Name: 分离具有相当容量的大鼠骨髓中性粒细胞的独特方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 学习从大鼠骨髓中分离高产量中性粒细胞并提取胞外诱捕网（NETs）的优化方法。该技术采用密度梯度离心和商业化分离试剂盒，可获得高纯度功能性NETs，为免疫学和炎症研究提供可靠的实验模型。

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基金支持：本工作受到国家自然科学基金（编号：82004154、81900311、82100336 和 81970345）的资助。

本研究在四川大学华西医院动物伦理委员会批准的项目许可（编号：20211404A）下进行，符合四川大学华西医院动物伦理委员会关于动物护理与使用的指导原则。根据伦理指南，本研究所用大鼠饲养于环境受控的条件下，光照周期为12小时明/12小时暗，温度维持在22–24 °C，相对湿度为50%–60%。大鼠可自由摄食和饮水。本研究所用动物为6–8周龄的雄性Sprague Dawley（SD）大鼠，体重约250 g，无特定病原体（SPF级）。动物来源于商业供应商（见材料表）。
1. 大鼠中性粒细胞的分离
<ol>
	<li>骨髓采集
	<ol>
		<li>将大鼠放入合适的麻醉容器中（参见材料表）。向大鼠给予3%异氟烷，直至动物失去意识。通过脚趾或尾部夹捏测试确认无反应，以确保麻醉深度。</li>
		<li>当大鼠深度麻醉后，将其仰卧放置，一手握住其尾部，另一手抓住头部，进行颈椎脱位。通过突然且有力地向上拉动尾部，同时向下拉头部，迅速而牢固地使颈部脱位，直至颈椎断裂。在进行组织采集或处理前，需等待确认死亡的体征，如呼吸停止和心跳消失。</li>
		<li>将大鼠浸入75%乙醇中，静置数分钟以消毒毛发和皮肤。将大鼠仰卧放置，在髋关节处切断下肢，以保护股骨头。使用解剖剪剪断踝关节处的韧带，并将膝关节向后折叠，以暴露股骨和胫骨。</li>
		<li>使用镊子和剪刀，小心去除附着在骨骼上的肌肉、肌腱及其他组织。用Hank's平衡盐溶液（HBSS）冲洗骨骼，以去除残留的组织碎片和血液。重复冲洗两次，共洗涤三次。将清洁后的骨骼放入无菌容器中。</li>
		<li>使用5或10 mL注射器配针头，从骨骼两端穿刺，以松动骨髓基质。用另一支注射器以10–15 mL Roswell Park Memorial Institute（RPMI）培养基冲洗骨髓，直至无法再冲出可见的骨髓组织。</li>
		<li>将骨髓细胞在20 °C下以300 x g离心10分钟。加入5–10 mL红细胞裂解缓冲液（参见材料表）重悬细胞，并在室温下孵育3分钟。向混合液中加入4倍体积的HBSS。在室温下以600 x g离心5分钟，用移液器弃去上清液，所得细胞沉淀用于后续实验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从骨髓中分离中性粒细胞
	<ol>
		<li>对于两步法，执行以下附加步骤：
		<ol>
			<li>按照生产商说明书，使用商业化的大鼠中性粒细胞分离试剂盒分离骨髓细胞（参见材料表）。</li>
			<li>在新的15 mL离心管中，依次叠加2 mL 55% Percoll试剂（参见材料表）、2 mL 65%试剂、2 mL 70%试剂和2 mL 80%试剂，形成密度梯度。将离心管在20 °C下以800 x g离心40分钟，加速度设为5，减速度设为0或1。</li>
			<li>使用无菌移液器收集70%梯度层，包括65%与70%梯度试剂交界处的细胞层。将细胞悬液转移至新的15 mL离心管中。向管中加入15 mL HBSS，并轻轻倒置数次以洗涤细胞。在室温下以300 x g离心10分钟，使细胞成团。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>对于一步法，执行以下附加步骤：
		<ol>
			<li>对骨髓细胞进行梯度离心，但不使用大鼠中性粒细胞分离试剂盒。</li>
			<li>使用无菌移液器收集70%梯度层，包括65%与70%梯度交界处的细胞层。将细胞悬液转移至新的50 mL离心管中，并用HBSS洗涤细胞。在室温下以400 x g离心5分钟，使细胞成团。</li>
			<li>使用血细胞计数板计数分离得到的中性粒细胞，并通过台盼蓝染色评估细胞活力。 
			&#8203;注意：该方案可根据大鼠数量和所需分离的中性粒细胞数量进行调整。当该方法首次在新的实验条件下使用时，通常从三只大鼠获取的骨骼数量即可满足要求。所有操作均应在无菌条件下进行。为尽量减少细胞损伤和活力丧失，应尽快完成骨髓中性粒细胞的分离。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
大鼠 NET 的获取
<ol>
	<li>在无菌的10 cm培养皿中，将0.5 × 108–1 × 108个分离的中性粒细胞重悬于4 mL RPMI培养基（添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素）中。</li>
