Name: 黑腹果蝇第三龄幼虫脑的活细胞成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T12:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: 学习黑腹果蝇第三龄幼虫脑的活细胞成像技术，用于研究神经干细胞不对称分裂的动态过程。本方法支持长期成像并保持样本质量，为发育神经生物学提供重要工具。

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本研究由 R35GM148160（C. C.）及美国国立卫生研究院（NIH）培训基金 T32 GM007270（R. C. S）资助。

注意：图1 显示了进行本研究所需要的材料。
1. 实验的注意事项与准备工作
<ol>
	<li>避免幼虫过度拥挤。 
	注意：外植幼虫脑组织的质量直接取决于解剖前幼虫的健康状况和质量。因过度拥挤而导致营养不良的幼虫通常会获得质量较低的脑组织30。
	<ol>
		<li>每餐帽皿中幼虫数量不应超过20–30只，以避免营养不良。示例见图2。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用前过滤并分装Schneider培养基。
	<ol>
		<li>每次解剖前，通过向分装的Schneider昆虫培养基中添加1%牛生长血清（BGS）来配制新鲜的成像和解剖培养基。通常，5 mL的解剖和成像培养基足以满足一次成像实验的需求。</li>
		<li>使用前将添加了补充成分的培养基恢复至室温（RT）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>考虑所需采集影片的时长，并据此调整成像培养基的添加成分、样品固定方式以及显微镜的采集参数。 
	注意：在仅添加BGS的最优条件下，脑组织中的神经母细胞（NBs）可稳定分裂超过3小时。
	<ol>
		<li>若实验需要更长的成像时间（超过4小时），可在成像培养基中加入幼虫脂肪体组织以支持持续分裂。 
		​注意：脂肪体可分泌促进有丝分裂的因子，支持神经母细胞增殖31，来自10只幼虫的完整脂肪体足以支持4至5个脑组织样本。此外，已有研究表明，使用膜片载玻片成像的样本可分裂超过10小时13,32，而使用多孔载玻片成像的样本分裂频率通常较低（未发表观察结果）。</li>
		<li>或者，可采用更复杂的成像培养基以支持长时间成像，具体方法如前所述33。为获得最佳效果，应通过调整曝光时间、激光功率和采样频率来尽量减少光损伤。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 幼虫的分期与收集（图2）
<ol>
	<li>将1-5日龄的雌性处女蝇与1-7日龄的雄性成蝇杂交，以获得具有目标基因型的子代。为获得最佳杂交产量，建议将10-15只雌性处女蝇与5-10只雄蝇共同培养。将这些果蝇放入带有食物帽的果蝇饲养笼中图2A- C），并在指定温度下孵育 25 °C.</li>
	<li>每天更换食物帽，以防止幼虫在食物帽中过度聚集，从而避免影响解剖脑组织的质量。</li>
	<li>如果餐盖上覆盖有大量幼虫（即 &gt;30），将该食物帽切成两半，替换其中一半为同样切半的新鲜食物帽。或者更频繁地更换食物帽（例如每12小时一次，而非每24小时一次）。过度拥挤的食物帽示例见于 图 2E，F.</li>
	<li>将餐帽与幼虫一起孵育 25 °C 直到幼虫达到所需的龄期。</li>
</ol>
3. 幼虫脂肪体解剖（图3）
注意：本方案描述使用三孔解剖皿进行的解剖操作。
<ol>
	<li>用移液器向3孔解剖培养皿的每个孔中加入约400 µL解剖与成像培养基。</li>
	<li>用解剖镊子轻轻夹住10只72–96小时龄、营养良好的野生型幼虫，将其在最底部孔中的解剖液中反复浸入和取出，以洗去所有食物残渣。清洗完毕后，将干净的幼虫转移至中间孔中。</li>
	<li>用一对镊子夹住幼虫的口钩，再用另一对镊子刺破幼虫体壁的一侧。</li>
	<li>体壁破裂后，脂肪体会从幼虫体内溢出。脂肪体呈乳白色、半透明状，具有网状结构（图3I）。脂肪体容易相互粘连，并粘附在解剖镊子上。确认后，尽可能收集每只幼虫的脂肪体，并用镊子将其转移至最上方含有400 µL室温解剖培养基的孔中。</li>
</ol>
4. 幼虫脑解剖（图3）
<ol>
	<li>用上述解剖与成像培养基清洗实验幼虫，以去除食物残渣。为获得最佳效果，避免将未解剖的幼虫储存在解剖溶液中，否则会导致幼虫“溺亡”，从而对解剖所得脑组织的质量产生不利影响。</li>
	<li>用一把镊子夹住幼虫的口钩，再用另一把镊子从幼虫后端轻轻剪开或撕掉约三分之一的部分。图3A）。这将导致消化道、脂肪体、结缔组织和神经系统等结构从幼虫破裂的一侧涌出图3B).</li>
