方法仍局限于活细胞内进行。相比之下，无细胞合成生物学系统在设计上提供了前所未有的控制性和自由度，能够在摆脱传统基于细胞的基因表达方法诸多限制的同时，提高灵活性并缩短生物系统构建周期1,2,3。无细胞蛋白表达系统（CFPS）正被越来越多地应用于多个学科领域，包括构建人工细胞、原型化遗传回路、开发生物传感器以及代谢物生产4,5,6。此外，CFPS在表达难以在活细胞中有效产生的重组蛋白方面尤其有用，例如易聚集蛋白、跨膜蛋白和毒性蛋白6,7,8。
CFPS 通常在液相反应中进行。然而，这种方法可能限制其在某些情况下的应用，因为任何液相无细胞装置都必须置于反应容器中。本文所述方法的开发 rationale 在于提供将无细胞合成生物学装置嵌入水凝胶中的可靠方案，而非作为蛋白质生产平台 本身 但其目标是使水凝胶可作为无细胞装置在实验室之外应用的物理载体。将水凝胶用作无细胞蛋白合成（CFPS）载体具有多项优势。水凝胶是一类聚合物材料，尽管含水量很高（有时超过98%），但仍具有固体特性9,10,11它们可用作膏剂、润滑剂和粘合剂，广泛存在于从隐形眼镜、伤口敷料、海洋用胶带到土壤改良剂和婴儿尿布等多种产品中。9,11,12,13,14水凝胶也正在被积极研究作为药物递送载体9,15,16,17水凝胶还可能具有生物相容性、可生物降解性，并具备一定的自身刺激响应特性9,18,19,20因此，本研究的目标是实现分子生物学功能与材料科学之间的协同作用。为此，研究人员已致力于将无细胞合成生物学与多种材料相结合，包括胶原蛋白、锂藻土（laponite）、聚丙烯酰胺、纤维蛋白、PEG-肽和琼脂糖。11,21,22，以及用于涂覆玻璃、纸张和织物表面11,23,24 使用CFPS装置。本文所示方案演示了将CFPS反应嵌入宏观尺度（即 &#62;1 毫米）水凝胶基质，以琼脂糖作为典型材料。选择琼脂糖是因其具有高吸水能力、可控的自凝胶特性以及可调节的力学性能11,24,25,26琼脂糖还支持功能性无细胞蛋白合成（CFPS），且比许多其他水凝胶替代材料更便宜，并具有可生物降解性，使其成为一种有吸引力的实验模型系统。然而，这些方法此前已被证明适用于将CFPS包埋于多种替代性水凝胶中。11考虑到水凝胶的广泛应用以及无细胞蛋白合成系统（CFPS）的功能特性，本文所展示的方法可为研究人员开发适用于其特定需求的生物功能强化型水凝胶材料提供基础。
在以往的研究中，尺寸范围为 1 µm 至 400 µm 的微凝胶系统已被用于在浸没于反应缓冲液中的水凝胶内进行无细胞蛋白合成（CFPS）23,27,28,29,30,31。然而，将水凝胶浸没在 CFPS 反应缓冲液中的要求，限制了其作为独立材料应用的可能性。本文所介绍的方案使得 CFPS 反应可在水凝胶内部发生，而无需将凝胶浸没在反应缓冲液中。其次，使用宏观尺度的凝胶（尺寸介于 2 mm 至 10 mm 之间）可实现对水凝胶与无细胞基因表达之间物理相互作用的研究。例如，利用该技术，可以研究水凝胶基质如何影响 CFPS 反应11，以及 CFPS 反应如何反过来影响水凝胶基质31。更大尺寸的水凝胶还为开发新型可生物编程材料提供了可能32。最后，通过将 CFPS 反应嵌入水凝胶中，还有望减少对塑料反应容器的需求。在无细胞传感器的应用中，这相比依赖塑料耗材的装置具有明显优势。综上所述，将 CFPS 反应嵌入水凝胶中，为无细胞装置在实验室以外环境中的部署提供了多项优势。
本文所介绍方法的总体目标是实现细胞游离蛋白合成（CFPS）反应在水凝胶基质中的运行。文中展示了将细胞游离蛋白生产反应嵌入宏观尺度水凝胶材料中的两种不同方法（图1）。在方法A中，将CFPS组分引入已冻干的琼脂糖水凝胶中，形成具有活性的系统。在方法B中，将熔融琼脂糖与CFPS反应组分混合，形成完整的CFPS水凝胶系统，随后进行冻干并储存，直至需要时使用。这些系统可通过加入一定体积的水、缓冲液及待测物进行再水合，从而启动反应。
本研究采用 大肠杆菌 基于细胞裂解物的系统。这些是最常用的实验性无细胞蛋白质合成系统，因为 E. coli 细胞裂解物制备简单、成本低廉，且可获得高产量的蛋白质。该细胞裂解物补充了进行转录和翻译所需的各类大分子组分，包括核糖体、tRNA、氨酰-tRNA合成酶以及起始、延伸和终止因子。本文具体展示了利用琼脂糖水凝胶生产eGFP和mCherry的方法 E. coli 细胞裂解液，并使用酶标仪和共聚焦显微镜监测荧光的出现。微孔板酶标仪的代表性结果可参见 Whitfield 等人的研究。31，且底层数据可公开获取33此外，通过共聚焦显微镜确认凝胶中荧光蛋白的表达。本文展示的两种方案可用于基于细胞游离蛋白合成系统的遗传装置的组装与保存 在物质中 最终目标是构建一种适合的物理环境，以支持无细胞基因线路在野外部署条件下的分布。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-PGA</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-214793B</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10752.22</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Severn Biotech</td><td>30-15-50</td><td></td></tr><tr><td>氨基酸混合物试剂盒</td><td>VWR</td><td>BTRABR1401801</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8937-1G</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9501-1G</td><td></td></tr><tr><td>辅酶A（CoA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4282-100MG</td><td></td></tr><tr><td>CTP</td><td>Alfa Aesar</td><td>J14121.MC</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0862</td><td></td></tr><tr><td>亚叶酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7878-100MG</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Carbosynth</td><td>NG01208</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034-25G</td><td></td></tr><tr><td>K-谷氨酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1149-100G</td><td></td></tr><tr><td>溶菌酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876-1G</td><td></td></tr><tr><td>Mg-谷氨酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49605-250G</td><td></td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6522-250MG</td><td></td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Promega</td><td>V3011</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钾（KOH）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>757551-5G</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钾（K2HPO4）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786-500G</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾（KH2PO4）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RDD037-500G</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2714-1BTL</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 