	<li>向中性粒细胞悬液中加入500 nM PMA（见材料表）以诱导NETosis。在37 °C、5% CO2条件下孵育3小时。</li>
	<li>对于阴性对照，向中性粒细胞悬液中加入DNase I（10 U/mL），以降解分泌的NETs。</li>
	<li>收集NETs时，移除培养基，并用HBSS轻轻洗涤附着在培养皿上的NETs。然后，每块培养皿用4 mL新鲜培养基剧烈冲洗，使NETs从培养皿表面脱离。</li>
	<li>收集洗涤液，并反复吹打以充分重悬NETs。</li>
	<li>将悬液在20 °C下以300 × g离心10分钟，去除漂浮的细胞。</li>
	<li>将含有NETs的悬液转移至无菌管中，于−20 °C保存，并在2周内使用。 
	&#8203;注意：NETs易发生降解，建议使用新鲜制备的样品以获得最佳结果。</li>
</ol>
3. NETs 存在的验证
<ol>
	<li>用 4% 多聚甲醛将步骤 2.4 中的细胞和步骤 2.7 中的 NETs 分别固定 15 分钟和 30 分钟至 1 小时。</li>
	<li>将盖玻片倒置在覆盖于试管架上的石蜡膜中的 PBS/PBST 液滴上，重复洗涤三次，每次 5 分钟。</li>
	<li>用 0.5% Triton-X-100 在室温下对细胞进行透化处理 10 分钟，然后在 PBS/PBST 中洗涤三次，每次 1 分钟。用 10% 正常驴血清（见材料表）在室温下封闭细胞 1 小时&#160;。</li>
	<li>在 4 °C 下用抗大鼠中性粒细胞弹性蛋白酶抗体和抗大鼠髓过氧化物酶抗体（见材料表）孵育细胞过夜。随后，在 PBS/PBST 中洗涤盖玻片三次，每次 5 分钟。</li>
	<li>在室温避光条件下，用二抗 A488 标记的驴抗兔 IgG (H + L)、A594 标记的驴抗小鼠 IgG (H + L) 以及 A594 标记的山羊抗小鼠 IgG1（见材料表）孵育细胞 1 小时。随后，在 PBS/PBST 中洗涤盖玻片三次，每次 5 分钟。</li>
	<li>用 10 mg/mL DAPI 对细胞核和 NET 骨架进行染色。随后，在 PBS/PBST 中洗涤盖玻片三次，每次 5 分钟。</li>
	<li>在载玻片上滴加一滴封片剂，将带有细胞的盖玻片倒置其上。干燥 1 小时后即可使用浸油物镜进行显微分析；否则可直接用于观察。 
	&#8203;注意：即使在固定后，操作 NETs 时也必须格外小心，因为它们极为脆弱，容易在制备过程中丢失。</li>
</ol>
4. NETs 的定量分析
<ol>
	<li>根据制造商说明配制 Tris-EDTA（TE）缓冲液和 PicoGreen（dsDNA 检测试剂）工作液（参见材料表）。</li>
	<li>通过将储备 DNA 稀释至 1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL 和 1 µg/mL 的浓度来制备标准品。 
	注意：为定量 NETs 浓度，采用双链 DNA（dsDNA）检测试剂盒（参见材料表），并遵循制造商指南。Tris-EDTA（TE）缓冲液和 dsDNA 检测试剂分别使用 19 倍体积的双蒸水或 199 倍体积的 TE 缓冲液配制。随后制备标准溶液（1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL 和 1 µg/mL），并将每份 50 µL 样品与 450 µL TE 缓冲液混合。</li>
	<li>将每份样品 50 µL 加入 450 µL TE 缓冲液中。</li>
	<li>向 96 孔板的每个孔中加入 100 µL 标准品或样品，并加入等体积的检测试剂工作液，包括标准品孔和样品孔。</li>
	<li>将板在室温下避光孵育 2–5 分钟。</li>
	<li>使用荧光酶标仪读取样品，激发波长约 480 nm，发射波长约 530 nm。</li>
	<li>利用标准品生成的标准曲线计算每个样品中 NETs 的浓度。</li>
</ol>
5. 通过细胞流式术分析 NETs 的分泌
<ol>
	<li>向96孔板中孵育的细胞加入细胞核染料（参见材料表），使其终浓度为10 ng/mL，孵育30分钟。</li>
	<li>向细胞中加入游离DNA（cfDNA，参见材料表）染料，使其终浓度为300 nM，孵育10分钟。</li>
	<li>通过轻柔吹打混匀荧光染料。不要弃去上清液或洗涤沉淀。</li>
	<li>将样品板放入流式细胞仪中。</li>
	<li>设置不同通道的聚焦和曝光时间参数：蓝色通道（激发：377/50 nm，发射：470/22 nm），通常曝光时间为30,000 ms；绿色通道（激发：483/32 nm，发射：536/40 nm），通常曝光时间为5,000 ms。</li>
	<li>在不同通道下采集整块板高度均一的图像。</li>
	<li>分析不同组别的细胞核染料计数。若计数相近，则可通过cfDNA染料计数确定NETs的释放情况。</li>
</ol>

