活细胞成像 黑腹果蝇 三龄幼虫大脑

我们的研究聚焦于探讨不对称细胞分裂（ACD）对干细胞增殖与分化的影响。我们采用果蝇神经干细胞（即神经母细胞）作为模型，以深入理解不对称细胞分裂在发育和神经发生过程中的机制、调控方式及其生物学效应。近年来，人工智能技术在图像定量与分析方面取得了重大进展，显著推动了活细胞成像领域的发展。

长期成像过程中保持样品质量一直是一项挑战。尽管对样品进行8到10小时的观察具有重要研究价值，但受限于样品的成像需求以及可用的成像工具等实际操作因素，实现这一目标较为困难。本实验方案通过在不损害样品质量的前提下实现长期成像，有效解决了这一难题。

我们的技术易于被初学者采纳并应用于实际研究中。经过一段时间的练习，研究人员可以成功制作短期和长期的活体成像视频，这些视频有望提供富有洞察力且具有重要意义的数据。首先，将一至五日龄的雌性处女果蝇与一至七日龄的雄性成年果蝇进行杂交，以获得具有目标基因型的子代。

为此，将果蝇放入带有食物帽的果蝇培养笼中。每笼使用10至15只雌性处女蝇与5至10只雄蝇，以获得最佳繁殖产量。将装有果蝇的培养笼置于25°C条件下培养。

每天更换食物盖，以防止幼虫过度拥挤，避免影响解剖脑组织的质量。如果食物盖上的幼虫超过30条，应将其分成两半，并将其中一半替换为新鲜的半片食物盖。将带有幼虫的食物盖在25°C条件下培养，直至幼虫达到所需年龄。

首先，用移液器将约 400 微升的解剖与成像介质加入三孔解剖培养皿的每个孔中。在显微镜下，用解剖镊子轻轻夹住 10 只喂养良好的野生型幼虫，将其在最下方孔中的解剖介质中反复浸入和取出，以去除所有食物颗粒，完成清洗。在继续于解剖显微镜下操作的同时，将清洁后的幼虫转移至中间孔中。

用一对镊子夹住幼虫的口钩。用另一对镊子刺破幼虫体壁的一侧，使脂肪体流出。用镊子尽可能收集每只幼虫的脂肪体，并将其转移至最上方的孔中，该孔内含有400 µL室温的解剖液。

首先，用移液器将约 400 微升的解剖与成像介质加入三孔解剖培养皿的每个孔中。在解剖显微镜下操作，用解剖与成像介质清洗实验用幼虫，以去除食物残渣。继续在解剖显微镜下操作，使用一对镊子夹住幼虫的口钩以固定幼虫。

用另一把镊子小心地从幼虫后部剪去约三分之一。接着，用一把镊子夹住幼虫的口钩，同时用另一把镊子轻轻将表皮朝口钩方向刷动。在用镊子夹住口钩的同时，同步向内推动，直至整个幼虫完全翻转为内向外的状态。

将幼虫翻转，暴露其中枢神经系统及其他组织，同时保持这些组织与体壁的连接。找到中枢神经系统（CNS），以避免意外移除。使用镊子轻轻去除非中枢神经系统的组织，仅保留与体壁相连的中枢神经系统和脑。

使用显微解剖剪在脑叶下方轻轻剪切，以切断轴突连接，从而将脑组织从几丁质外壳中释放出来。随后剪断腹神经索下方的连接。将幼虫分批进行解剖，以确保每次解剖时间少于20分钟。

将解剖好的脑组织转移至含有解剖与成像介质的孔中。若成像时间超过三小时，需在介质中添加脂肪体。为进行三龄幼虫脑组织的活细胞成像，首先将解剖所得的脑组织及分离的脂肪体收集至三孔解剖皿的最后一个孔内，该孔应含有解剖与成像介质。

将透气膜放置在载玻片背面，并将分割环压入膜的中央。使用 200 微升移液器，将最多 10 个解剖出的脑组织（尽可能带有脂肪体）以及 130 至 140 微升培养基转移至膜的中央。根据需要成像的神经干细胞群和显微镜类型调整脑组织的方向，确保样品靠近显微镜物镜。

例如，为了对中央脑叶中的神经干细胞进行成像，需确保脑叶最靠近物镜。然后轻轻将玻璃盖玻片覆盖在膜上的溶液中，使含有脑组织和脂肪体的溶液均匀分布在膜上。用实验室纸巾从盖玻片边缘轻轻吸去多余溶液，直至脑组织刚好接触盖玻片且未被压碎。

接下来，使用画笔将熔化的石蜡油涂抹在盖玻片边缘以固定盖玻片，并让石蜡油凝固。向多孔载玻片的一个孔中加入 400 µL 成像培养基。将先前解剖得到的脂肪体转移至该孔中。

然后将最多10个脑组织置于孔中央附近呈簇状排列。根据需要成像的神经干细胞群体及显微镜类型，调整脑组织的方向。让脑组织在孔中静置2至5分钟。

将微载玻片盖上盖玻片后，再转移至显微镜下。使用最低的激光功率和曝光时间开始采集过程，以尽量减少光漂白。利用多孔成像载玻片对表达UAS驱动的樱桃红荧光蛋白标记的Jupiter以及内源性标记GFP的pins的幼虫大脑进行成像，且未添加脂肪体补充物，结果显示，在分裂的神经母细胞中，pins形成明显的顶膜新月形结构，有丝分裂纺锤体在有丝分裂过程中始终与此结构对齐。

在这些样本中，随着成像时间的延长，细胞周期长度增加。在膜结合载玻片上使用脂肪体补充培养基成像的样本则未显示出细胞周期长度的增加。此外，在10小时的膜结合载玻片上观察到了经历四次分裂的神经母细胞。