	<li>用一把镊子夹住幼虫的口钩。用另一把镊子轻轻将表皮朝口钩方向刷动，同时用夹住口钩的镊子向内“推”，直至整个幼虫完全翻转成内向外的状态。该操作类似于将袜子翻面的过程。图 3C，D).</li>
	<li>将幼虫翻转，使其中枢神经系统及其他组织朝外，但仍与表皮相连。在此步骤中，需定位中枢神经系统（CNS），以避免意外移除。使用镊子轻轻去除所有非中枢神经系统的组织，仅保留与表皮相连的中枢神经系统和脑图3E).</li>
	<li>大脑将附着在角质层上 通过 轴突连接。使用显微解剖剪刀剪断这些轴突连接，以将脑组织从体壁中分离。操作时，首先轻轻剪开脑叶下方的连接处（图3F）。重复腹神经索下方的连接操作。 
	注意：若无显微解剖剪，可使用镊子进行此步骤。使用镊子时需格外小心，确保从角质层取出脑组织时不会过度拉伸，因为机械应力会对脑组织健康产生不利影响。</li>
	<li>将解剖好的脑组织转移至含有解剖与成像培养基的孔中。对于超过3小时的成像实验，使用如上所述添加了脂肪体的解剖与成像培养基。将幼虫分批进行解剖，以确保解剖时间少于20分钟。</li>
</ol>
5. 封片与成像（图4）
<ol>
	<li>使用膜载玻片进行成像时34：
	<ol>
		<li>将解剖得到的脑组织和分离的脂肪体均收集至解剖皿的最后一个孔中。</li>
		<li>通过将透气膜覆盖在载玻片背面，并将分体环压入中心位置固定，组装载玻片的一半（图4A-C）。</li>
		<li>使用200 µL移液器，将最多10个解剖得到的脑组织以及尽可能多的脂肪体（见上文）转移至约130–140 µL的解剖与成像培养基中，并将其加至透气膜上。确保将含有样本的培养基置于透气膜中央（图4D，E）。</li>
		<li>根据待成像的神经前体细胞（NB）群体及所使用的显微镜类型，调整脑组织的方向（图4E）。尽可能将样本放置在靠近显微镜物镜的位置。例如，若需对中央脑叶中的NB进行成像，则应调整脑组织方向，使脑叶最接近物镜（图4H）。</li>
		<li>脑组织定位完成后，轻轻地将玻璃盖玻片置于膜上的溶液表面。这将使含有脑组织和脂肪体的溶液扩散至整个膜表面（图4F）。</li>
		<li>用实验室纸巾靠近盖玻片边缘吸除多余溶液。当脑组织刚好接触盖玻片但未被压扁时，即为最佳液量。若此步骤中需要重新调整方向，可小心移动盖玻片以带动脑组织位移。</li>
		<li>用画笔沿盖玻片边缘涂抹融化的石蜡油以固定盖玻片。待其凝固（图4G）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用多孔成像载玻片进行成像时（图4）：
	<ol>
		<li>向多孔载玻片的一个孔中加入400 µL成像培养基（本实验中使用的是8孔腔室微[µ]-载玻片；图4I）。将先前解剖得到的脂肪体转移至该孔中（见步骤3.4）。</li>
		<li>将最多10个脑组织以簇状形式沉积于孔的中心附近（图4J）。</li>
		<li>按照步骤5.1.4所述方法，根据待成像的NB群体及所使用的显微镜类型调整脑组织方向（图4K）。将样本排列得彼此靠近，以最小化载物台在不同样本间移动的距离，从而减少采集过程中的样本漂移。</li>
		<li>脑组织在孔中完成定向后，静置2–5分钟使其沉降。此过程可提高样本在运输和成像期间的稳定性。在此期间准备显微镜以开始图像采集。</li>
		<li>用载玻片盖板覆盖µ-载玻片，并将其转移至显微镜。开始采集时应使用尽可能低的激光功率和曝光时间，以最大限度减少光漂白。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 数据处理与管理的最佳实践
<ol>
	<li>根据可用的分析软件，按需处理数据。
	<ol>
		<li>对于此处所示的示例，使用 SlideBook 软件将采集的数据保存为 SlideBook 图像文件（.sld）。</li>
		<li>若需使用 Imaris 文件转换器将其转换为 Imaris 的专有文件类型（.ims），请在单独窗口中打开 Imaris 文件转换器。点击并将 .sld 文件拖入 Imaris 文件转换器的“输入”区域。</li>
		<li>确定转换后文件的期望输出位置，然后点击“全部开始”。</li>
		<li>转换完成后，在 Imaris 软件中查看并标注数据。 
		注：可使用其他图像分析软件替代 Imaris，例如 Fiji（https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html）、Aivia（https://www.aivia-software.com/）、Volocity（https://www.volocity4d.com/）或其他软件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为确保妥善记录，应尽可能保留原始数据。例如，若采集软件以一种文件格式保存，但为分析需要转换为另一种格式，则应保留数据的原始采集版本。</li>