Efficient Rat Bone Marrow Neutrophil Extracellular Trap Isolation

<ol><li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).</li>
<li>Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+killing+of+human+neutrophils+by+the+potent+activator+phorbol+12-myristate+13-acetate+%28PMA%29+accompanied+by+changes+different+from+typical+apoptosis+or+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Rapid killing of human neutrophils by the potent activator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) accompanied by changes different from typical apoptosis or necrosis.</a> Journal of Leukocyte Biology. 59 (2), 229-240 (1996).</li>
<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li>
<li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+induce+intestinal+damage+and+thrombotic+tendency+in+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Crohn%27s+and+Colitis%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps induce intestinal damage and thrombotic tendency in inflammatory bowel disease.</a> Journal of Crohn's and Colitis. 14 (2), 240-253 (2020).</li>
<li>Laridan, E., Martinod, K., De Meyer, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+in+arterial+and+venous+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Thrombosis+and+Hemostasis%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps in arterial and venous thrombosis.</a> Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).</li>
<li>Dinallo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+Extracellular+traps+sustain+inflammatory+signals+in+ulcerative+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Crohn%27s+and+Colitis%22%5BJournal%5D)">Neutrophil Extracellular traps sustain inflammatory signals in ulcerative colitis.</a> Journal of Crohn's and Colitis. 13 (6), 772-784 (2019).</li>
<li>Dicker, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+are+associated+with+disease+severity+and+microbiota+diversity+in+patients+with+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps are associated with disease severity and microbiota diversity in patients with chronic obstructive pulmonary disease.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (1), 117-127 (2018).</li>
<li>Franck, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+PAD4+and+netosis+in+experimental+atherosclerosis+and+arterial+injury%3A+Implications+for+superficial+erosion%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Roles of PAD4 and netosis in experimental atherosclerosis and arterial injury: Implications for superficial erosion.</a> Atherosclerosis. 275, e11(2018).</li>
<li>Jorch, S. K., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+emerging+role+for+neutrophil+extracellular+traps+in+noninfectious+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease.</a> Nature Medicine. 23 (3), 279-287 (2017).</li>
<li>Marin-Esteban, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Afa%2FDr+diffusely+adhering+Escherichia+coli+strain+C1845+induces+neutrophil+extracellular+traps+that+kill+bacteria+and+damage+human+enterocyte-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Afa/Dr diffusely adhering Escherichia coli strain C1845 induces neutrophil extracellular traps that kill bacteria and damage human enterocyte-like cells.</a> Infection and Immunity. 80 (5), 1891-1899 (2012).</li>
<li>Kang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+released+by+neutrophils+impair+revascularization+and+vascular+remodeling+after+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps released by neutrophils impair revascularization and vascular remodeling after stroke.</a> Nature Communications. 11 (1), 2488(2020).</li>
<li>Schüttler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Animal models of atrial fibrillation.</a> Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).</li>
<li>Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+human+neutrophil+extracellular+traps+%28NETs%29+isolation+and+handling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Simplified human neutrophil extracellular traps (NETs) isolation and handling.</a> Journal of Visualized Experiments. 98, e52687(2015).</li>
<li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+is+the+preferred+source+for+isolation+of+rat+neutrophils+and+the+subsequent+acquisition+of+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bone marrow is the preferred source for isolation of rat neutrophils and the subsequent acquisition of neutrophil extracellular traps.</a> Annals of Translational Medicine. 10 (15), 823-823 (2022).</li>
<li>Freeman, G. E., Dalton, C. A., Brooks, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Nycodenz+gradient+method+for+the+purification+of+neutrophils+from+the+peripheral+blood+of+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A Nycodenz gradient method for the purification of neutrophils from the peripheral blood of rats.</a> Journal of Immunological Methods. 139 (2), 241-249 (1991).</li>
<li>Zindl, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-22-producing+neutrophils+contribute+to+antimicrobial+defense+and+restitution+of+colonic+epithelial+integrity+during+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">IL-22-producing neutrophils contribute to antimicrobial defense and restitution of colonic epithelial integrity during colitis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12768-12773 (2013).</li>
<li>Wong, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+reveals+the+defining+features+of+the+classical%2C+intermediate%2C+and+nonclassical+human+monocyte+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets.</a> Blood. 118 (5), e16-e31 (2011).</li>
<li>Nauseef, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+neutrophils+from+venous+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of human neutrophils from venous blood.</a> Methods in Molecular Biology. 412, 15-20 (2007).</li>
<li>Lindena, J., Burkhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+chemiluminescence+properties+of+human%2C+canine+and+rat+polymorphonuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Separation and chemiluminescence properties of human, canine and rat polymorphonuclear cells.</a> Journal of Immunological Methods. 115 (1), 141-147 (1988).</li>
<li>Lauwers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+Transwell+assay+for+the+analysis+of+neutrophil+chemotaxis+using+flow+cytometry+to+refine+the+clinical+investigation+of+immunodeficient+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Optimization of the Transwell assay for the analysis of neutrophil chemotaxis using flow cytometry to refine the clinical investigation of immunodeficient patients.</a> Clinical Immunology. 238, 108994(2022).</li>
<li>Evrard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+analysis+of+bone+marrow+neutrophils+reveals+populations+specialized+in+expansion%2C+trafficking%2C+and+effector+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Developmental analysis of bone marrow neutrophils reveals populations specialized in expansion, trafficking, and effector functions.</a> Immunity. 48 (2), 364-379 (2018).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

