Name: 使用富集微球与有限消化相结合的宿主细胞蛋白分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-19T12:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 学习使用蛋白质富集微球与有限消化相结合的方法检测生物制药产品中的低丰度宿主细胞蛋白。该方法通过液相色谱-质谱联用技术显著提高检测灵敏度，有效降低抗体与宿主细胞蛋白之间的动态范围差异，为单克隆抗体药物的质量控制提供可靠分析方案。

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本方案中使用的缩写词见补充表1。
1. 溶液与缓冲液的配制
注意：所有试剂的商业信息均列在材料表中。
<ol>
	<li>在玻璃小瓶中，将 1 mL 的 1 M Tris-HCl（pH 8.0）加入 9 mL 去离子水中，通过涡旋充分混匀，配制 0.1 M Tris-HCl（pH 8.0）溶液。4 °C 保存，可存放长达 3 个月。</li>
	<li>将 10 mg 脱氧胆酸钠（SDC）溶于 1 mL 0.1 M Tris-HCl（pH 8.0）中，配制 24 mM 脱氧胆酸钠（SDC）溶液。</li>
	<li>将 7 mg 月桂酰基肌氨酸钠（SLS）溶于 1 mL 0.1 M Tris-HCl（pH 8.0）中，配制 24 mM 月桂酰基肌氨酸钠（SLS）溶液。</li>
	<li>按 1:1（v/v）比例混合 24 mM SDC 和 24 mM SLS，配制洗脱缓冲液。</li>
	<li>将 20 µg 胰蛋白酶加入 400 µL 去离子水中，配制 50 ng/µL 的胰蛋白酶溶液。</li>
	<li>将 7.7 mg 二硫苏糖醇（DTT）溶于 308 µL 0.1 M Tris-HCl（pH 8.0）中，配制 25 mg/mL 二硫苏糖醇（DTT）溶液。</li>
	<li>将 56 mg 碘乙酰胺（IAM）溶于 1.2 mL 0.1 M Tris-HCl（pH 8.0）中，配制 0.25 M 碘乙酰胺（IAM）溶液。</li>
	<li>将 1 mL 三氟乙酸（TFA）加入 9 mL 去离子水中，配制 10% TFA 溶液。涡旋 4 秒后离心。4 °C 保存，可存放长达 3 个月。</li>
	<li>将 1 mL 10% TFA 加入 99 mL 去离子水中，配制缓冲液 A。</li>
	<li>将 1 mL 10% TFA 和 49 mL 去离子水加入 50 mL 乙腈（ACN）中，配制缓冲液 B。</li>
	<li>将 37 mg L-组氨酸和 54.8 mg L-组氨酸盐酸盐一水合物溶于 50 mL 水中，配制 10 mM 组氨酸缓冲液。</li>
</ol>
2. 单克隆抗体（mAb）溶液的制备
<ol>
	<li>对于浓度高于 50 mg/mL 的药物产品，取 15 mg 单克隆抗体（mAb）（参见材料表），用去离子水在 2 mL 微量离心管中稀释，总体积为 300 µL，最终 pH 值约为 6。如有必要，使用乙酸或 Tris-HCl 调节 pH 值。</li>
	<li>对于浓度低于 50 mg/mL 的药物产品，按步骤 2.2.1 至 2.2.5 进行缓冲液置换。
	<ol>
		<li>将每份样品 20 mg 转移至 10k 离心过滤装置（参见材料表），在室温（RT）下以 14,000 × g 离心 25 分钟，直至剩余体积约为 100 µL。</li>
		<li>向滤膜中加入 350 µL 10 mM 组氨酸（参见材料表），pH 6.0 缓冲液，涡旋混匀，然后在室温下以 14,000 × g 离心 25 分钟。重复一次。</li>
		<li>将滤膜倒置并放入样品收集管中，在室温下以 1000 × g 离心 5 分钟，以回收收集管中的全部体积。用 200 µL 10 mM&#160;组氨酸缓冲液冲洗滤膜，并反复吹打以回收残留的蛋白样品。将全部溶液转移至同一收集管中，涡旋混匀后短暂离心。</li>
		<li>使用 NanoDrop 测定样品浓度。在与富集微珠孵育前，通过添加组氨酸缓冲液将各蛋白样品的浓度调整至 50 mg/mL。</li>
		<li>将 300 µL 样品转移至 2 mL 微量离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 蛋白质组富集磁珠的制备
<ol>
	<li>从商业蛋白质富集试剂盒中获取的每个离心柱上取下顶部和底部盖帽（参见 材料表不要丢弃瓶盖，因为后续步骤中会用到。</li>
	<li>将离心柱置于一个无盖的2 mL 微离心管中。在室温下以1,000 x g离心该装置 g 在室温下孵育30-60秒，以去除保存液。弃去此步骤中收集的材料。</li>
	<li>向市售富集珠中加入 200 µL 洗涤缓冲液（参见 材料表）并上下吹打数次。将离心柱放入一个 2 mL 微量离心管中，在 1,000 x g 在室温下孵育30-60秒以去除缓冲液。弃去收集的液体。 
	注意：洗涤缓冲液包含在商用蛋白质富集试剂盒中。</li>
	<li>重复步骤 3.3 两次。</li>
	<li>更换底部盖帽，加入 200 µL 水，然后更换顶部盖帽。</li>
</ol>
4. 蛋白质富集
<ol>
	<li>将步骤 3.5 中的浆液上下吹打混匀，取 40 µL 转移至步骤 2 中制备的样品中。室温孵育并旋转离心管 2 小时。</li>
	<li>使用 16 G 针头在滤芯尖端（见材料表）上制作合适尺寸的滤芯，然后将其插入 200 µL 吸头的尖端。</li>
	<li>将含有磁珠的样品转移至步骤 4.2 中制备的吸头中。将该吸头放入 2 mL 微量离心管中，于室温下以 200 × g 离心 3 分钟，去除溶液。</li>
	<li>向吸头中加入 200 µL 洗涤缓冲液洗涤磁珠，将吸头与 2 mL 微量离心管一起于室温下以 200 × g 离心 2 分钟，去除洗涤液。重复此步骤两次。</li>
	<li>向吸头中加入 200 µL 水洗涤磁珠，将吸头与 2 mL 微量离心管一起于室温下以 200 × g 离心 2 分钟，去除水分。</li>
	<li>向吸头中加入 10 µL 洗脱缓冲液（步骤 1.4），在吸头内将浆液吹打 10 次，确保磁珠充分浸润于洗脱缓冲液中，以实现蛋白的洗脱。</li>
	<li>将吸头与新的 0.5 mL 微量离心管一起于室温下以 200 × g 离心 30 秒，收集洗脱液。重复步骤 4.6–4.7 两次，并将所有洗脱液合并至同一个 0.5 mL 微量离心管中。</li>
