简化的小动物活体成像方法用于倒置共聚焦显微镜下长期监测上皮组织动态变化

我们开发了一种利用倒置共聚焦显微镜在活体小鼠中进行活体成像的工具。该技术使我们能够追踪皮肤细胞在稳态过程中的动态变化，并比较疾病发生和发展过程中细胞行为的差异。多光子显微镜是实现活体细胞追踪的主要方法。

然而，这些显微镜的缺点包括日常成像灵活性有限、成本高昂以及技术复杂。我们的新工具使得多功能倒置共聚焦显微镜可用于活体内的活体成像。通过修改设计文件，可定制载物台插入件的尺寸，以适配任意品牌的倒置显微镜。

可根据所选的动物模型和组织调整目标孔的大小和位置。要开始在倒置显微镜载物台上安装3D打印的活体成像插件，请小心地将插件放入显微镜载物台的大槽中。使用螺丝固定插件的每个角落。

将加热板以插头朝下的方向从插板侧面开口滑入，使加热板位于插板下方的凹槽上方，插头端口位于载物台下方。将插板上的带凹槽圆形开口与40倍硅油浸入式物镜对齐，并在物镜中心涂抹硅油。然后使用注射器，在带凹槽的圆形开口处涂抹少量真空脂。

将盖玻片圆片置于开口上方，以密封插入装置。最后，升起40倍物镜，直至其轻轻接触玻璃盖玻片底部。在将麻醉小鼠放置于倒置显微镜载物台上已安装的活体成像插入装置之前，先将连接有鼻罩的异氟烷管路穿过插入装置上的角落管路支架。

将连接有直肠温度探针的加热板插入控制器并打开电源后，将麻醉的小鼠从诱导室转移至加热板上。然后将鼻罩固定在小鼠鼻部。将直肠探针插入动物体内，并调节控制器以维持其体温稳定在约 36 摄氏度。

用塑料保鲜膜覆盖位置正确的小鼠，以锁住体温并提高其体温。调整小鼠位置，使其头部与盖玻片圆盘对齐，并使用金属耳夹或胶带将耳朵固定在玻璃盖玻片的中心。成像完成后，选择电子蒸发器上的低流量模式，停止异氟烷输送。

将小鼠转移至加热垫，直至其恢复自主活动。取下盖玻片后，用镜头纸和镜头清洁液将其擦拭干净。妥善保存以避免划伤，以便重复使用。

接下来，将麻醉管从插件支架上拆下，并从显微镜载物台上拧下插件。对荧光标记的活体小鼠耳组织进行Z轴扫描成像，结果显示在x、y和z轴方向上随时间推移漂移极小，验证了定制的3D打印活体成像插件的有效性。对一只成年雄性小鼠耳部表皮中mCherry阳性细胞进行为期三小时的延时成像，其时间点数据显示，在整个延长时间内仅有一个Z平面保持清晰对焦。

在另一段持续三小时的延时录像中，也观察到了成年雌性小鼠耳部皮肤成纤维细胞（GFP阳性）的类似现象。