中性粒细胞的分离是研究NETosis的关键步骤，其中选择合适的分离方法对于获得可靠结果至关重要。需要权衡的一个重要因素是在分离过程中发生的淋巴细胞污染。在从大鼠骨髓中分离中性粒细胞时，解决这一问题尤为关键。尽管中性粒细胞的密度范围（1.0814–1.0919，峰值为1.0919）与淋巴细胞（1.0337–1.0765，峰值为1.0526）明显不同，但淋巴细胞污染仍然难以避免。这在一定程度上可归因于骨髓中淋巴细胞的丰富含量以及未成熟淋巴细胞密度的增加15。密度梯度分离技术（如使用Percoll和Ficoll）有助于减少淋巴细胞污染，但完全消除淋巴细胞可能仍具挑战性。通过配制特定密度梯度的专用Percoll溶液，可利用大鼠中性粒细胞与其他骨髓细胞之间的密度差异，最大限度地降低污染。因此，研究人员应审慎评估淋巴细胞污染对实验结果的潜在影响，并采取措施减轻其影响。
本研究强调了根据特定实验需求定制分离方法的重要性。在先前所述的方法中14，一步法在时间和操作强度上要求较低，因此被推荐用于中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的获取，因为淋巴细胞污染对NET分泌的影响可忽略不计，且这些淋巴细胞可在最终离心阶段被有效去除。相反，对于涉及中性粒细胞分离并后续评估NETosis及NET分泌的研究，则推荐采用两步法14。该方法可精确量化中性粒细胞产生的NETs，同时最大限度地减少其他细胞污染所带来的潜在干扰因素的影响。
可对分离方案进行优化以提高得率和纯度。例如，使用优化的密度梯度试剂组合可获得更多的中性粒细胞。轻柔的移液和洗涤操作同样有助于减少细胞损失并提高纯度。通过监控缓冲液的 pH 值和温度，并调整离心参数等故障排除措施，可有效应对分离过程中遇到的问题。骨髓分离的一个相关局限性在于可能混入未成熟的中性粒细胞及其他骨髓细胞，从而影响纯度和得率。设计一种高效去除淋巴细胞的方法可提升整体分离效率。另一局限性在于骨髓分离需要牺牲动物，这可能不适用于对大鼠中性粒细胞进行长期的 in vivo 研究。
人类中性粒细胞的分离主要依赖外周血。传统方法包括Ficoll-Paque法、Percoll法和免疫磁珠分离法16,17,18。Ficoll法基于细胞浮力进行白细胞亚群的分离，依赖密度梯度介质区分中性粒细胞。该方法操作简便且成本较低，但纯度和得率较低，且在去除红细胞方面存在困难。相比之下，Percoll法利用密度梯度分离，可获得更高的中性粒细胞纯度和得率，但需要专用设备，成本更高且耗时更长19。免疫磁珠分离法是一种较新的特异性技术，采用抗体偶联的磁珠特异性结合中性粒细胞，其他白细胞污染极少。尽管该方法易于自动化，但仍需专用设备，且因磁珠成本较高而增加整体费用。在选择中性粒细胞分离方法时，研究人员需权衡得率、纯度、成本和操作复杂性。目前，分离人中性粒细胞最便捷的方法是使用PolymorphPrep20。该方法可在短时间内获得大量高纯度的中性粒细胞。PolymorphPrep的原理基于细胞密度差异进行分离。
在小鼠中，由于血液体积较小，且难以获得足够数量和纯度的中性粒细胞用于后续实验，因此不建议从外周血中分离中性粒细胞。尽管大鼠可提供足够的血液量（每只大鼠约10 mL），但其外周血特征与人类和小鼠存在差异。大鼠本身在中性粒细胞提取方面存在固有缺陷，单核细胞是其最丰富的有核细胞13,14。因此，从单只大鼠外周血中仅能获得 2 × 105–5 × 105 个中性粒细胞。相比之下，骨髓是更可行的中性粒细胞来源，无论动物是否感染，均可提供充足且易于获取的细胞。另一种方法是诱导腹腔或胸腔产生炎症环境以促进中性粒细胞浸润后再进行分离，但该方法不可靠且操作复杂。因此，骨髓提取成为大鼠中性粒细胞分离的一种实用且可靠的途径21。
NETosis 涉及多种细胞过程，包括 DNA 去浓缩、自噬以及细胞内基质的排出1。在人类中，NET 的释放过程较为彻底，仅留下细胞膜残余。有趣的是，大鼠中性粒细胞的研究显示出不同的模式，在刺激后保留了更多的细胞内成分。尽管受到 PMA 刺激，大鼠中性粒细胞仍表现出不完全的 NET 释放，这与其自发性 NETosis 现象一致。令人好奇的是，大鼠的 NET 更倾向于形成聚集体（aggNETs），而非广泛的网状结构，这可能与其交联能力降低有关。这一现象可能显著影响中性粒细胞的聚集，进而影响大鼠整体的免疫反应。未来，骨髓分离技术的应用可进一步探究 NETosis 中不同的信号通路及免疫细胞的作用。此外，该方法有助于在多种疾病模型中开展 NETosis 研究，揭示中性粒细胞在不同病理状态下的功能角色。最终，开发新型的 NET 分离与表征技术，有望阐明驱动 NETosis 的分子机制及其在不同动物模型中的功能意义。