	<li>进行数据分析时，应尽可能详细记录样本信息和采集参数。需保留的关键信息包括解剖幼虫的基因型、解剖前幼虫的龄期、其培养所用食物的状态、成像过程中使用的激光功率、曝光时间、采集时长以及时间分辨率。</li>
</ol>
7. 细胞周期长度的定量示例（图5）
注意：本示例中成像的是表达极性标记蛋白Pins（Pins::EGFP16）和微管结合蛋白Jupiter25（cherry::Jupiter13）的幼虫。后续分析使用Imaris软件进行。
<ol>
	<li>使用选定的图像分析软件打开视频。浏览视频的整个时长，识别正在分裂的神经母细胞（NBs），并对其进行标记以供后续参考。通过其明显的有丝分裂纺锤体来识别分裂中的神经母细胞（图5C-E）。</li>
	<li>确定一个参考细胞周期阶段，以计算细胞周期的持续时间。在本示例中，以中期作为参考阶段。</li>
	<li>手动确定连续两次中期之间的帧数，并将其转换为分钟或小时，以计算完成一个细胞周期所需的时间。
	<ol>
		<li>可通过将视频的时间分辨率乘以中期之间的帧数来实现。例如，如果视频的时间分辨率为每5分钟一帧，且在第13帧和第35帧观察到中期，则这两次中期之间的时间间隔为110分钟（[35 − 13] × 5）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用适当的软件对数据进行绘图。此处所示数据使用PRISM软件绘制。</li>
</ol>
8. 细胞纺锤体排列方向的定量分析示例（图5）
注意：本示例中使用 Imaris 软件进行分析。
<ol>
	<li>在 Imaris 或其他选定软件中打开视频文件。浏览整个视频以识别正在分裂的神经母细胞（NBs），并对其进行标记以便后续参考。</li>
	<li>利用顶端和基底中心体（以 m 表示）确定由纺锤体极形成的向量，方法如下： 
	<img alt="三维空间中的向量减法数学公式，符号：m(x₁,y₁,z₁)。" src="/files/ftp_upload/65538/65538eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方程 1"> 
	其中 Ax、Ay 和 Az 为顶端中心体的坐标，Bx、By 和 Bz 为基底中心体的坐标。类似地，分裂向量的轴线（以 n 表示）由顶端 Pins::EGFP 新月形结构的中点与基底皮层的中点构成： 
	<img alt="向量减法公式 n(x₂,y₂,z₂) = (Aₓ−Bₓ,Aᵧ−Bᵧ,A𝓏−B𝓏)，数学表达式。" src="/files/ftp_upload/65538/65538eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方程 2"> 
	其中 Ax、Ay 和 Az 为 Pins::EGFP 新月形结构中点的坐标，Bx、By 和 Bz 为基底皮层中点的坐标。</li>
	<li>计算向量 m 和 n 的模长： 
	向量 m 的模长：<img alt="模长公式 \(|m|=\sqrt{x_1^2+y_1^2+z_1^2}\)，向量数学概念，方程形式。" src="/files/ftp_upload/65538/65538eq03.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方程 3"> 
	向量 n 的模长：<img alt='模长公式 |n|=√(x²+y²+z²)，三维坐标表示的向量模长计算公式。' src="/files/ftp_upload/65538/65538eq04.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方程 4"></li>
	<li>计算向量 m 与 n 的点积（以 k 表示）： 
	<img alt="点积公式，k = m·n=(x₁*x₂)+(y₁*y₂)+(z₁*z₂)，向量数学概念。" src="/files/ftp_upload/65538/65538eq05.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方程 5"></li>
	<li>利用点积 k 及向量 m 与 n 的模长，计算两向量之间的夹角： 
	<img alt="角度计算公式：θ = cos⁻¹(k/|m||n|)；三角函数公式，用于教学。" src="/files/ftp_upload/65538/65538eq06.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方程 6"></li>
	<li>使用选定软件绘制数据。此处展示的数据在 Microsoft Excel 中整理，并通过 PRISM 软件可视化。</li>
</ol>