	<li>向洗脱液中加入 1.5 µL 胰蛋白酶溶液（步骤 1.5），于 28 °C 过夜消化。再加入 1.5 µL 25 mg/mL 的 DTT（步骤 1.6），将样品于 90 °C 加热 20 分钟。</li>
	<li>加入 1.5 µL 0.25 M IAM（步骤 1.7），室温避光孵育 20 分钟。加入 3.5 µL 10% TFA（步骤 1.8），涡旋 2 分钟，确保溶液 pH 值约为 2–3。</li>
	<li>于室温下以 14,400 × g 离心 10 分钟，使 SDC 和 SLS 沉淀。收集上清液用于脱盐处理。</li>
	<li>按以下步骤进行脱盐：
	<ol>
		<li>向 GC 脱盐吸头（见材料表）中加入 50 µL 缓冲液 B（步骤 1.10）。将吸头与支架一起于室温下以 1000 × g 离心 3 分钟。弃去收集的液体。</li>
		<li>向吸头中加入 50 µL 缓冲液 A（步骤 1.9）。将吸头与支架一起于室温下以 1000 × g 离心 3 分钟。弃去收集的液体。</li>
		<li>将酸化后的样品加入吸头中。将吸头与支架一起于室温下以 500 × g 离心 6 分钟。弃去收集的液体。</li>
		<li>向吸头中加入 50 µL 缓冲液 A 洗涤吸头。将吸头与支架一起于室温下以 500 × g 离心 3 分钟。弃去收集的液体。重复一次。</li>
		<li>向 GC 脱盐吸头中加入 50 µL 缓冲液 B，洗脱肽段。将吸头与新的离心管一起于室温下以 500 × g 离心 3 分钟，收集洗脱液。重复一次，并将两次洗脱液合并。</li>
		<li>使用真空浓缩仪（见材料表）将洗脱液干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将干燥后的洗脱液重悬于 30 µL 0.1% 甲酸（FA）溶液中。</li>
	<li>使用分光光度计（见材料表）测定肽段混合物在 214 nm 处的紫外吸收值。肽段混合物的浓度应在 0.1 至 0.5 mg/mL 之间。</li>
	<li>将每份消化后的样品各取 10 µL 转移至 LC 样品瓶中，每份进样 1 µg 至纳米液相色谱-质谱联用系统（nano LC-MS/MS，见材料表）。按步骤 5 进行分析。其余消化后的样品储存于 -80 °C 冰箱中。</li>
</ol>
5. 纳升液相色谱-串联质谱分析
<ol>
	<li>将肽混合物注入与质谱仪联用的纳米液相色谱系统。将肽混合物（约 1 µg）以表 1A提供的梯度载入C18捕获柱进行脱盐，随后在40 °C下载入C18分析柱进行分离。 
	注：流动相A缓冲液为含0.1%甲酸的超纯水，流动相B为含0.1%甲酸的80%乙腈。</li>
	<li>以250 nL/min的流速，按照表 1B提供的梯度分离并洗脱肽段。 
	&#8203;注：质谱仪以数据依赖采集模式（DDA）运行，循环时间为3 s。离子在每次完整的MS扫描后通过高能碰撞解离（HCD）发生碎裂，归一化碰撞能量为30%。一级质谱扫描分辨率为60,000，自动增益控制（AGC）目标值为3e6，最大注入时间为20 ms，m/z扫描范围为380–1600。二级质谱（MS/MS）事件分辨率为15,000，AGC目标值为1e5，最大注入时间为60 ms，m/z扫描范围为200–2000。动态排除时间为45 s。离子源参数详见表 1C，具体的质谱参数见表 2A–F。</li>
</ol>
6. 数据分析
<ol>
	<li>将 NISTmAb 质谱原始文件在 UniProt mus+musculus 数据库中进行搜索29。此外，将添加了重组蛋白的 mAb DS 质谱原始文件在 UniProt Cricetulus Griseus 数据库中进行搜索30。 
	注意：这些搜索使用 Proteome Discoverer 软件（见材料表）中的 Sequest HT 和 Mascot 搜索引擎完成。所用数据库不含冗余条目。</li>
	<li>在质谱搜索中，设定母离子质量容差为 10 ppm，碎片离子质量容差为 0.02 Da。 
	注意：搜索参数包括半胱氨酸残基的稳定型羧甲基化修饰（+57.0214 Da）以及甲硫氨酸残基的可变氧化修饰（+15.9949 Da）。此外，还设置了天冬酰胺/谷氨酰胺的可变脱氨修饰（+0.984 Da）。</li>
	<li>采用胰蛋白酶消化方式进行数据库搜索，允许最多两个漏切位点。将蛋白质和肽段的错误发现率均设定为 0.01。 
	注意：为确证宿主细胞蛋白（HCPs）的鉴定，要求至少包含两个唯一肽段。表 3 提供了通过 Proteome Discoverer 软件分析 NIST mAb 所鉴定出的 HCPs 的代表性汇总信息。</li>
</ol>

Enrichment of Host Cell Proteins in Monoclonal Antibody Drug Products

<ol><li>Aboulaich, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+to+monitor+clearance+of+host+cell+proteins+associated+with+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">A novel approach to monitor clearance of host cell proteins associated with monoclonal antibodies.</a> Biotechnology Progress. 30 (5), 1114-1124 (2014).</li>
<li>Goey, C. H., Alhuthali, S., Kontoravdi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+cell+protein+removal+from+biopharmaceutical+preparations%3A+Towards+the+implementation+of+quality+by+design%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Host cell protein removal from biopharmaceutical preparations: Towards the implementation of quality by design.</a> Biotechnology Advances. 36 (4), 1223-1237 (2018).</li>
