Name: 基于Au Carbon点纳米探针的无标记表面增强拉曼散射生物分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-09T12:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: 了解基于Au@Carbon点纳米探针的无标记表面增强拉曼散射生物分析方法。该技术用于活细胞成像和细菌检测，可在单细胞水平提供非破坏性分子指纹信息。

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本工作得到了国家自然科学基金（32071399 和 62175071）、广州市科技计划项目（2019050001）、广东省基础与应用基础研究基金（2021A1515011988）以及中国教育部光电子科学与技术重点实验室（福建师范大学）开放基金（JYG2009）的资助。

1. Au@CDs 的制备
注意：图1 展示了 Au@CDs 的制备流程。
<ol>
	<li>使用柠檬酸（CA）和没食子酸（GA）制备CD溶液 通过 一种典型的水热处理步骤18加入100 µL的3.0 mg/mL-1 将制备好的CD溶液取一定量加入200 µL的10 mM氯金酸（HAuCl₄）溶液中4）（参见 材料表室温下振荡10秒，直至形成紫色悬液。</li>
	<li>将紫色悬液在4,000 × g 室温孵育10分钟，若去除Au@CD胶体较为困难，可使用移液器小心吸除上清液。</li>
	<li>用200 µL去离子水（电阻率为18.2 MΩ·cm）重悬Au@CDs，以洗涤过量的CDs。</li>
	<li>重复步骤1.2，获得核壳纳米颗粒，重新分散于100 µL去离子水中，4 °C保存。纳米颗粒可保存1个月。</li>
</ol>
2. Au@CDs的表征
<ol>
	<li>透射电子显微镜（TEM）
	<ol>
		<li>将CD和Au@CD样品在-80 °C下冷冻过夜，从冷冻溶液中进行冻干，冻干后研磨成粉末。</li>
		<li>通过超声处理，在100%功率下处理5分钟，将所得粉末样品充分分散于去离子水中。</li>
		<li>将少量样品悬浮液滴加到覆盖有网状碳膜的铜镀膜TEM载网上，干燥后使用加速电压为200 kV的透射电子显微镜采集图像（参见材料表）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>傅里叶变换红外光谱（FT-IR）
	<ol>
		<li>重复步骤2.1.1以获得粉末样品，在研钵中将少量预干燥的KBr颗粒研磨成粉末，加入少量样品，并同时与KBr粉末混合，用于红外表征16。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>紫外-可见-近红外（UV-vis-NIR）吸收光谱
	<ol>
		<li>制备适当浓度的CDs和Au@CDs悬浮液，确保吸光度低于1，并进行UV-vis-NIR表征16。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>拉曼光谱
	<ol>
		<li>开启785 nm半导体激光器，激光功率设为10 mW，物镜放大倍数为20倍。设置曝光时间为5秒，累积次数为三次。</li>
		<li>将等体积的制备好的Au@CDs样品加入5 µL亚甲基蓝（MB）溶液中，并充分混合。</li>
		<li>将一滴悬浮液滴加到黄铜基底上，采集表面增强拉曼散射（SERS）光谱。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 细胞培养
<ol>
	<li>在添加了10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养人肺上皮癌细胞（A549细胞，实验室传代培养），并将细胞置于37 °C、5% CO2的湿润培养箱中孵育。</li>
