不动杆菌生物膜的定量、活性评估及可视化策略

生物膜由活的微生物细胞组成，难以从表面清除。环境中常见的不动杆菌菌株可引起常见感染，也已知能在表面形成生物膜。因此，我们致力于开发定量和可视化不动杆菌生物膜的方法。

本方案提供了一种简单便捷的方法，用于定量和可视化不动杆菌的生物膜。通过活菌计数法对生物膜内的活细胞数量进行定量。我们的研究结果表明，天然存在的不动杆菌菌株在生物膜形成能力方面具有显著差异。

此外，不同生物膜之间存在显著的形态学差异。这为研究不动杆菌菌株间如此巨大变异的原因开辟了研究方向。开始制备细菌接种物时，使用无菌移液器吸头从菌种管中吸取2至10微升细菌菌液，并将其接种于市售的血琼脂平板上。

使用无菌接种环在琼脂表面划线，并通过间歇性灼烧使菌液逐渐稀释。将制备好的琼脂平板倒置于30°C条件下培养约20至24小时。随后，用无菌接种针挑取细菌培养物中的单个菌落，接种于5 mL无菌BHI肉汤培养基中。

将接种后的培养液置于30摄氏度、转速为每分钟150转的摇床中孵育约20至24小时。然后取1毫升培养物转移至无菌微量离心管中，在室温下以6,000 ×g离心10分钟。离心后，弃去上清液。

向沉淀中加入1毫升无菌磷酸盐缓冲液（PBS），并使用涡旋振荡器重悬。在室温下以6,000 ×g离心10分钟，弃去上清液。此次，使用涡旋振荡器将所得沉淀重悬于无菌十倍稀释的BHI肉汤中。

确保在600纳米处的光密度值约为0.1。首先，向无菌聚苯乙烯96孔板的每个孔中加入200 µL细菌接种物。然后，向最外层的孔中加入200 µL去离子水，以防止内侧孔中的液体干涸。

将96孔板在25摄氏度下孵育24小时。孵育结束后，使用移液器弃去每孔中的上清液。向每孔中小心加入300 µL PBS，然后再次用移液器吸出PBS。

每孔加入 200 微升 1% 结晶紫溶液，然后将培养板在室温下孵育 30 分钟。随后，每孔加入 200 微升无水乙醇，在室温下静置 15 分钟。通过反复吹打每孔中的液体，确保充分混匀。

使用微孔板读数仪在595纳米处测定各孔的吸光度，以确定生物膜的量。不同菌株形成的生物膜数量差异较大，光密度（OD）值范围从0.04到1.69。在不动杆菌属分离株中，除鲍氏不动杆菌（A. bouvetii）外，其余均能形成生物膜。

其中，A.radioresistens 形成弱生物膜，A.junii 和 A.bohemicus 形成中等强度生物膜，而 A.pittii 和 A.ursingii 则形成强生物膜。首先，将一毫升细菌接种物加入无菌聚苯乙烯12孔板的每孔中。在25°C下孵育24小时。

然后，使用移液器吸除上清液。向每个孔中小心加入 1.5 毫升无菌磷酸盐缓冲液（PBS）。再次用移液器吸除上清液。

再次向每个孔中加入一毫升无菌 PBS 后，使用适配的细胞刮刀刮下孔的底部和壁面。将收集到的细胞悬液转移至一支标记为 10⁻¹ 的无菌塑料管中，该管内含有九毫升生理盐水和 10 到 20 颗玻璃珠。以最大速度涡旋振荡该管 60 秒。

接下来，将前一支试管中的1毫升细胞悬液转移至另一支含有9毫升生理盐水、标记为10的负2次方的无菌试管中，进行10倍系列稀释。按照此系列稀释方法继续操作，直至第7支试管（10的负7次方）。从每个稀释度中取100 µL，分别涂布于不同的不动杆菌琼脂平板上。

将琼脂平板在30摄氏度下孵育24至42小时。然后人工计数每块平板上典型的红色菌落数量，仅考虑菌落数在10至250范围内的平板。

除 A.bouvetii 外，所有不动杆菌分离株的生物膜中每孔细胞数量均相当于 7 至 8 log CFU。而 A.bouvetii 的细胞数量则显著较低，为 4.4 log CFU。首先，将 200 µL 细菌接种物加入已为显微镜分析准备好的无菌 96 孔板的每个孔中。

将培养板在25摄氏度下孵育24小时，然后用移液器吸除上清液。接着，小心向每个孔中加入300微升经滤膜除菌的去离子水。再次使用移液器吸除上清液。

在另一支离心管中，配制 SYTO9 和碘化丙啶的稀释混合液，并加入经滤膜除菌的去离子水，调节至各自所需的终浓度。然后向每个孔中加入 200 µL 混合液，在避光条件下室温孵育 20 至 30 分钟。共聚焦激光扫描显微镜结果显示，生物膜的形成因菌株不同而存在显著差异。

在约氏不动杆菌（Acinetobacter junii）、鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）和乌辛不动杆菌（Acinetobacter ursingii）中均发现大量生物膜，且具有不同的生物膜形态。