中性粒细胞是白细胞中一个关键的亚群，在先天免疫反应中发挥着至关重要的作用。其特征为具有多叶核以及含有多种蛋白酶和抗菌肽的颗粒1。中性粒细胞主要通过脱颗粒、吞噬作用以及中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的形成来发挥功能。1996年，Takei 等人在用佛波酯（phorbol myristate acetate, PMA）刺激中性粒细胞的实验中首次观察到 NETs 的存在2。随后，Brinkmann 等人于2004年将这一形成过程命名为&#34;NETosis&#34;3，并进一步阐明了NETs在中性粒细胞介导的抗菌反应中的关键作用。NETs是由染色质、组蛋白和抗菌蛋白组成的网状结构，在感染性和炎症性刺激下由活化的中性粒细胞释放。NETs可通过捕获病原体并将其暴露于高浓度的抗菌肽和蛋白酶环境中，从而实现对入侵病原体的固定和杀灭1,3。此外，NETs还参与凋亡细胞的清除，并在炎症消退过程中发挥作用。近期研究表明，NETs的过度形成或降解障碍可导致组织损伤、自身免疫性疾病、血栓形成以及血管再通障碍4,5,6,7,8,9,10。
中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）在心肌梗死后失控性纤维化及心室动脉瘤形成中的致病作用已通过血管周围纤维化的扩展得到证实4,11。心肌梗死模型以及从小鼠骨髓中分离中性粒细胞的方法均已建立。多形核（PMN）白细胞是人体血液中含量丰富的白细胞类型，是分离人中性粒细胞的理想来源。该方法无需采集骨髓，从而提高了安全性和效率。
中性粒细胞胞外陷阱（NETs）在与心脏重构相关的心房颤动中也发挥着作用。然而，由于小鼠的心房尺寸过小，无法建立折返环路或心房颤动（AF）模型，因此通常需使用狗和猪等大型动物来模拟心房颤动，除非对特定的离子通道或信号通路进行基因敲低或敲除12。尽管可以诱导大鼠产生心房颤动，并如前所述从大鼠外周血中分离中性粒细胞，但研究人员面临一个限制：每只大鼠（10 mL 血液）仅能分离出约 2 × 105–5 × 105 个中性粒细胞。为在每个时间点提取足够量的 NETs，需要约 10–25 只大鼠（总计 5 × 106 个中性粒细胞），导致该过程耗时、昂贵且产量通常较低13。针对这一问题，Li He 及其同事提出了一种以骨髓为导向的策略，用于从大鼠中获取足量的 NETs14。在他们的文章中，详细描述了从大鼠骨髓中分离中性粒细胞的方法，并比较了大鼠外周血与骨髓来源中性粒细胞释放 NET 的能力。所介绍的两种方法适用于不同的实验目标，均可获得足量的大鼠骨髓中性粒细胞，同时减少所需大鼠数量。其中，两步分离法在中性粒细胞纯度方面表现更优，而一步法则更为省时，且纯度可满足实验要求。此外，研究人员还比较了大鼠骨髓中性粒细胞与其外周血对应细胞在 NETosis 及 NET 形成方面的能力，发现两者在多形核中性粒细胞（PMN）活性上具有相当的效能。这些发现对与中性粒细胞相关的心房颤动研究具有重要意义，并强调了在不同实验动物中根据中性粒细胞分布特点灵活选择中性粒细胞来源的重要性。