	<li>将细胞以每孔1 × 105个细胞的密度接种于96孔板中，并用不同浓度（20–100 µM范围内）的Au@CDs处理。使用CCK-8试剂盒检测细胞活力（参见材料表）。每种处理设置三个独立重复。</li>
	<li>进行SERS实验时，请按以下步骤操作：
	<ol>
		<li>将无菌蓝宝石芯片（参见材料表）放入12孔板中，然后将细胞以1 mL培养基接种至单个孔中。将培养板置于37 °C、5% CO2的湿润培养箱中孵育过夜，使细胞融合度达到70%–80%。</li>
		<li>向单个孔中加入Au@CDs，并孵育4–6小时。 
		注意：在孵育前，需检测基底的稳定性，尤其是溶液相纳米颗粒（NPs）。这些材料在储存和使用过程中易发生溶解、聚集和沉降，可能导致电磁损耗降低，从而减弱SERS活性。更重要的是，对于细胞摄取而言，纳米颗粒的尺寸可能产生显著影响22。</li>
		<li>在孵育过程中，基底将通过内吞作用进入细胞。孵育结束后，在光学显微镜下观察细胞，直至在细胞内观察到少量黑色颗粒。 
		注意：若SERS信号较弱，可尝试提高Au@CDs的浓度或延长孵育时间。</li>
		<li>移除培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻冲洗蓝宝石芯片，并将其浸入PBS中用于SERS检测16。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 细胞表面增强拉曼散射实验
<ol>
	<li>打开计算机，开启拉曼光谱仪，启动软件，然后打开 785 nm 激光器&#160;（参见材料表）。</li>
	<li>点击新建测量，开始新的光谱采集。在样品测量前，使用硅片进行校准17&#160;。</li>
	<li>使用 20 倍物镜以确保观察到清晰的细胞图像，然后更换为 50 倍物镜。将激光功率从低到高设置，并设定合适的曝光时间和累加次数。 
	注意：在进行表面增强拉曼光谱（SERS）测量前，需检查合适的激光功率，以防止对细胞造成不可逆损伤，并确保采集参数的一致性。SERS 强度与激光功率、光斑尺寸、累加次数和曝光时间相关。</li>
	<li>选择细胞上的测量点并点击运行。每个细胞测量 20 个点，共测量 10 个细胞取平均值。 
	注意：细胞内组分复杂，导致光谱差异较大。因此，应在相似的细胞区域采集光谱，并尽可能多地采集光谱数据。</li>
	<li>保存光谱数据。</li>
	<li>点击新建流线成像采集，然后点击视频预览，选择需要拍摄的范围，点击确定。设置参数：785 nm 边缘滤光流线，中心波数为 1,200 cm-1，曝光时间为 5 秒，累加次数为 3 次，激光功率为 50%。</li>
	<li>点击新建活细胞成像，选择信号与基线比值，设置范围从第一限值 625 到第二限值 1,700，然后点击区域设置。接着设置合适的步长，点击应用并确定。最后点击运行，开始进行 SERS 成像。</li>
</ol>
5. 细菌培养与表面增强拉曼散射测量
<ol>
	<li>将大肠杆菌（E. coli）和金黄色葡萄球菌（S. aureus）的过夜培养物按1:100比例稀释至5 mL新鲜Luria-Bertani（LB）培养基中（参见材料表）。在37 °C培养至A600为0.4至0.6后，&#160;于5,000 × g离心5 min以收集菌体。</li>
	<li>用1 mL PBS重悬菌体沉淀，室温下以5,000 × g离心5 min，重复两次。</li>
	<li>将细菌培养物与Au@CDs混合，并直接在SERS平台上观察混合物。</li>
</ol>
6. 数据分析
<ol>
	<li>对光谱进行平滑处理并校正基线。</li>
	<li>使用处理后的数据进行主成分分析（PCA）16&#160;。</li>
</ol>