<li>Levy, N. E., Valente, K. N., Choe, L. H., Lee, K. H., Lenhoff, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+host+cell+protein+product-associated+impurities+in+monoclonal+antibody+bioprocessing%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of host cell protein product-associated impurities in monoclonal antibody bioprocessing.</a> Biotechnology and Bioengineering. 111 (5), 904-912 (2014).</li>
<li>Molden, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+cell+protein+profiling+of+commercial+therapeutic+protein+drugs+as+a+benchmark+for+monoclonal+antibody-based+therapeutic+protein+development%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Host cell protein profiling of commercial therapeutic protein drugs as a benchmark for monoclonal antibody-based therapeutic protein development.</a> MAbs. 13 (1), 1955811(2021).</li>
<li>Bee, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trace+levels+of+the+CHO+host+cell+protease+cathepsin+D+caused+particle+formation+in+a+monoclonal+antibody+product%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Trace levels of the CHO host cell protease cathepsin D caused particle formation in a monoclonal antibody product.</a> Biotechnology Progress. 31 (5), 1360-1369 (2015).</li>
<li>Bracewell, D. G., Francis, R., Smales, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+host+cell+protein+%28HCP%29+identification+during+process+development+and+manufacturing+linked+to+a+risk-based+management+for+their+control%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">The future of host cell protein (HCP) identification during process development and manufacturing linked to a risk-based management for their control.</a> Biotechnology and Bioengineering. 112 (9), 1727-1737 (2015).</li>
<li>Chiu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockout+of+a+difficult-to-remove+CHO+host+cell+protein%2C+lipoprotein+lipase%2C+for+improved+polysorbate+stability+in+monoclonal+antibody+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Knockout of a difficult-to-remove CHO host cell protein, lipoprotein lipase, for improved polysorbate stability in monoclonal antibody formulations.</a> Biotechnology and Bioengineering. 114 (5), 1006-1015 (2017).</li>
<li>Gilgunn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+tracking+of+problematic+host+cell+proteins+removed+by+a+synthetic%2C+highly+functionalized+nonwoven+media+in+downstream+bioprocessing+of+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Identification and tracking of problematic host cell proteins removed by a synthetic, highly functionalized nonwoven media in downstream bioprocessing of monoclonal antibodies.</a> Journal of Chromatography A. 1595, 28-38 (2019).</li>