蛋白浓度检测试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A50668</td><td></td></tr><tr><td>Rossetta 2 DE 3 大肠杆菌</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71397-3</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-500G</td><td></td></tr><tr><td>亚精胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85558-1G</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-1321-01</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10109541001</td><td></td></tr><tr><td>UTP</td><td>Alfa Aesar</td><td>J23160.MC</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1625-1KG</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HS4323-500EA</td><td></td></tr><tr><td>10K MWCO 透析盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>66381</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心瓶</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>500 mL 离心瓶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3120-9500</td><td></td></tr><tr><td>Alpha 1-2 LD Plus 冷冻干燥机</td><td>Christ</td><td>货号 101521, 101522, 101527</td><td></td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H-X3R</td><td></td></tr><tr><td>黑色 384 孔微孔板</td><td>Fischer Scientific</td><td>66</td><td></td></tr><tr><td>比色皿</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>222S</td><td></td></tr><tr><td>Elga Purelab Chorus 超纯水系统</td><td>Elga</td><td>#####</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 微量离心机 5425R</td><td>Eppendorf</td><td>EP00532</td><td></td></tr><tr><td>高速离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>B34183</td><td></td></tr><tr><td>JMP 许可证</td><td>SAS Institute</td><td>15</td><td></td></tr><tr><td>磁力搅拌器</td><td>Fischer Scientific</td><td>15353518</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm 封口膜</td><td>Amcor</td><td>PM-966</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计（生物分光光度计）</td><td>Eppendorf</td><td>16713</td><td></td></tr><tr><td>移液器及吸头</td><td>Gilson</td><td>#####</td><td></td></tr><tr><td>精密天平</td><td>Sartorius</td><td>16384738</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 荧光计</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>摇床培养箱</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SHKE8000</td><td></td></tr><tr><td>超声破碎仪（超声波发生器）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12893543</td><td></td></tr><tr><td>恒温培养箱</td><td>Sanyo</td><td>MIR-162</td><td></td></tr><tr><td>注射器及针头</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>66490</td><td></td></tr><tr><td>Thermo max Q8000（摇床培养箱）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SHKE8000</td><td></td></tr><tr><td>Varioskan Lux 多功能酶标仪</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>VLBL00GD1</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie 2 涡旋振荡器</td><td>Cole-parmer</td><td>OU-04724-05</td><td></td></tr><tr><td>VWR PHenomenal pH 1100 L，pH/mV/&amp;deg;C 测量仪</td><td>VWR</td><td>662-1657</td><td></td></tr></tbody></table>