Label-Free SERS Analysis: Au@Carbon Dot Nanoprobes for Molecular Fingerprinting

<ol><li>Zenobi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+metabolomics%3A+analytical+and+biological+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell metabolomics: analytical and biological perspectives.</a> Science. 342 (6163), 1243259(2013).</li>
<li>Dong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+visualization+of+dual+intercellular+signal+transductions+via+SERS+imaging+of+membrane+proteins+dimerization+on+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Simultaneous visualization of dual intercellular signal transductions via SERS imaging of membrane proteins dimerization on single cells.</a> ACS Nano. 16 (9), 14055-14065 (2022).</li>
<li>Lane, L. A., Qian, X., Nie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SERS+nanoparticles+in+medicine%3A+from+label-free+detection+to+spectroscopic+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">SERS nanoparticles in medicine: from label-free detection to spectroscopic tagging.</a> Chemical Reviews. 115 (19), 10489-10529 (2015).</li>
<li>Langer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Present+and+future+of+surface-enhanced+Raman+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Present and future of surface-enhanced Raman scattering.</a> ACS Nano. 14 (1), 28-117 (2020).</li>
<li>Zong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface-enhanced+Raman+spectroscopy+for+bioanalysis%3A+reliability+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Surface-enhanced Raman spectroscopy for bioanalysis: reliability and challenges.</a> Chemical Reviews. 118 (10), 4946-4980 (2018).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface-enhanced+Raman+scattering-based+sensing+in+vitro%3A+facile+and+label-free+detection+of+apoptotic+cells+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Surface-enhanced Raman scattering-based sensing in vitro: facile and label-free detection of apoptotic cells at the single-cell level.</a> Analytical Chemistry. 85 (5), 2809-2816 (2013).</li>
<li>Qi, G., Diao, X., Hou, S., Kong, J., Jin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+SERS+detection+of+protein+damage+in+organelles+under+electrostimulation+with+2D+AuNPs-based+nanomembranes+as+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Label-free SERS detection of protein damage in organelles under electrostimulation with 2D AuNPs-based nanomembranes as substrates.</a> Analytical Chemistry. 94 (43), 14931-14937 (2022).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimer+structures+formed+by+target-triggered+AuNPs+self-assembly+inducing+electromagnetic+hot+spots+for+SERS-fluorescence+dual-signal+detection+of+intracellular+miRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Trimer structures formed by target-triggered AuNPs self-assembly inducing electromagnetic hot spots for SERS-fluorescence dual-signal detection of intracellular miRNAs.</a> Biosensors and Bioelectronics. 224, 115051(2023).</li>
<li>Živanović, V., Milewska, A., Leosson, K., Kneipp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+structure+and+interactions+of+lipids+in+the+outer+membrane+of+living+cells+based+on+surface-enhanced+Raman+scattering+and+liposome+models%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular structure and interactions of lipids in the outer membrane of living cells based on surface-enhanced Raman scattering and liposome models.</a> Analytical Chemistry. 93 (29), 10106-10113 (2021).</li>
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<li>Oliveira, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+SERS+phenotyping+of+single+cancer+cells+in+microdroplets%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Optical+Materials%22%5BJournal%5D)">Multiplex SERS phenotyping of single cancer cells in microdroplets.</a> Advanced Optical Materials. 11 (1), 2201500(2023).</li>
<li>Ho, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+of+pathogenic+bacteria+using+Raman+spectroscopy+and+deep+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Rapid identification of pathogenic bacteria using Raman spectroscopy and deep learning.</a> Nature Communications. 10 (1), 4927(2019).</li>
<li>Spedalieri, C., Kneipp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+enhanced+Raman+scattering+for+probing+cellular+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Surface enhanced Raman scattering for probing cellular biochemistry.</a> Nanoscale. 14 (14), 5314-5328 (2022).</li>
<li>Weng, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+and+reliable+detection+of+microRNA+for+clinically+disease+surveillance+using+SERS+biosensor+integrated+with+catalytic+hairpin+assembly+amplification+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+%26+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive and reliable detection of microRNA for clinically disease surveillance using SERS biosensor integrated with catalytic hairpin assembly amplification technology.</a> Biosensors & Bioelectronics. 208, 114236(2022).</li>
<li>Wang, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target-triggered+nanomaterial+self-assembly+induced+electromagnetic+hot-Spot+Generation+for+SERS-fluorescence+dual-mode+in+situ+monitoring+MiRNA-guided+phototherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Target-triggered nanomaterial self-assembly induced electromagnetic hot-Spot Generation for SERS-fluorescence dual-mode in situ monitoring MiRNA-guided phototherapy.</a> Analytical Chemistry. 93 (41), 13755-13764 (2021).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

综上所述，已成功制备出具有2.1 nm超薄碳点（CD）壳层的Au@CDs纳米复合材料。该纳米复合材料表现出优于纯金纳米颗粒（Au NPs）的表面增强拉曼散射（SERS）灵敏度。此外，Au@CDs在重现性和长期稳定性方面也表现出优异性能。后续研究包括将Au@CDs作为SERS基底用于A549细胞的SERS成像31&#160;以及两种细菌菌株的检测32。研究已证实，Au@CDs可作为超灵敏的SERS探针，其增强机制主要基于金纳米颗粒与碳点之间的化学增强效应。
在之前方案的SERS测量过程中有几个关键点。首先，在将Au@CDs应用于细胞和细菌样品之前，必须确保使用性能优良的SERS基底配方以及合适的浓度，这一点可通过染料分子进行验证。其次，由于生物样品具有复杂性和动态性，细胞中各检测位点的SERS谱图并不一致。
若采用较大的激光光斑，来自不同点的表面增强拉曼光谱（SERS）将更为相似。需要注意的是，同一细胞位点在不同激光功率下测得的SER...