Imaging Live Brain Explants from Drosophila melanogaster Third Instar Larvae

<ol><li>Delgado, M. K., Cabernard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+regulation+of+cell+size%2C+fate%2C+and+behavior+during+asymmetric+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanical regulation of cell size, fate, and behavior during asymmetric cell division.</a> Current Opinion in Cell Biology. 67, 9-16 (2020).</li>
<li>Sunchu, B., Cabernard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+mechanisms+of+asymmetric+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Principles and mechanisms of asymmetric cell division.</a> Development. 147 (13), (2020).</li>
<li>Homem, C. C. F., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+neuroblasts%3A+A+model+for+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Drosophila neuroblasts: A model for stem cell biology.</a> Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).</li>
<li>Gallaud, E., Pham, T., Cabernard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+neuroblasts%3A+A+model+for+asymmetric+stem+cell+divisions%5BTitle%5D)+AND+%22Results+and+Problems+in+Cell+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster neuroblasts: A model for asymmetric stem cell divisions.</a> Results and Problems in Cell Differentiation. 61 (1489), 183-210 (2017).</li>
<li>Loyer, N., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Where+does+asymmetry+come+from%3F+Illustrating+principles+of+polarity+and+asymmetry+establishment+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Where does asymmetry come from? Illustrating principles of polarity and asymmetry establishment in Drosophila neuroblasts.</a> Current Opinion in Cell Biology. 62, 70-77 (2020).</li>
<li>Pollington, H. Q., Seroka, A. Q., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+temporal+patterning+to+neuronal+connectivity+in+Drosophila+type+I+neuroblast+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">From temporal patterning to neuronal connectivity in Drosophila type I neuroblast lineages.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 142, 4-12 (2023).</li>
<li>Oon, C. H., Prehoda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+recruitment+and+actin+dependent+cortical+flows+drive+the+neuroblast+polarity+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Asymmetric recruitment and actin dependent cortical flows drive the neuroblast polarity cycle.</a> eLife. 8, e45815(2019).</li>
<li>Ramat, A., Hannaford, M., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+miranda+localization+in+Drosophila+neuroblasts+involves+interaction+with+the+cognate+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of miranda localization in Drosophila neuroblasts involves interaction with the cognate mRNA.</a> Current Biology. 27 (14), 2101-2111 (2017).</li>
<li>Oon, C. H., Prehoda, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phases+of+cortical+actomyosin+dynamics+coupled+to+the+neuroblast+polarity+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Phases of cortical actomyosin dynamics coupled to the neuroblast polarity cycle.</a> eLife. 10, e66574(2021).</li>
<li>LaFoya, B., Prehoda, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-dependent+membrane+polarization+reveals+the+mechanical+nature+of+the+neuroblast+polarity+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Actin-dependent membrane polarization reveals the mechanical nature of the neuroblast polarity cycle.</a> Cell Reports. 35 (7), 109146(2021).</li>
<li>Siller, K. H., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lis1%2Fdynactin+regulates+metaphase+spindle+orientation+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Lis1/dynactin regulates metaphase spindle orientation in Drosophila neuroblasts.</a> Developmental Biology. 319 (1), 1-9 (2008).</li>
<li>Siller, K. H., Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NuMA-related+Mud+protein+binds+Pins+and+regulates+spindle+orientation+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The NuMA-related Mud protein binds Pins and regulates spindle orientation in Drosophila neuroblasts.</a> Nature Cell Biology. 8 (6), 594-600 (2006).</li>
<li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical%2Fbasal+spindle+orientation+is+required+for+neuroblast+homeostasis+and+neuronal+differentiation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila.</a> Developmental Cell. 17 (1), 134-141 (2009).</li>
<li>Cabernard, C., Prehoda, K. E., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spindle-independent+cleavage+furrow+positioning+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A spindle-independent cleavage furrow positioning pathway.</a> Nature. 467 (7311), 91-94 (2010).</li>
<li>Connell, M., Cabernard, C., Ricketson, D., Doe, C. Q., Prehoda, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+cortical+extension+shifts+cleavage+furrow+position+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Asymmetric cortical extension shifts cleavage furrow position in Drosophila neuroblasts.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (22), 4220-4226 (2011).</li>
<li>Tsankova, A., Pham, T. T., Garcia, D. S., Otte, F., Cabernard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+polarity+regulates+biased+myosin+activity+and+dynamics+during+asymmetric+cell+division+via+Drosophila+rho+kinase+and+protein+kinase+N%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell polarity regulates biased myosin activity and dynamics during asymmetric cell division via Drosophila rho kinase and protein kinase N.</a> Developmental Cell. 42 (2), 143-155 (2017).</li>
<li>Montembault, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+efflux+promotes+cell+elongation+to+coordinate+chromosome+segregation+with+cell+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Myosin efflux promotes cell elongation to coordinate chromosome segregation with cell cleavage.</a> Nature Communications. 8 (1), 326(2017).</li>
<li>Roubinet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporally+separated+cortical+flows+and+spindle+geometry+establish+physical+asymmetry+in+fly+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporally separated cortical flows and spindle geometry establish physical asymmetry in fly neural stem cells.</a> Nature Communications. 8 (1), 1383(2017).</li>
<li>Januschke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrobin+controls+mother-daughter+centriole+asymmetry+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Centrobin controls mother-daughter centriole asymmetry in Drosophila neuroblasts.</a> Nature Cell Biology. 15 (3), 241-248 (2013).</li>
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<li>Rebollo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+unequal+centrosomes+drive+spindle+orientation+in+asymmetrically+dividing+Drosophila+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing Drosophila neural stem cells.</a> Developmental Cell. 12 (3), 467-474 (2007).</li>
<li>Januschke, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interphase+microtubule+aster+is+a+determinant+of+asymmetric+division+orientation+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts.</a> The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).</li>
<li>Rusan, N. M., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+a+novel+centrosome+cycle+in+asymmetric+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division.</a> The Journal of Cell Biology. 177 (1), 13-20 (2007).</li>
<li>Lerit, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interphase+centrosome+organization+by+the+PLP-Cnn+scaffold+is+required+for+centrosome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Interphase centrosome organization by the PLP-Cnn scaffold is required for centrosome function.</a> Journal of Cell Biology. 210 (1), 79-97 (2015).</li>
<li>Gallaud, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+centriolar+localization+of+Polo+and+Centrobin+in+early+mitosis+primes+centrosome+asymmetry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic centriolar localization of Polo and Centrobin in early mitosis primes centrosome asymmetry.</a> PLoS Biology. 18 (8), e3000762(2020).</li>
<li>Ramdas Nair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microcephaly-associated+protein+Wdr62%2FCG7337+is+required+to+maintain+centrosome+asymmetry+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The microcephaly-associated protein Wdr62/CG7337 is required to maintain centrosome asymmetry in Drosophila neuroblasts.</a> Cell Reports. 14 (5), 1100-1113 (2016).</li>
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<li>Britton, J. S., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+control+of+the+cell+cycle+in+Drosophila%3A+nutrition+activates+mitotic+and+endoreplicative+cells+by+distinct+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms.</a> Development. 125 (11), 2149-2158 (1998).</li>
<li>Lee, C. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Aurora-A+kinase+inhibits+neuroblast+self-renewal+by+regulating+aPKC%2FNumb+cortical+polarity+and+spindle+orientation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Drosophila Aurora-A kinase inhibits neuroblast self-renewal by regulating aPKC/Numb cortical polarity and spindle orientation.</a> Genes & Development. 20 (24), 3464-3474 (2006).</li>
<li>Homem, C. C. F., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+live+cell+imaging+and+automated+4D+analysis+of+Drosophila+neuroblast+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Long-term live cell imaging and automated 4D analysis of Drosophila neuroblast lineages.</a> PLoS ONE. 8 (11), e79588(2013).</li>
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<li>Karpova, N., Bobinnec, Y., Fouix, S., Huitorel, P., Debec, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jupiter%2C+a+new+Drosophila+protein+associated+with+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motility+and+the+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Jupiter, a new Drosophila protein associated with microtubules.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 63 (5), 301-312 (2006).</li>
<li>Loyer, N., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+last-born+daughter+cell+contributes+to+division+orientation+of+Drosophila+larval+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The last-born daughter cell contributes to division orientation of Drosophila larval neuroblasts.</a> Nature Communications. 9 (1), 3745(2018).</li>
<li>Bostock, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immobilization+technique+for+long-term+time-lapse+imaging+of+explanted+Drosophila+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">An immobilization technique for long-term time-lapse imaging of explanted Drosophila tissues.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 590094(2020).</li>
</ol>