<li>Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+polysorbate-degrading+enzymes+in+a+monoclonal+antibody+formulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of polysorbate-degrading enzymes in a monoclonal antibody formulation.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (11), 3558-3567 (2021).</li>
<li>Hall, T., Sandefur, S. L., Frye, C. C., Tuley, T. L., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysorbates+20+and+80+degradation+by+group+XV+lysosomal+phospholipase+A2+isomer+X1+in+monoclonal+antibody+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Polysorbates 20 and 80 degradation by group XV lysosomal phospholipase A2 isomer X1 in monoclonal antibody formulations.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 105 (5), 1633-1642 (2016).</li>
<li>Jones, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((34%3BHigh-risk%26%2334%3B+host+cell+proteins+%28HCPs%29%3A+A+multi-company+collaborative+view%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">34;High-risk&#34; host cell proteins (HCPs): A multi-company collaborative view.</a> Biotechnology and Bioengineering. 118 (8), 2870-2885 (2021).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+residual+host+cell+protein+hexosaminidase+B+associated+with+N-glycan+degradation+during+the+stability+study+of+a+therapeutic+recombinant+monoclonal+antibody+product%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a residual host cell protein hexosaminidase B associated with N-glycan degradation during the stability study of a therapeutic recombinant monoclonal antibody product.</a> Biotechnology Progress. 37 (3), e3128(2021).</li>
<li>Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+specific+causes+of+polysorbate+20+degradation+in+monoclonal+antibody+formulations+containing+multiple+lipases%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of the specific causes of polysorbate 20 degradation in monoclonal antibody formulations containing multiple lipases.</a> Pharmaceutical Research. 39 (1), 75-87 (2022).</li>
<li>Zhang, S., Xiao, H., Li, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+of+polysorbate+20+by+Sialate+O-Acetylesterase+in+monoclonal+antibody+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Degradation of polysorbate 20 by Sialate O-Acetylesterase in monoclonal antibody formulations.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (12), 3866-3873 (2021).</li>
<li>Zhang, S., Xiao, H., Molden, R., Qiu, H., Li, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+polysorbate+80+degradation+by+liver+carboxylesterase+in+a+monoclonal+antibody+formulated+drug+substance+at+early+stage+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Rapid polysorbate 80 degradation by liver carboxylesterase in a monoclonal antibody formulated drug substance at early stage development.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (11), 3300-3307 (2020).</li>