单细胞分析对于揭示细胞异质性和评估细胞的全面状态至关重要。细胞对微环境的即时响应也要求进行单细胞分析1。然而，现有技术仍存在一些局限性。荧光检测可用于单细胞分析，但其灵敏度较低。此外，细胞自身复杂的荧光背景以及在长期照射下发生的荧光漂白现象也带来了其他挑战2。表面增强拉曼散射（SERS）由于具备以下优势，可能适用于单细胞分析：（1）能够反映分子固有的指纹信息和瞬时状态；（2）极高的表面灵敏度；（3）便于实现多重检测；（4）高光稳定性；（5）检测结果可量化，便于比较分析；（6）采用近红外（NIR）波长激发可避免细胞自发荧光干扰；（7）可在细胞水相环境中进行检测；（8）可针对细胞内特定区域进行检测3,4,5。
目前普遍认可的两种机制可用于从基本现象层面理解表面增强拉曼散射（SERS）：以电磁增强（EM）为主导机制，以及化学增强（CM）。电磁增强是指，在特定频率的激发场作用下，当入射光频率与金属中自由电子的振荡频率相匹配时，电磁波驱动集体电子发生振荡，从而引发表面等离激元共振（SPR）。当入射激光作用于金属纳米颗粒（NPs）并引发局域表面等离激元共振（LSPR）时，会导致入射光的共振吸收或散射。&#160;因此，金属纳米颗粒表面的电磁场强度可增强两个到五个数量级4然而，SERS 增强效应的关键并非单个金属纳米颗粒，而是两个纳米颗粒之间的间隙，该间隙可形成热点。化学机制（CM）来源于两个方面：（1）目标分子与金属纳米颗粒之间的相互作用；（2）目标分子能够向金属纳米颗粒转移电子。4,5更详尽的细节可参见以下综述文章4,5已有若干文献报道了在活细胞中进行表面增强拉曼散射（SERS）生物传感与成像的有前景方法，例如凋亡细胞的检测6细胞器中的蛋白质7细胞内miRNA8细胞脂质膜9细胞因子10和代谢物11&#160;在活细胞中，以及通过共聚焦SERS成像对细胞的识别与监测2,11,12,13有趣的是，无标记表面增强拉曼光谱（SERS）具有SERS的独特优势，能够描述分子内部的光谱特征5.
无标记表面增强拉曼散射（SERS）面临的一个主要问题是缺乏合理且可靠的基底。典型的SERS基底是贵金属纳米颗粒（NPs），因其具有优异的强光散射能力14。如今，由于纳米复合材料具有显著的物理化学性质和良好的生物相容性，人们对其关注日益增加。更重要的是，由于纳米杂化结构中的“热点”可产生强烈的电磁场（EM），同时非金属材料还能提供额外的化学增强效应，因此纳米复合材料可表现出更优的SERS活性15。例如，Fei等人利用二硫化钼（MoS2）量子点（QDs）作为还原剂，合成了Au NP@MoS2 QD纳米复合材料，用于小鼠4T1乳腺癌细胞（4T1细胞）的无标记近红外（NIR）SERS成像16。此外，Li等人构建了一种由金纳米颗粒（Au NPs）和二维铪碲化物（hafnium ditelluride）纳米片组成的二维SERS基底，用于食源性致病菌的无标记SERS检测17。最近，碳点（CDs）作为一种优良的电子供体，已被用作还原剂，在无需其他还原剂或辐照的条件下合成Au@碳点纳米探针（Au@CDs）18，据报道，这种材料可通过Au核与CD壳之间的电荷转移（CT）效应有效增强SERS信号19,20。不仅如此，碳点还被公认为是一种封端剂和稳定剂，可防止Au纳米颗粒发生聚集21。此外，碳点能提供大量结合位点和活性位点，从而为与分析物的进一步反应创造了更多可能性20。利用上述优势，Jin等人开发出一种快速且可控的方法，用于制备具有独特SERS特性和优异催化活性的Ag@CD纳米颗粒，可实现实时监测非均相催化反应18。
本文展示了一种简便且低成本的方法，用于制备核壳结构的金-环糊精（Au@CD）表面增强拉曼散射（SERS）基底，可用于识别细胞组分、无标记SERS活细胞生物成像，以及检测并区分大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S. aureus），该方法在疾病早期诊断及深入理解细胞过程方面具有广阔应用前景。