将无细胞蛋白质合成反应嵌入宏观水凝胶的方法

Methods for Embedding Cell-Free Protein Synthesis Reactions in Macro-Scale Hydrogels

合成基因网络为科学家和工程师提供了一个平台，用于设计和构建在基因水平上编码功能的新型系统。尽管基因网络的主要应用模式是在细胞底盘内实现，但合成基因网络也可部署于无细胞环境中。无细胞基因网络具有广阔的应用前景，例如作为生物传感器，已成功用于检测生物性目标物（如埃博拉病毒、寨卡病毒和SARS-CoV-2病毒）以及非生物性目标物（如重金属、硫化物、农药及其他有机污染物）。无细胞系统通常以液态形式在反应容器中使用。然而，若能将此类反应嵌入物理基质中，则可能促进其在更广泛环境中的应用。为此，研究人员已开发出将无细胞蛋白合成（CFPS）反应嵌入多种水凝胶基质中的方法。水凝胶材料的一个关键特性是其高含水量及良好的水化重构能力。此外，水凝胶还具备多种功能上有利的物理和化学特性。水凝胶可经冷冻干燥后储存，并在使用时重新水化。本文提供了两种将CFPS反应包埋于水凝胶中并进行检测的分步操作方案。首先，可将一个CFPS系统嵌入水凝胶中 通过 通过细胞裂解物复水。随后，水凝胶内的系统可被诱导或组成型表达，从而实现水凝胶中完整蛋白质的表达。其次，可在水凝胶聚合时将细胞裂解物引入其中，整个系统随后可进行冷冻干燥，并在后续使用含有诱导剂的水溶液进行复水，该诱导剂用于激活水凝胶内编码的表达系统。这些方法有望实现无细胞基因网络，赋予水凝胶材料感知能力，并具备在实验室以外环境中应用的潜力。

本方案详细介绍了将CFPS反应嵌入水凝胶基质的两种方法，图1展示了这两种方法的示意图。两种方法均可进行冷冻干燥并实现长期保存。方法A因以下两个原因被最广泛使用：首先，该方法已被证明适用于多种水凝胶材料11；其次，方法A支持对多个遗传构建体进行并行测试。方法B则更适用于优化系统的构建及现场应用。两种方案均可一次性制备大量样品，有助于提高实验的可重复性。这一特点对于该技术的长期发展也十分有利，因为冻干后的装置可以干燥状态运输，并在需要时于现场重新溶解使用。
本方案及图1中所述方法可用于单个基因构建体的表达，也可用于多个基因的共表达。在图2中展示的数据表明，eGFP和mCherry均能在0.75%琼脂糖凝胶中表达。通过共聚焦显微镜确认，蛋白质表达在水凝胶内部（包括深层平面）分布均匀。具体而言，蛋白质合成并未局限于水凝胶的外缘，内部荧光并非由蛋白质扩散所致。为验证这...