<li>Gunawan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+platform+host+cell+protein+ELISA+to+process-specific+host+cell+protein+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Comparison of platform host cell protein ELISA to process-specific host cell protein ELISA.</a> Biotechnology and Bioengineering. 115 (2), 382-389 (2018).</li>
<li>Chen, I. H., Xiao, H., Daly, T., Li, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+host+cell+protein+analysis+in+monoclonal+antibody+products+through+molecular+weight+cutoff+enrichment%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through molecular weight cutoff enrichment.</a> Analytical Chemistry. 92 (5), 3751-3757 (2020).</li>
<li>Chen, I. H., Xiao, H., Li, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+host+cell+protein+analysis+in+monoclonal+antibody+products+through+ProteoMiner%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through ProteoMiner.</a> Analytical Biochemistry. 610, 113972(2020).</li>
<li>Doneanu, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+detection+of+low-abundance+host+cell+protein+impurities+in+high-purity+monoclonal+antibodies+down+to+1+ppm+using+ion+mobility+mass+spectrometry+coupled+with+multidimensional+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Enhanced detection of low-abundance host cell protein impurities in high-purity monoclonal antibodies down to 1 ppm using ion mobility mass spectrometry coupled with multidimensional liquid chromatography.</a> Analytical Chemistry. 87 (20), 10283-10291 (2015).</li>
<li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+sample+preparation+for+shotgun+proteomics+characterization+of+HCPs+in+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A Novel sample preparation for shotgun proteomics characterization of HCPs in antibodies.</a> Analytical Chemistry. 89 (10), 5436-5444 (2017).</li>
<li>Johnson, R. O., Greer, T., Cejkov, M., Zheng, X., Li, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+FAIMS%2C+Protein+A+depletion%2C+and+native+digest+conditions+enables+deep+proteomic+profiling+of+host+cell+proteins+in+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Combination of FAIMS, Protein A depletion, and native digest conditions enables deep proteomic profiling of host cell proteins in monoclonal antibodies.</a> Analytical Chemistry. 92 (15), 10478-10484 (2020).</li>
<li>Kreimer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+cell+protein+profiling+by+targeted+and+untargeted+analysis+of+data+independent+acquisition+mass+spectrometry+data+with+parallel+reaction+monitoring+verification%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Host cell protein profiling by targeted and untargeted analysis of data independent acquisition mass spectrometry data with parallel reaction monitoring verification.</a> Analytical Chemistry. 89 (10), 5294-5302 (2017).</li>