<table><tbody><tr><td>10x PBS缓冲液（细胞培养）</td><td>Langeco Technology</td><td>BL316A</td><td></td></tr><tr><td>6孔细胞培养板</td><td>LABSELECT</td><td>11110</td><td></td></tr><tr><td>细胞计数试剂盒-8（CCK-8）</td><td>GLPBIO</td><td>GK10001</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸</td><td>上海阿拉丁生化科技</td><td>C108869</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Thermo Fisher Technologies</td><td>3111</td><td></td></tr><tr><td>恒温磁力搅拌器</td><td>Sartorius Scientific Instruments</td><td>SQP</td><td></td></tr><tr><td>冷冻高速离心机</td><td>上海博迅</td><td>SW-CJ-2FD</td><td></td></tr><tr><td>DMEM高糖细胞培养基</td><td>Procell</td><td>PM150210</td><td></td></tr><tr><td>电子天平</td><td>Sartorius Scientific Instruments</td><td>SQP</td><td></td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>Thermo Fisher Technologies</td><td>3111</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>浙江天航生物科技</td><td>11011-8611</td><td></td></tr><tr><td>图1</td><td>Figdraw.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>傅里叶变换红外光谱仪</td><td>Thermo, 美国</td><td>Nicolet 380</td><td></td></tr><tr><td>冷冻干燥机</td><td>Tecan</td><td>Infinite F50</td><td></td></tr><tr><td>没食子酸</td><td>上海阿拉丁生化科技</td><td>G104228</td><td></td></tr><tr><td>手持式拉曼光谱仪</td><td>OCEANHOOD, 中国上海</td><td>Uspectral-PLUS</td><td></td></tr><tr><td>HAuCl&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>广州医药公司（广州）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>高分辨率透射电子显微镜</td><td>Thermo Fisher Technologies</td><td>FEI Tecnai G2 Spirit T12</td><td></td></tr><tr><td>高温高压灭菌锅</td><td>上海博迅</td><td>YXQ-LS-50S&amp;nbsp;&lt;img alt=&quot;方程2&quot; src=&quot;/files/ftp_upload/65524/65524eq02.jpg&quot; style=&quot;margin: auto;&quot;/&gt;</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>南京江南永新光学</td><td>XD-202</td><td></td></tr><tr><td>LB肉汤BR</td><td>环凯微生物</td><td>028320</td><td></td></tr><tr><td>医用超低温冰箱</td><td>Thermo Fisher Technologies</td><td>ULTS1368</td><td></td></tr><tr><td>亚甲蓝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶细胞消化液</td><td>beyotime</td><td>C0207</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素双抗</td><td>上海博迅</td><td>YXQ-LS-50S&amp;nbsp;&lt;img alt=&quot;方程2&quot; src=&quot;/files/ftp_upload/65524/65524eq02.jpg&quot; style=&quot;margin: auto;&quot;/&gt;</td><td></td></tr><tr><td>纯水仪</td><td>Millipore, 美国</td><td>Milli-Q System</td><td></td></tr><tr><td>拉曼光谱仪</td><td>Renishaw</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蓝宝石芯片</td><td>beyotime</td><td></td><td></td></tr><tr><td>恒温水浴锅</td><td>常州诺基</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超净工作台</td><td>上海博迅</td><td>SW-CJ-2FD</td><td></td></tr><tr><td>紫外-可见光吸收光谱仪</td><td>MADAPA, 中国</td><td>UV-6100S</td><td></td></tr><tr><td>线缆3.4</td><td>Renishaw</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

基于金@碳点纳米探针的无标记表面增强拉曼散射生物分析

Label-Free Surface-Enhanced Raman Scattering Bioanalysis Based on Au@Carbon Dot Nanoprobes

表面增强拉曼散射（SERS）技术因其能够提供生物样本的分子指纹信息以及在单细胞分析中的潜力，近年来在生物医学领域受到越来越多的关注。本研究旨在建立一种基于金@碳点纳米探针（Au@CDs）的无标记SERS生物分析简易策略。在此，利用多酚衍生的碳点作为还原剂，快速合成核壳结构的Au@CD纳米材料，由于其协同拉曼增强机制，即使亚甲基蓝（MB）浓度低至10-9 M时仍表现出优异的SERS性能。在生物分析中，Au@CDs可作为独特的SERS纳米传感器，用于识别生物样本（如癌细胞和细菌）的细胞组分。结合主成分分析，可进一步区分不同物种的分子指纹。此外，Au@CDs还能够实现无标记SERS成像，用于分析细胞内成分分布。该策略为纳米诊断开辟了新前景，提供了一种可行的无标记SERS生物分析方法。

Au@CDs 的制备过程如图所示 图1. 碳点由CA和GA制备 通过 一种典型的水热法18. 通过还原HAuCl快速合成了Au@CDs4 在室温水相中通过CDs形成。CDs和Au@CDs的尺寸与形貌可通过透射电子显微镜（TEM）及高分辨率（HR）TEM观察。23制备的碳点呈单一分散，尺寸较小，约为2-6 nm（图 2A）。球形金核被一层约2.1 nm的CD壳包覆（图2B，C 和 补充图 1).
为了确认 CDs 和 Au@CDs 的结构，通过记录傅里叶变换红外光谱（FT-IR）来分析有机官能团（图...