本文介绍了两种无需外加液相即可将无细胞蛋白合成反应嵌入宏观水凝胶基质中的实验方案。

合成基因网络为科学家和工程师提供了一个平台，用于设计和构建在基因水平上编码功能的新型系统。

我们知道生命系统会持续整合来自多种不同来源的信息，这些信号会触发复杂而微妙的响应。这些信息处理的大部分发生在分子层面。我们希望在材料内部操控这些过程，但无需依赖细胞。目的是赋予材料新的功能。本研究中的挑战主要与细胞蛋白合成反应相关，而非水凝胶的操作。无细胞反应需要高质量的细胞裂解液以及高纯度和高质量的DNA才能有效进行。本方案允许研究人员将分子生物学反应嵌入一种可生物降解的实体材料中，从而可在实验室外使用。此外，由于反应输出直接与材料底盘相互作用，因此有望开发出具有新型感知和响应能力的材料。从短期来看，我们认为这些方法为部署无细胞诊断装置提供了一条全新的途径。该方案能够以液体反应无法实现的方式创建并空间排列多种装置。我们的未来研究兴趣有两个方面。首先，我们希望拓展所用凝胶材料的性质，以赋予材料更多功能特性。其次，我们致力于提高在凝胶中运行的基因网络的复杂性和性能，以拓展这些系统的生物学功能。首先，将水凝胶转移至1.5毫升微量离心管中，必要时使用手术刀修剪凝胶，使其能够适配管内空间。在另一个1.5毫升微量离心管中，加入10微升无细胞提取物、25微升2倍浓度的无细胞蛋白质合成缓冲液，以及4微克质粒DNA。用双蒸水定容至总体积50微升，以制备无细胞蛋白合成溶液。将溶液用移液器加至冻干水凝胶上，于室温下孵育5至10分钟，使凝胶充分吸收无细胞蛋白合成体系。使用刮铲将凝胶转移至黑色384孔微孔板中。然后将微孔板转移至酶标仪中，并使用屏幕上显示的酶标仪设置进行荧光检测与分析。在冰上放置的1.5毫升微量离心管中，加入10微升无细胞提取物、4微克质粒DNA以及25微升2倍浓度的无细胞蛋白合成缓冲液，用双蒸水定容至总体积为50微升。制备无细胞蛋白合成溶液时，称取0.75克琼脂糖，加入100毫升双蒸水缓冲液中，配制成0.75%琼脂糖溶液。将0.75%琼脂糖在高功率下以每次30秒的间隔进行微波加热。然后将50微升熔化的琼脂糖用移液器加入1.5毫升微量离心管中，或加入所需形状的模具中。将熔化的琼脂糖置于设定为 50 摄氏度的加热块上，使其冷却但不发生聚合。然后用移液枪吸取并用枪头搅拌，将熔化的琼脂糖与无细胞蛋白合成溶液混合。让凝胶冷却至室温并聚合约两分钟。用刮勺将聚合好的琼脂糖转移至1.5毫升微量离心管中，并在液氮中速冻。将速冻后的水凝胶置于-80摄氏度条件下保存一小时。之后，取下微量离心管的管盖。用石蜡膜覆盖管子，并刺穿膜以使水分干燥。将冷冻干燥机的温度设置为零下20摄氏度，压力设置为0.1毫巴，对无细胞蛋白合成装置进行冷冻干燥处理18小时或过夜。用50微升双蒸水重新水化冻干的装置30分钟，避免液体过量，并用刮勺将凝胶转移至黑色384孔微孔板中。最后，将微孔板放置在酶标仪上，并使用屏幕上显示的酶标仪设置进行荧光检测与分析。本图展示了利用大肠杆菌细胞裂解液在水凝胶中进行的无细胞蛋白质合成，表达产物为eGFP和mCherry。实验制备了0.75%琼脂糖凝胶，分别设置为：不含DNA模板、含4微克eGFP模板、含4微克mCherry模板，或同时含4微克eGFP和4微克mCherry模板。还展示了两个通道的叠加图像，叠加图像中包含了微分干涉相差图像。结果证实了mCherry和eGFP在琼脂糖中的共表达。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

在宏观水凝胶中包埋无细胞蛋白质合成反应的方法

我们介绍了将细胞包封于合成水凝胶中的三维（3D）技术方案。文中概述了两种常用的交联方法（迈克尔加成反应和光引发自由基反应）的包封步骤，以及多种用于评估包封后细胞行为的技术。...