<table><tbody><tr><td>A488标记的驴抗兔IgG(H + L)</td><td>Invitrogen, USA</td><td>A32790</td><td></td></tr><tr><td>A594标记的驴抗小鼠IgG(H + L)</td><td>Invitrogen, USA</td><td>A32744</td><td></td></tr><tr><td>A594标记的山羊抗小鼠IgG1&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen, USA</td><td>A21125</td><td></td></tr><tr><td>抗大鼠髓过氧化物酶抗体</td><td>Abcam, England</td><td>ab134132</td><td></td></tr><tr><td>抗大鼠中性粒细胞弹性蛋白酶抗体</td><td>Abcam, England</td><td>ab21595</td><td></td></tr><tr><td>Celigo成像细胞仪</td><td>Nexelom, USA</td><td>200-BFFL-5C</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma, USA</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Gibco, USA</td><td>10099141C</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s平衡盐溶液（HBSS）</td><td>Gibco, USA</td><td>C14175500BT</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Thermofisher, USA</td><td>33342</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>RWD, China</td><td>R510-22-10</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>Sigma, USA</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>正常驴血清</td><td>Solarbio, China</td><td>SL050</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>biosharp, China</td><td>BL539A</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Hyclone, USA</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE, USA</td><td>P8370-1L</td><td></td></tr><tr><td>佛波醇12-十四烷酰-13-乙酸酯（PMA）</td><td>Sigma, USA</td><td>&amp;nbsp;P1585</td><td></td></tr><tr><td>Picogreen双链DNA检测试剂盒</td><td>Invitrogen, USA</td><td>P11496</td><td></td></tr><tr><td>大鼠中性粒细胞分离试剂盒</td><td>Solarbio, China</td><td>P9200</td><td></td></tr><tr><td>红细胞裂解缓冲液</td><td>Solarbio, China</td><td>R1010</td><td></td></tr><tr><td>罗斯韦尔帕克纪念研究所（RPMI）培养基</td><td>Hyclone, USA</td><td>SH30809.01B</td><td></td></tr><tr><td>RWD通用动物麻醉机</td><td>RWD, China</td><td>R500</td><td></td></tr><tr><td>Sprague Dawley（SD）大鼠</td><td>Dashuo, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sytox Green</td><td>Thermofisher, USA</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA（TE）缓冲液</td><td>Solarbio, China</td><td>T1120</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Biofroxx, German</td><td>1139ML100</td><td></td></tr></tbody></table>

分离大鼠骨髓中性粒细胞的独到方法及其功能可比性

Unique Approach for Isolating Rat Bone Marrow Neutrophils with Comparable Capacity

本研究的主要目的是建立一种可靠且高效的方法，从大鼠骨髓中分离中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）。这一研究动机源于传统从外周血提取NETs方法的局限性，主要原因是可用于分离的中性粒细胞数量稀少。研究揭示了两种从大鼠骨髓获取中性粒细胞的不同方法：一种是简化的单步法，可达到满意的纯化水平；另一种是耗时较长的两步法，纯化效率更高。重要的是，这两种技术均可获得大量活细胞中性粒细胞，每只大鼠可获得5000万至1亿个。该效率与从人和小鼠来源分离中性粒细胞所获得的结果相当。值得注意的是，源自大鼠骨髓的中性粒细胞在分泌NETs的能力方面，与来自外周血的中性粒细胞相当。然而，基于骨髓的方法始终能产生显著更多的中性粒细胞和NETs。该方法显示出获取更大量这些细胞成分以用于后续下游应用的潜力。特别地，这些分离得到的NETs和中性粒细胞在炎症、感染及自身免疫性疾病等领域具有广阔的应用前景。