作者无任何财务披露需要声明。

本方案概述了一种对黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）幼虫离体脑组织进行活体成像的方法。在适当的实验条件下，本方案可使离体脑组织保持可观测状态达12至20小时。在样品制备和实验设计过程中需特别注意。如上所述，决定解剖组织质量的最关键因素之一是幼虫的健康状况。为获得尽可能高的组织质量，必须确保在收集前幼虫已充分进食。幼虫健康状况不佳通常源于饲养密度过高。为解决这一问题，应尽量减少密度过高情况，可通过提高收获频率，或将新产卵的培养皿与空培养皿分开放置来实现。
该方案的另一个关键环节是解剖方法，用于分离脑组织。脑组织及其内部的神经母细胞（NBs）对外界因素极为敏感，例如解剖介质的温度以及解剖操作本身的侵入性。过冷的介质容易导致微管解聚。同样，若解剖过程中拉伸或破裂脑组织，将对神经母细胞的质量产生不利影响。为避免此类情况，应避免直接牵拉脑组织，而应将解剖工具固定在表皮或其他组织上进行操作。微型解剖剪在此方面具有显著优势，因其对脑组织的牵拉作用极小。若无解剖剪，可使用镊子小心去除腹神经索与表皮之间的连接组织。
<p class="jove_co...