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在本方案中，我们演示了该技术所基于的垂直位移微柱阵列微致动器的制备方法，并介绍了如何对该基础技术进行改进，以在二维和三维培养模式下实现高通量的力学动态细胞培养。...

用于力学动态细胞培养的微加工平台

本视频将演示一种快速高效的方法，用于对聚乙二醇进行甲基丙烯酸酯化，从而实现链式聚合反应和水凝胶的合成。视频还将展示如何将甲基丙烯酰胺官能团引入肽分子中，详细介绍评估官能团化效率的常用分析方法，提供故障排除及高级修饰的建议，并演示典型的水凝胶表征技术。...

微波辅助聚乙二醇和树脂上肽的功能化及其在链式聚合和水凝胶形成中的应用

我们介绍了由分裂内含肽介导的蛋白水凝胶的合成。该水凝胶的构建单元是两种蛋白共聚物，每种共聚物包含一个三聚体蛋白的亚基（作为交联剂）以及一半的分裂内含肽。混合这两种蛋白共聚物可触发内含肽反式剪接反应，生成可自组装形成水凝胶的多肽单元。该水凝胶具有高度的pH和温度稳定性，与有机溶剂相容，并可 facile...

一种由分裂型内含肽介导的人工蛋白质水凝胶的合成

我们描述了一种用于三维细胞培养的合成水凝胶基质的光介导形成及其后续生物化学图案化的连续过程。文中展示了利用细胞相容性光点击化学构建和修饰水凝胶的方法。此外，还介绍了对这些水凝胶中的图案进行定量与观察、以及测定细胞活力的简便技术。...

光介导的水凝胶形成与图案化及其在细胞培养中的应用

本文针对基于蛋白质的水凝胶中调控三维结构的不同方法，从材料特性角度进行了评估。将大孔网络功能化修饰以细胞黏附肽，并利用两种不同的模式细胞系评估其在细胞培养中的可行性。...

用于细胞培养应用的蛋白基水凝胶结构的简便调控

本方法中，我们采用光聚合与点击化学技术，在聚乙二醇（PEG）水凝胶表面构建蛋白质或多肽图案，以提供固定的生物活性信号，用于研究细胞响应 体外.

利用光化学方法在水凝胶上图案化生物活性蛋白质或多肽以用于生物应用

重组蛋白工程水凝胶因其可完全调控聚合物主链，从而调控细胞微环境，故在三维细胞培养中具有显著优势。本文描述了重组弹性蛋白样蛋白的纯化过程及其在三维水凝胶细胞包封中的应用。...

用于细胞三维包封与免疫染色的弹性蛋白样蛋白水凝胶的制备

本文介绍了一种将细胞包封并培养在功能化聚乙二醇（PEG）水凝胶中的实验方案，该水凝胶含有可被荧光基质金属蛋白酶（MMP）降解的肽段。通过标准的微孔板读数仪，可直接从水凝胶培养物中检测细胞的MMP活性及代谢活性。...

在三维水凝胶中测量全细胞基质金属蛋白酶及代谢活性

本文描述了利用微流控装置进行高通量明胶甲基丙烯酰基微凝胶制备的实验方案，将微凝胶转化为可再悬浮粉末（微气凝胶），通过化学组装微凝胶形成颗粒状水凝胶支架，以及开发具有保留微孔结构的颗粒状水凝胶生物墨水用于3D生物打印。...

明胶甲基丙烯酰基颗粒水凝胶支架：高通量微凝胶制备、冻干、化学组装与三维生物打印

学习将无细胞蛋白质合成反应包埋于琼脂糖水凝胶中的方法，利用大肠杆菌裂解液表达eGFP和mCherry荧光蛋白。该技术为开发生物可降解诊断设备提供了新途径，可实现实验室外的分子检测功能。

将无细胞蛋白质合成反应嵌入宏观水凝胶的方法

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