本文所述方案概述了两种不同的方法，每种方法分别具有更高的纯化效率或更简化的步骤。两种方法每只大鼠均可获得约 0.5 × 108–1 × 108 个中性粒细胞。采用 Annexin V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒进行的流式细胞术分析显示，细胞活力高于 90%，与小鼠和人类样本相当（图 1）。尽管从骨髓中分离中性粒细胞时淋巴细胞污染似乎难以避免，但两步法的纯度达到 90%，优于一步法所获得的 50% 纯度（图 2）。
外周血与骨髓中性粒细胞在PMA刺激下NET分泌反应相当图3）。此外，大鼠NETs彼此之间的交联能力有限（图4）。为了深入探究大鼠 NETosis 的过程，采用 PMA 作为诱导剂。NETs 被检测到 通过 cfDNA 染色，并使用细胞成像分析仪采集全面图像。值得注意的是，与小鼠和人类中性粒细胞相比，大鼠中性粒细胞即使在无外界刺激的情况下，也表现出更高的自发NETosis倾向。经PMA孵育后，4 h时cfDNA含量增加了10%（图5）。当暴露于500 nM PMA时，每只大鼠的骨髓最终产生8-12 µg/mL NET-DNA。值得注意的是，大鼠中性粒细胞在NETosis过程中胞内物质未完全排出，因而可观察到大量胞内组分。此外，由于黏附性增强，大鼠NETs倾向于形成纱布样薄膜，呈现出独特的云雾状外观。
<img alt="流式细胞术散点图，Annexin V-FITC 对 PI，凋亡分析，象限分布。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65506/65506fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：从小鼠骨髓分离物中评估中性粒细胞活力。 分离大鼠中性粒细胞的最佳来源是骨髓，这有助于后续获取中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）。本图改编自 He 等人14。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65506/65506fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="组织学细胞染色，显微镜图像 A-C，放大倍数 20 μm，细胞密度比较" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65506/65506fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：从外周血和骨髓中纯化中性粒细胞 通过 Wright-Giemsa 染色 (A) 外周血来源。B骨髓来源 通过 一步法。C骨髓来源 通过 两步法。骨髓提取是大鼠中性粒细胞分离及其后续获取中性粒细胞胞外诱捕网的首选方法。比例尺 = 20 µm放大倍数 = 400x。该图改编自 He 等人。14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65506/65506fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="外周血与骨髓中性粒细胞dsDNA水平的柱状图；中性粒细胞活化效应。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65506/65506fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图3：中性粒细胞在PMA或PMA + DNase I孵育后释放中性粒细胞胞外诱捕网（NET）。 骨髓提取是大鼠中性粒细胞分离及后续收集中性粒细胞胞外诱捕网的首选途径。本图改编自He等14。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65506/65506fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜图像；细胞定位；细胞核（蓝色），蛋白质（绿色），合并图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65506/65506fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
图4：免疫荧光分析。 细胞核（蓝色，A）、MPO（绿色，B）的免疫荧光染色及合并图像（C）。NET：中性粒细胞胞外诱捕网；MPO：髓过氧化物酶。骨髓提取是分离大鼠中性粒细胞并进一步收集中性粒细胞胞外诱捕网的首选方法。比例尺 = 50 µm。放大倍数 = 200x。本图改编自 He 等人14。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65506/65506fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜，DNA染色，SytoxGreen，Hoechst，PMA处理比较示意图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65506/65506fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5"> 
图5cfDNA 的全面分析 通过 在不同条件下使用细胞成像分析仪。 细胞游离DNA（绿色）和细胞核（蓝色）的荧光染色。骨髓提取是分离大鼠中性粒细胞及后续收集中性粒细胞胞外诱捕网的主要方法。比例尺 = 500 µm该图改编自 He 等人的研究。14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65506/65506fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

本研究概述了两种从大鼠骨髓中分离大量中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的技术。一种方法结合使用商业化的中性粒细胞分离试剂盒与密度梯度离心法，另一种方法仅采用密度梯度离心法。这两种方法获得的功能性NETs均优于外周血中性粒细胞来源的NETs。

本研究的主要目的是建立一种可靠且高效的方法，用于从大鼠骨髓中分离中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）。