不对称细胞分裂（ACD）是指RNA、蛋白质和细胞器等亚细胞组分在子细胞之间不均等分配的过程1,2。该过程常见于干细胞，干细胞通过ACD产生具有不同发育命运的子细胞。Drosophila神经母细胞（NBs）进行不对称分裂，产生一个保持干性的NB和一个神经节母细胞（GMC）。GMC进一步分裂，生成分化的神经元或胶质细胞3。在三龄幼虫发育中的大脑中，存在大量进行不对称分裂的NBs，可通过显微镜 readily 观察到。在三龄幼虫阶段，每个中央脑叶中约有100个NBs3,4,5,6。
不对称细胞分裂是一个高度动态的过程。活细胞成像方案已被用于测量和量化细胞极性7,8,9,10、纺锤体定向11,12,13、肌动球蛋白皮层的动态变化14,15,16,17,18、微管和中心体生物学19,20,21,22,23,24,25,26,27，以及膜10,28和染色质动态29。对不对称细胞分裂（ACD）的定性和定量描述依赖于可靠的方法和协议，以在完整活体脑组织中对分裂的神经母细胞（NBs）进行成像。以下方案概述了两种不同封片方法下，准备、解剖和成像三龄幼虫脑组织以进行活体in vivo活细胞成像的技术步骤。这些方法特别适用于关注干细胞分裂时空动态的研究人员，也适用于研究其他脑细胞分裂的过程，因其支持对细胞事件进行短期和长期观察。此外，这些技术对领域内的新手也易于掌握。我们通过表达荧光标记微管和皮层融合蛋白的幼虫脑组织，展示了该方法的有效性和适应性。我们还讨论了分析方法以及在其他研究中应用时需考虑的因素。

<table><tbody><tr><td>0.22 &amp;micro;m 聚醚砜（PES）膜</td><td>Genesee</td><td>25-231</td><td>真空驱动滤器</td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Genesee</td><td>20-248</td><td>颗粒状琼脂</td></tr><tr><td>分析用计算机</td><td>Dell</td><td>NA</td><td>配备两个 3.80 GHz 处理器的 Intel Xeon Gold 5222 CPU，运行 64 位操作系统的 Windows 10</td></tr><tr><td>牛生长血清</td><td>HyClone</td><td>SH30541.02</td><td></td></tr><tr><td>成像用腔室载玻片</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Nikon</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>定制加工金属载片</td><td>NA</td><td>NA</td><td>规格见 Cabernard 和 Doe 2013（参考文献 34）</td></tr><tr><td>解剖培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>5024343</td><td>三孔瓷质微量点板</td></tr><tr><td>解剖镊</td><td>World Precision Instruments</td><td>Dumont #5</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Leica</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>解剖剪</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>胚胎收集笼</td><td>Genesee</td><td>59-100</td><td></td></tr><tr><td>带 CO2 接口的 Flypad，用于麻醉成虫果蝇</td><td>Genesee</td><td>59-172</td><td></td></tr><tr><td>透气膜</td><td>YSI</td><td>98095</td><td>透气膜</td></tr><tr><td>玻璃盖玻片</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72204-03</td><td>#1.5；22 mm × 40 mm 玻璃盖玻片</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Oxford Instruments</td><td>NA</td><td>替代软件：Fiji、Volocity、Aivia</td></tr><tr><td>Imaris 文件转换器</td><td>Oxford Instruments</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>即发干酵母</td><td>Saf-Instant</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>糖蜜</td><td>Genesee</td><td>62-117</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628161</td><td>60 mm × 15 mm 培养皿</td></tr><tr><td>凡士林</td><td>Vaseline</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>含 L-谷氨酰胺和碳酸氢钠的 Schneider 昆虫培养基液体</td><td>Millipore Sigma</td><td>S0146</td><td></td></tr><tr><td>SlideBook 采集软件</td><td>3i</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>带 0.22 &amp;micro;&amp;micro;m PES 膜滤器的真空驱动过滤装置</td><td>Genesee Scientific, GenClone</td><td>25-231</td><td></td></tr></tbody></table>

活细胞成像 黑腹果蝇 三龄幼虫大脑

Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains

果蝇 神经干细胞（以下简称神经母细胞，NBs）进行不对称分裂，一方面自我更新以维持神经母细胞的持续存在，另一方面产生一个正在分化的成神经细胞（ganglion mother cell, GMC），该细胞将再经历一次分裂，生成两个神经元或胶质细胞。对神经母细胞的研究揭示了细胞极性、纺锤体定向、神经干细胞自我更新以及分化过程背后的分子机制。这些不对称细胞分裂易于观察 通过 活细胞成像，使幼虫神经母细胞成为研究活体组织中不对称细胞分裂时空动态的理想模型。当在添加营养成分的培养基中进行适当解剖和成像时，离体脑组织中的神经母细胞可稳定分裂12–20小时。既往报道的方法技术难度较高，对初学者而言可能具有挑战性。本文介绍了一种利用脂肪体补充物制备、解剖、封片及成像活体三龄幼虫脑离体组织的实验方案，并讨论了可能遇到的问题，同时提供了该技术应用的示例。

表达Pins::EGFP和Cherry::Jupiter的中央脑叶神经母细胞的解剖与成像 
为展示本方案，对表达UAS驱动的Cherry::Jupiter13以及内源性标记的Pins::EGFP16（w; worGal4, UAS-cherry::jupiter/CyO; Pins::EGFP/TM6B, Tb）的幼虫，使用多孔成像载玻片并按照所述方案进行为期4小时的成像（图5C、D）。另外，对表达UAS驱动的Cherry::Jupiter13和内源性标记的Miranda::EGFP（w; worGal4, UAS-cherry::Zeus/CyO; UAS-Miranda::GFP/TM6B）的幼虫，使用膜结合型载玻片进行为期10小时的成像，获得补充数据（图5E、F）。...