本研究开发了一种低成本、生物相容性良好的基于表面增强拉曼散射（SERS）的指纹纳米探针，可用于无标记活细胞生物成像并检测两种细菌菌株，详细展示了如何以非破坏性方法获取活细胞的SERS光谱。

表面增强拉曼散射（SERS）技术因其能够提供分子指纹信息，在生物医学领域受到越来越多的关注

本研究中，我们开发了一种基于表面增强拉曼散射、具有优良生物相容性的低成本指纹纳米探针。该探针可实现无标记活细胞肠道成像，并通过提供分子指纹信息检测两种细菌菌株。我们还对单个活细胞进行了主成分分析。研究人员最近致力于提高灵敏度、可重复性，并开发无源痕量技术以提供可靠的分子信息，从而实现多种分析物的提交与检测，并可结合机器数据分析以提升性能。由于样品中存在许多其他化学物质，可能会干扰背景信号，因此从细胞中获取特异性的拉曼信号具有挑战性。与冷冻检测相比，无标记技术具有实际的高表面灵敏度，能够实现细胞内空间误差的定向检测。更重要的是，该技术可在自然条件下无限制地提供单个细胞水平上的内在化学信息。未来，我们的研究将聚焦于碳点基系统的完整架构，包括纳米结构的制备和光源真空系统。我们还将关注该光源系统的生物医学应用，例如细胞研究和与细胞类型无关的应用。首先，在室温下将100 µL制备好的碳点溶液加入200 µL氯金酸溶液中，持续10秒，直至形成紫色悬浊液。接下来，在室温下以 4,000 G 离心紫色悬液 10 分钟。若难以去除金-碳点复合纳米颗粒胶体，请使用移液器小心移除上清液。将金-碳点复合纳米颗粒重悬于 200 微升去离子水中，以洗去多余的碳点。再次离心悬浮液，弃去上清液，并通过在100 µL去离子水中重新分散获得核壳纳米颗粒。将混合物在4 °C下保存。制备金-碳点复合纳米颗粒后，将无菌蓝宝石芯片放入24孔板中，并向单个孔中加入1 mL培养基接种细胞。将培养板置于湿润环境中孵育，直至细胞融合度达到70%至80%。向单个孔中加入金碳点复合纳米颗粒，并孵育4至6小时。孵育结束后，从蓝宝石芯片上移除培养基。用 PBS 轻轻冲洗芯片，并将蓝宝石芯片浸入 PBS 中进行 SERS 检测。进行 SERS 实验时，打开计算机、拉曼光谱仪和 785 纳米激光器。接着，启动配套软件，并使用硅晶片进行校准。单击“新建测量”，随后进行光谱采集并调整光谱范围，然后进入采集选项卡，调节曝光时间和激光功率，单击“确定”以启动新的光谱采集。使用20倍物镜获得清晰的细胞图像，然后切换至50倍物镜。在细胞上选择测量点后，单击“运行”以启动测量过程，随后保存所获得的光谱。为了获得A549细胞的SERS成像，点击新建流线成像采集，选择需要拍摄的范围，然后点击确定。将边缘流线设置为785纳米，中心设置为1,200 cm⁻¹，曝光时间设置为5秒，激光功率设置为50%。参数可根据需要进行调整。点击实时成像中的新建，选择信号相对于基线，并将第一限值设置为725，第二限值设置为1,700，然后进入区域设置，设定合适的步长，点击确定。最后，点击运行以开始进行SERS成像。SERS光谱显示，即使亚甲蓝的浓度低至10⁻⁹ M，金-碳点复合纳米颗粒相较于金纳米颗粒仍表现出优异的SERS性能。在20个点采集的SERS光谱显示出高度相似性。在4摄氏度下放置金-碳点复合纳米颗粒一个月后，其在951、185和1,620厘米⁻¹处的平均表面增强拉曼散射（SERS）活性分别显示出约5.43%、11.44%和13.94%的衰减。金-碳点复合纳米颗粒对A549细胞几乎无细胞毒性。图中展示了A549细胞的平均拉曼光谱。金-碳点复合纳米粒子聚集体在A549细胞的表面增强拉曼散射（SERS）成像中表现出明显的SERS信号，且无背景噪声。来自细胞不同位点的光谱揭示了细胞质不同区域组分的异质性。