我们建立了一种从大鼠中分离中性粒细胞并随后提取中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的方法。该方法为在大鼠及大鼠源性细胞系中开展与NETs相关的实验提供了优化的可及性。在本研究中，我们比较了从大鼠外周血和骨髓中分离得到的中性粒细胞。我们的研究结果突显了骨髓来源中性粒细胞的优越性，不仅在分离得到的中性粒细胞数量上具有显著优势，而且表现出良好的同步化能力。我们基于骨髓分离大鼠中性粒细胞及中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的方法通过优化此类细胞的分离技术，填补了该领域的研究空白。与以往主要采用外周血的方法不同，本方案靶向骨髓，可获得更高数量和更大产量的中性粒细胞，为研究中性粒细胞及NETs的生物学特性提供了更为准确的大鼠模型。开始骨髓采集时，将已处死的大鼠浸泡于75%乙醇中，以消毒毛发和皮肤。将大鼠仰卧放置，并在髋部切断下肢，以保护股骨头。使用解剖剪剪断鹰嘴关节处的韧带。然后将膝关节向后折叠，以暴露股骨和胫骨。使用镊子和剪刀。仔细去除附着在骨骼上的肌肉、肌腱及其他组织。使用直径五毫米的针头注射器从骨两端穿刺，将骨髓推出，以松解骨髓基质。然后使用新的注射器，以10至15毫升RPMI培养基冲洗出骨髓。将骨髓细胞在20摄氏度下以300 G离心10分钟。弃去上清液，并将细胞重悬于5至10毫升红细胞裂解缓冲液中。孵育悬液后，向混合物中加入四倍体积的HBSS。然后在室温下以600 G离心细胞5分钟，使用所得沉淀物进行后续操作。首先使用大鼠骨髓中性粒细胞分离试剂盒分离中性粒细胞。在15毫升离心管中加入2毫升80%至55%的Per Coll试剂，形成密度梯度。然后将分离得到的中性粒细胞或使用大鼠骨髓中性粒细胞分离试剂盒分离细胞后重悬于溶液中的细胞转移至离心管中。用无菌移液管混匀后，在20摄氏度下以800 G离心40分钟。收集70%密度梯度层，包括位于65%至70%界面处的细胞层。将细胞悬液转移至一个新的15毫升离心管中。向管中加入15毫升HBSS，并轻轻颠倒混匀。最后，在室温下以300 ×g离心10分钟，使细胞沉淀，完成一步法操作。将骨髓悬液直接用移液器加入密度梯度离心管中，按先前所示方法进行离心。接着，用移液器吸出70%梯度层，包括75%至70%梯度交界处的各层。将此细胞悬液转移至一个新的50毫升离心管中，并加入10毫升HBSS。然后在室温下以400 G离心5分钟，使细胞沉淀。使用血细胞计数板对分离的中性粒细胞进行计数，并通过台盼蓝染色评估细胞活力。两步法的纯度达到90%，相较于一步法的50%有显著提高。首先，在无菌的10厘米培养皿中，用4毫升添加了补剂的DAR PMI培养基重悬分离得到的大鼠中性粒细胞。接着，向中性粒细胞悬液中加入4微升PMA，以诱导NETs的形成。将混合物在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育3小时。作为阴性对照。向中性粒细胞悬液中加入四到五微升 DNase 1，以降解分泌的中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）。然后加入四毫升 HBSS 洗涤 NETs。每孔加入四毫升新鲜培养基冲洗，以解离 NETs。现在将洗脱液收集至新离心管中，并频繁使用移液器吹打，确保 NETs 完全重悬。在 20 摄氏度下以 300 G 离心 10 分钟，去除任何漂浮的细胞。然后将含有 NETs 的上清液转移至新离心管中，离心收集 NETs 悬液及漂浮细胞。将细胞悬液接种于 24 孔板中，孔内预先放置直径为 1.4 厘米的玻璃盖玻片，以使漂浮细胞沉降。随后用 4% PFA 固定盖玻片上的细胞，并进一步验证 NETs 的存在。接下来，将一滴 HBSS 滴加到覆盖有石蜡膜的试管架上。将盖玻片倒置浸入 HBSS 液滴中以进行洗涤。洗涤后，在室温下用 250 µL 的 0.5 × Triton X-100 孵育细胞 10 分钟，以使其通透化。然后用HBSS洗涤细胞三次，每次一分钟。将细胞在室温下用10%正常驴血清封闭一小时。最后，在4°C条件下，加入70至90微升抗大鼠抗体，孵育过夜。将盖玻片在 HBS 中洗涤 3 次，每次 5 分钟。随后将盖玻片在室温避光条件下用二抗孵育 1 小时，然后用 HBSS 洗涤。用 70 至 90 微升的 DAPI 染色细胞核和 NET 骨架。用HBSS洗涤三次，每次五分钟。首先，将50微升分离的大鼠NET样品用移液器转移至含有450微升Tris EDTA缓冲液的离心管中。然后，将100微升DNA标准品和样品分别加入96孔板中。向各孔中加入等体积的检测试剂。然后将酶标板在室温下孵育两到五分钟，避免暴露于直射光下。将酶标板放入荧光酶标仪中，设置发射波长约为530纳米，激发波长约为480纳米。将细胞在1 µL细胞核染料中孵育30分钟。接着，将细胞在1 µL无细胞DNA染料中孵育10分钟。轻轻混匀荧光染料。将样品板加载到流式细胞仪中，切换至Cytox Green通道，然后选择hexed通道。将照明设置为蓝色377/447，调整曝光时间为300,000微秒。单击聚焦设置，然后点击自动注册。为自动调整焦点，请选择 OX 屏幕通道并将照明设置为绿色 483/536。将 cytox 屏幕的曝光时间设置为 30,000 微秒。单击“开始扫描”以启动扫描过程。在外周血和骨髓中性粒细胞之间可观察到相似的NET分泌反应。无论是否经PMA刺激，大鼠中性粒细胞彼此之间的交联能力均有限。与PMA孵育4小时后，无细胞DNA含量增加了10%，表明其更易诱导NET的形成。

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分离具有相当容量的大鼠骨髓中性粒细胞的独特方法

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小鼠骨髓中性粒细胞的分离、纯化及标记用于功能研究与过继性转移实验

本文介绍一种从小鼠异质性骨髓中大量生成单核细胞的实验方案，适用于转化医学研究。与其他方法相比，该新方法通过避免使用高梯度磁性细胞分选（MACS）等昂贵技术，减少了实验动物的使用数量并降低了成本。...

小鼠骨髓来源单核细胞的分离与静脉注射

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小鼠骨髓来源中性粒细胞的ATAC-Seq文库制备

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分离大鼠骨髓中性粒细胞的独到方法及其功能可比性

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