本文介绍了一种用于制备、解剖、封片和成像活体离体黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）三龄幼虫大脑的工作流程，以在生理条件下观察细胞及亚细胞水平的动态过程。

果蝇神经干细胞（以下简称神经母细胞，NBs）进行不对称分裂，一方面自我更新再生神经母细胞，同时产生一个...

我们的研究聚焦于探讨不对称细胞分裂（ACD）对干细胞增殖与分化的影响。我们采用果蝇神经干细胞（即神经母细胞）作为模型，以深入理解不对称细胞分裂在发育和神经发生过程中的机制、调控方式及其生物学效应。近年来，人工智能技术在图像定量与分析方面取得了重大进展，显著推动了活细胞成像领域的发展。长期成像过程中保持样品质量一直是一项挑战。尽管对样品进行8到10小时的观察具有重要研究价值，但受限于样品的成像需求以及可用的成像工具等实际操作因素，实现这一目标较为困难。本实验方案通过在不损害样品质量的前提下实现长期成像，有效解决了这一难题。我们的技术易于被初学者采纳并应用于实际研究中。经过一段时间的练习，研究人员可以成功制作短期和长期的活体成像视频，这些视频有望提供富有洞察力且具有重要意义的数据。首先，将一至五日龄的雌性处女果蝇与一至七日龄的雄性成年果蝇进行杂交，以获得具有目标基因型的子代。为此，将果蝇放入带有食物帽的果蝇培养笼中。每笼使用10至15只雌性处女蝇与5至10只雄蝇，以获得最佳繁殖产量。将装有果蝇的培养笼置于25°C条件下培养。每天更换食物盖，以防止幼虫过度拥挤，避免影响解剖脑组织的质量。如果食物盖上的幼虫超过30条，应将其分成两半，并将其中一半替换为新鲜的半片食物盖。将带有幼虫的食物盖在25°C条件下培养，直至幼虫达到所需年龄。首先，用移液器将约 400 微升的解剖与成像介质加入三孔解剖培养皿的每个孔中。在显微镜下，用解剖镊子轻轻夹住 10 只喂养良好的野生型幼虫，将其在最下方孔中的解剖介质中反复浸入和取出，以去除所有食物颗粒，完成清洗。在继续于解剖显微镜下操作的同时，将清洁后的幼虫转移至中间孔中。用一对镊子夹住幼虫的口钩。用另一对镊子刺破幼虫体壁的一侧，使脂肪体流出。用镊子尽可能收集每只幼虫的脂肪体，并将其转移至最上方的孔中，该孔内含有400 µL室温的解剖液。首先，用移液器将约 400 微升的解剖与成像介质加入三孔解剖培养皿的每个孔中。在解剖显微镜下操作，用解剖与成像介质清洗实验用幼虫，以去除食物残渣。继续在解剖显微镜下操作，使用一对镊子夹住幼虫的口钩以固定幼虫。用另一把镊子小心地从幼虫后部剪去约三分之一。接着，用一把镊子夹住幼虫的口钩，同时用另一把镊子轻轻将表皮朝口钩方向刷动。在用镊子夹住口钩的同时，同步向内推动，直至整个幼虫完全翻转为内向外的状态。将幼虫翻转，暴露其中枢神经系统及其他组织，同时保持这些组织与体壁的连接。找到中枢神经系统（CNS），以避免意外移除。使用镊子轻轻去除非中枢神经系统的组织，仅保留与体壁相连的中枢神经系统和脑。使用显微解剖剪在脑叶下方轻轻剪切，以切断轴突连接，从而将脑组织从几丁质外壳中释放出来。随后剪断腹神经索下方的连接。将幼虫分批进行解剖，以确保每次解剖时间少于20分钟。将解剖好的脑组织转移至含有解剖与成像介质的孔中。若成像时间超过三小时，需在介质中添加脂肪体。为进行三龄幼虫脑组织的活细胞成像，首先将解剖所得的脑组织及分离的脂肪体收集至三孔解剖皿的最后一个孔内，该孔应含有解剖与成像介质。将透气膜放置在载玻片背面，并将分割环压入膜的中央。使用 200 微升移液器，将最多 10 个解剖出的脑组织（尽可能带有脂肪体）以及 130 至 140 微升培养基转移至膜的中央。根据需要成像的神经干细胞群和显微镜类型调整脑组织的方向，确保样品靠近显微镜物镜。例如，为了对中央脑叶中的神经干细胞进行成像，需确保脑叶最靠近物镜。然后轻轻将玻璃盖玻片覆盖在膜上的溶液中，使含有脑组织和脂肪体的溶液均匀分布在膜上。用实验室纸巾从盖玻片边缘轻轻吸去多余溶液，直至脑组织刚好接触盖玻片且未被压碎。接下来，使用画笔将熔化的石蜡油涂抹在盖玻片边缘以固定盖玻片，并让石蜡油凝固。向多孔载玻片的一个孔中加入 400 µL 成像培养基。将先前解剖得到的脂肪体转移至该孔中。然后将最多10个脑组织置于孔中央附近呈簇状排列。根据需要成像的神经干细胞群体及显微镜类型，调整脑组织的方向。让脑组织在孔中静置2至5分钟。将微载玻片盖上盖玻片后，再转移至显微镜下。使用最低的激光功率和曝光时间开始采集过程，以尽量减少光漂白。利用多孔成像载玻片对表达UAS驱动的樱桃红荧光蛋白标记的Jupiter以及内源性标记GFP的pins的幼虫大脑进行成像，且未添加脂肪体补充物，结果显示，在分裂的神经母细胞中，pins形成明显的顶膜新月形结构，有丝分裂纺锤体在有丝分裂过程中始终与此结构对齐。在这些样本中，随着成像时间的延长，细胞周期长度增加。在膜结合载玻片上使用脂肪体补充培养基成像的样本则未显示出细胞周期长度的增加。此外，在10小时的膜结合载玻片上观察到了经历四次分裂的神经母细胞。

