Identification of Peptides of Small Extracellular Vesicles from Bone Marrow-Derived Macrophages
2023年6月30日
This protocol describes a procedure to isolate small extracellular vesicles from macrophages by differential ultracentrifugation and extract the peptidome for identification by mass spectrometry.
We explore the functional roles of extracellular vesicles in innate immunity. We have developed a protocol to isolate small extracellular vesicles, or sEVs, via differential ultracentrifugation and identify the peptidome by LC-MS/MS, revealing the key biological functions of the peptides in sEVs. The extracellular vesicles have been shown to mediate intercellular communication by transporting cargo to recipient cells, such as proteins, lipids, and nucleic acids.
By releasing antimicrobial components, they act the first line of defense against invading microbes in innate immunity. While differential ultracentrifugation yields highly pure small extracellular sEVs, it can be time-consuming and often results in low yields. In our study, these are major challenges for the stable identification of low-abundance peptides in the sEVs.
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概述
本研究介绍了一种利用差速超速离心法从巨噬细胞中分离小细胞外囊泡（sEVs）的实验方案。随后通过质谱技术提取并鉴定这些囊泡的肽组，揭示其在天然免疫中的作用。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 免疫学
- 细胞生物学
背景
- 细胞外囊泡在细胞间通讯中起着至关重要的作用。
- 它们可转运多种生物分子，包括蛋白质和核酸。
- 小细胞外囊泡（sEVs）通过释放抗菌成分在先天免疫中发挥重要作用。
- 由于产量低且操作耗时，sEVs 的分离具有较大挑战性。
研究目的
- 建立一种从巨噬细胞中分离小细胞外囊泡（sEVs）的可靠方案。
- 鉴定sEVs的肽组并理解其生物学功能。
- 解决sEVs中低丰度肽鉴定所面临的技术难题。
使用的方法
- 差速超速离心法用于sEV的分离。
- 液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）用于肽组鉴定。
- sEV中肽段功能作用的分析。
- 分离sEV纯度和得率的评估。
主要结果
- 成功从巨噬细胞中分离出高纯度的小细胞外囊泡（sEVs）。
- 鉴定了参与先天免疫反应的关键肽段。
- 揭示了sEVs在介导细胞间通讯中的作用。
- 强调了在低丰度肽段的稳定鉴定方面所面临的挑战。
结论
- 该优化的实验方案可提高sEVs的分离效率，便于后续研究。
- 鉴定肽组有助于揭示sEVs的生物学功能。
- 未来的研究可着重于提高肽段鉴定的得率与稳定性。
常见问题
行业重要性概述
系统鉴定骨髓来源巨噬细胞的小细胞外囊泡（sEVs）中的肽组，有助于深入理解先天免疫信号传导及细胞间通讯的分子机制。该实验流程旨在解决发现阶段的一项关键挑战：分离并表征丰度较低但具有生物活性的肽段，这些肽段可能作为功能性效应分子或生物标志物。该方法可提高靶点验证的预测可信度，并为免疫学及细胞治疗研发管线中的风险调整型决策提供依据。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够研究由sEV来源的肽介导的先天免疫通路。
- 通过阐明肽类货物在巨噬细胞信号传导中的功能，支持生物学风险降低。
- 有助于在选择免疫调节靶点进行深入研究时提供可靠的预测依据。
筛选与检测方法开发
- 提供了一种经过验证的工作流程，用于分离高纯度的小细胞外囊泡（sEVs），适用于后续的肽组学分析。
- 建立了基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的内源性肽段定量方法，具有良好的可重复性。
- 实现了肽段鉴定的标准化，便于开展筛查和比较研究。
转化与临床前研究
- 将肽类货物分析与疾病相关的免疫模型相整合。
- 支持从发现到免疫调节机制临床前验证的全过程衔接。
- 通过表征囊泡相关肽类，为转化生物标志物策略提供依据。
流程与工作流整合
该方案通过实现对sEVs的稳健肽组学分析，融入从发现到临床前研究的连续过程，支持免疫学领域的机制研究和转化研究。
- 发现生物学：推进关于sEV肽在先天免疫中功能作用的假设验证。
- 筛选：提供可重复的定量肽谱，用于比较分析。
- 分析：采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）生成高置信度的肽段鉴定和丰度测量结果。
- 转化研究：通过表征囊泡内容物，将发现成果与临床前免疫模型相衔接。
- 企业级复用：建立可重复使用的平台，用于跨免疫细胞类型的sEV肽组分析。
运营与企业影响
- 科学价值：提高免疫靶点验证和机制去风险的预测可信度。
- 操作价值：标准化小细胞外囊泡（sEV）的分离和肽组分析，以实现可重复性和可扩展性。
- 战略价值：通过阐明肽介导的免疫机制，支持做出合理的立项或终止决策。
- 项目组合影响：支持对免疫调节项目的优先级进行风险调整后的排序。
实施注意事项
- 需要具备差速超速离心和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析的专业技术。
- 需要具备高速离心和先进质谱基础设施的使用权限。
- 需要跨团队严格标准化，以确保肽段鉴定的可重复性。
- 针对不同细胞来源或囊泡亚型可能需要进行方法调整。
- 得率低且分离过程耗时，仍是高通量应用中的实际限制因素。