<li>Madsen, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+complete+characterization+of+host+cell+proteins+in+biotherapeutics+via+affinity+depletions%2C+LC-MS%2FMS%2C+and+multivariate+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Toward the complete characterization of host cell proteins in biotherapeutics via affinity depletions, LC-MS/MS, and multivariate analysis.</a> MAbs. 7 (6), 1128-1137 (2015).</li>
<li>Nie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+sensitive+method+for+deep+profiling+of+host+cell+proteins+in+therapeutic+antibodies+by+combining+ultra-low+trypsin+concentration+digestion%2C+long+chromatographic+gradients%2C+and+boxcar+mass+spectrometry+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Simple and sensitive method for deep profiling of host cell proteins in therapeutic antibodies by combining ultra-low trypsin concentration digestion, long chromatographic gradients, and boxcar mass spectrometry acquisition.</a> Analytical Chemistry. 93 (10), 4383-4390 (2021).</li>
<li>Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+LC-MS-Based+workflow+with+robust+0.1+ppm+sensitivity+for+identifying+residual+HCPs+in+biotherapeutic+products%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Versatile LC-MS-Based workflow with robust 0.1 ppm sensitivity for identifying residual HCPs in biotherapeutic products.</a> Analytical Chemistry. 94 (2), 723-731 (2022).</li>
<li>Zhang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+tracking+of+host+cell+proteins+during+monoclonal+antibody+purifications+using+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Comprehensive tracking of host cell proteins during monoclonal antibody purifications using mass spectrometry.</a> MAbs. 6 (3), 659-670 (2014).</li>
<li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putative+phospholipase+B-Like+2+is+not+responsible+for+polysorbate+degradation+in+monoclonal+antibody+drug+products%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Putative phospholipase B-Like 2 is not responsible for polysorbate degradation in monoclonal antibody drug products.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (9), 2710-2718 (2020).</li>
<li>Zhang, J., He, J., Smith, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acids+can+induce+the+formation+of+proteinaceous+particles+in+monoclonal+antibody+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Fatty acids can induce the formation of proteinaceous particles in monoclonal antibody formulations.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 111 (3), 655-662 (2022).</li>
<li>Uniprot1. , https://www.uniprot.org/uniprotkb?query=mus%2Bmusculus (2023).</li>
<li>Uniprot2. , https://www.uniprot.org/uniprotkb (2023).</li>
</ol>