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科研

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发育生物学

黑腹果蝇第三龄幼虫脑的活细胞成像

本文介绍了一种利用活体显微分析结合GFP标记的胶质细胞，研究胶质细胞迁移进入发育中黑腹果蝇（Drosophila）眼部的实验方案。...

活体成像观察果蝇复眼原基盘中胶质细胞的迁移

活体成像 黑腹果蝇 胚胎血细胞迁移

本方案描述了三种黑腹果蝇（Drosophila）样品制备方法：1）成年果蝇脑组织解剖，2）成年果蝇视网膜解剖，以及3）发育中眼盘-脑复合体解剖。重点介绍了适用于活体成像的特殊制备技术和条件，尽管所有样品制备方法也可用于固定组织的免疫组织化学染色。...

发育期与成年个体的制备 果蝇 用于活体成像的大脑与视网膜

Drosophila melanogaster 幼虫为研究幼虫体节神经中轴突运输的机制提供了一个理想的模型系统。通过该实验流程，可将携带各种突变的3rd...

3rd 龄 Drosophila 幼虫制备中幼虫节段神经的可视化

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活体成像的 果蝇 使用荧光显微镜观察蛹眼

本文展示了一种利用快速扫描共聚焦显微镜透过蛹壳直接成像细胞行为的方法。通过保持蛹壳完整，该方法能够在果蝇发育的某一难以直接研究的阶段，实现对动态细胞过程的观察与测量。...

透过黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）蛹壳进行成像

本方案详细描述了一种用于完整幼虫大脑中活细胞成像的简化方法。活细胞成像技术对于研究不对称神经干细胞分裂以及其他神经发生和发育过程具有重要价值，能够持续揭示以往被忽视的机制。...

活体成像 黑腹果蝇 幼虫神经母细胞

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活体成像 果蝇 蛹期复眼

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单细胞分辨率荧光活体成像 果蝇 幼虫脑组织培养中的生物钟

本文提供了一种详细的实验方案，用于对Drosophila卵巢微环境中生殖系干细胞（GSCs）的不对称分裂进行活体成像。我们使用了一种转基因品系，该品系普遍表达一种绿色荧光蛋白（GFP）与谱斑体蛋白Par-1的融合蛋白。...

延长活体成像果蝇雌性Drosophila melanogaster生殖系干细胞微环境

我们介绍了利用表面组织粘合剂固定样品，对Drosophila幼虫嗅觉神经元进行钙成像的实验方案。该方法提高了实验稳定性，有助于开展可靠的活体（in-vivo）和离体（ex-vivo）实验。通过定制的R语言脚本分析钙信号，为深入的神经生理学研究提供了高效平台。...

体内与离体条件下对三龄Drosophila melanogaster幼虫嗅觉环路神经元的钙成像

学习黑腹果蝇第三龄幼虫脑的活细胞成像技术，用于研究神经干细胞不对称分裂的动态过程。本方法支持长期成像并保持样本质量，为发育神经生物学提供重要工具。

活细胞成像黑腹果蝇三龄幼虫大脑

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