label-free-surface-enhanced-raman-scattering-bioanalysis-based-on

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

基于Au@Carbon点纳米探针的无标记表面增强拉曼散射生物分析

在本视频中，我们介绍了一种基于拉曼光谱的直接免疫分析方法，用于检测特定的目标抗原。附着在拉曼探针表面的金纳米颗粒上的抗体可与目标抗原发生相互作用，产生特定的拉曼光谱，随后被检测到。...

一种基于拉曼光谱的直接免疫测定法检测特定抗原

我们描述了纳米生物系统的制备与表征，该系统将纳米结构基底与固定化的蛋白质和适配体进行界面结合。文中报道了涉及纳米结构基底的光刻制备、生物功能化以及表面增强拉曼光谱（SERS）表征等相关实验步骤。展示了对表面固定化蛋白质的SERS检测，以及对蛋白质-配体和适配体-配体结合相互作用的探测。...

利用电子束光刻制备的纳米结构基底通过表面增强拉曼光谱检测生物分子

一种基于滤膜的表面增强拉曼光谱（SERS）检测化学污染物的制备与检测方法即，...

基于滤膜的表面增强拉曼光谱法快速检测化学污染物

基于纳米颗粒的光学探针已被设计为用于通过拉曼光谱和紫外-可见光谱检测抗原的载体。本文描述了一种制备此类探针用于紫外-可见/拉曼光谱免疫分析的方案，该方案可整合未来的多重检测能力。...

构建紫外-可见光与拉曼光谱免疫分析平台

本研究介绍了一种用于增强基于纳米探针生物传感信号的实验方案。该方案基于将氯金酸还原至现有纳米探针表面，这些纳米探针由金、银、二氧化硅或氧化铁纳米颗粒组成。...

快速纳米探针信号增强 原位 金纳米颗粒的合成

卵巢癌会在整个腹膜腔内形成转移灶。本文介绍了一种制备和使用叶酸受体靶向的表面增强共振拉曼散射纳米探针的方案，该探针可通过比率成像以高特异性揭示这些病灶。via...

基于叶酸受体靶向的表面增强共振拉曼散射纳米探针比率法检测微小卵巢癌

本文介绍了光谱聚焦模块与双输出脉冲激光器的集成，实现了对金纳米颗粒和癌细胞的快速高光谱成像。本研究旨在展示在标准激光扫描显微镜上实现多模态非线性光学技术的详细方法。...

利用多模态非线性光学显微技术对细胞摄取纳米颗粒的生物分子成像

本文提出了一种新一代的多参数分析平台，可提高细胞外囊泡亚群表征的通量。该方法结合了多重生物传感技术与原子力显微镜的计量学和形貌力学分析，并耦合拉曼光谱，用于对捕获在微阵列生物芯片上的囊泡靶标进行定性分析。...

基于多重表面等离子体共振成像芯片的多模态分析平台用于细胞外囊泡亚群分析

本方案展示了利用DNA折纸纳米天线（DONA）结合共定位原子力显微镜（AFM）与拉曼测量技术进行单分子表面增强拉曼散射（SERS）测量的方法。...

由等离激元DNA折纸纳米天线实现的单分子表面增强拉曼散射测量

液相超快激光烧蚀是一种在液体/空气环境中精确且多功能的纳米材料（纳米颗粒[NPs]和纳米结构[NSs]）合成技术。通过激光烧蚀制备的纳米材料可与拉曼活性分子功能化结合，以增强位于纳米结构/纳米颗粒上或附近的分析物的拉曼信号。...

超快激光烧蚀纳米颗粒与纳米结构在表面增强拉曼散射传感应用中的研究

了解基于Au@Carbon点纳米探针的无标记表面增强拉曼散射生物分析方法。该技术用于活细胞成像和细菌检测，可在单细胞水平提供非破坏性分子指纹信息。

基于金@碳点纳米探针的无标记表面增强拉曼散射生物分析

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