作者无竞争性财务利益。

市售的蛋白富集磁珠有两种规格：一种为较小载量，另一种为较大载量（见材料表）。两种规格的富集磁珠每包装均包含十个预装柱。制造商说明书建议，小载量试剂盒中的每个预装柱可用于富集10 mg总蛋白。然而，为实现从原液（DS）中对宿主细胞蛋白（HCP）的最佳富集效果，每个预装柱适用于五个DS样品。因此，每个试剂盒可用于五十个样品的HCP富集。对于大载量试剂盒中的每个预装柱，可适用于二十五个DS样品的HCP富集，从而使总共两百五十个样品的HCP检测成为可能。
步骤 3.1 建议不要丢弃顶部或底部盖帽，因为它们将在整个实验方案中重复使用。如果磁珠沉积在顶部盖帽中，在移除底部塞子后，保持顶部盖帽仍连接在层析柱上，进行离心，并在之后更换磁珠。若要将底部盖帽用作塞子，可将其倒置并牢固地置于离心柱底部。
该实验流程中的一个关键步骤是步骤 4.1，此时磁珠悬液会沉降到管底。因此，在将悬液转移至单克隆抗体（mAb）样品时，必须持续上下吹打以保持悬液均匀。另一个关键步骤是步骤 4.6，在此步骤中，当磁珠已被洗脱缓冲液充分饱和时，必须在吸头内对悬液进行十次吹打。步骤 4.3–4.5、4.7 和 4.10 中的离心时间可能因积累的宿主细胞蛋白（HCPs）量不同而有所变化。因此，在进入下一步之前，必须检查并确保吸头内的液体已充分离心沉降。此外，当起始抗体药物产物量为 15 mg 时，大约可洗脱出 30 µg 抗体及富集的宿主细胞蛋白（HCPs）。为实现有限消化所需的 400:1 蛋白酶比例，需加入 75 ng 胰蛋白酶。当输入材料量较少时，必须测定洗脱蛋白样品的浓度，以便据此调整所需加入的胰蛋白酶量。步骤 4.9 在加入 10% 三氟乙酸（TFA）后会出现白色沉淀。为避免表面活性剂对质谱信号产生干扰，加入三氟乙酸（TFA）后必须检测 pH，以确保从上清液中完全去除去污剂。
在将洗脱液干燥并用水重悬后，必须对肽混合物进行紫外检测。该检测至关重要，因为上样到色谱柱的肽量可能影响质谱检测结果。经评估发现，约 1 µg 的肽混合物在质谱分析中表现最佳。因此，需将此最佳用量注入纳米液相色谱-串联质谱（nano LC-MS/MS）中进行后续分析。
PMLD 方法在样品制备中具有多项优势，包括能够充分降低单克隆抗体（mAb）药物物质中的干扰，同时保留大多数低丰度的宿主细胞蛋白（HCP）。与免疫沉淀（IP）不同，该技术不依赖于抗 HCP 抗体，从而避免了预定义抗体带来的偏差，并减少了制备抗 HCP 抗体所需的人力和时间。此外，与基于分子量截断的过滤方法17不同，PMLD 可不受蛋白大小限制地富集 HCP。该方法可应用于从多种药物模块（如抗体、融合蛋白、ScFv 等）中富集 HCP，相较于 Protein A 缺失方法具有更广泛的适用性21。
除了这些优势之外，PMLD 具有更低的检测限，并且与其它方法相比，能够从经过广泛表征的参考标准物质 NISTmAb 中检测出更多种类的宿主细胞蛋白（HCP）。然而需要注意的是，PMLD 需要使用自制设备，这限制了其在自动化中的应用。为了提高其可用性，可以将某些设备（例如带烧结头的移液枪头）替换为 commercially available alternatives。此外，若在 96 孔板上进行脱盐处理，则可利用该方法实现更高的通量。在未来实验中探索自动化或半自动化操作，是拓展 PMLD 广泛应用的合理下一步。

宿主细胞蛋白（HCP）是从宿主生物体的细胞培养物中释放出的杂质，并在单克隆抗体（mAb）纯化过程中与其共同纯化1,2,3,4。痕量水平的HCP可能对药品质量产生不利影响5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15，因此需要一种灵敏的HCP分析方法，以检测十亿分之一（sub-ppm）至百万分之一（ppm）水平的HCP。
可采用正交方法检测低丰度的宿主细胞蛋白（HCP）。酶联免疫吸附测定法（ELISA）通常用于定量总体HCP，若存在相应的抗体，也可用于检测和定量单个HCP16。然而，制备特异性针对HCP的抗体耗时且劳动密集。相比之下，液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）可提供单个HCP在单克隆抗体药物产品中的全面信息，已广泛应用于HCP的鉴定4,7,9,10,12,13,14,15,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27。
已开发出多种采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）检测宿主细胞蛋白（HCPs）的方法，包括有限消化20、过滤17、蛋白A去除21、免疫沉淀（IP）以及ProteoMiner富集（PM）18。大多数方法旨在LC-MS/MS分析前减少单克隆抗体（mAb）的含量并富集HCPs，从而降低mAb肽段与HCP肽段之间的动态范围。本方案介绍了一种蛋白组学样品富集方法，结合了ProteoMiner技术与有限消化（PMLD）28。ProteoMiner富集的原理是利用市售的蛋白组富集微珠，其上含有多种组合肽配体的文库。这些配体可特异性结合抗体-药物产品中的蛋白质，从而在去除过量分子的同时，将低丰度的宿主细胞蛋白（HCPs）浓缩在其相应的亲和配体上。另一方面，有限消化的原理是使用低浓度的胰蛋白酶，该浓度足以消化低丰度的HCPs，但不足以完全消化所有的抗体-药物产品。该策略可实现从溶液中回收并富集已消化的HCP肽段。
与过滤方法相比，PMLD 技术不受待检测 HCPs 尺寸的限制17。蛋白 A 缺失法仅适用于检测与抗体相关的 HCPs21，而免疫沉淀法则仅限于特定细胞系（如中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系）中预先定义的 HCPs，且需针对该细胞系制备抗 HCP 抗体4。相比之下，PMLD 可用于检测来自任何药物模块以及与不同细胞系来源药物产品共纯化的宿主细胞蛋白中的 HCPs。此外，与上述方法相比，PMLD 具有更高的灵敏度17,18,20,21,24。
该方法可将HCP浓度富集7000倍，并将检测限降低至0.002 ppm28。实验装置如图1所示。

<table><tbody><tr><td>16 G，金属接头针头，2 英寸，3 型针尖</td><td>Hamilton</td><td>91016</td><td></td></tr><tr><td>Acclaim PepMap 100 C18 捕获柱（20 cm &amp;times; 0.075 mm）</td><td>Thermo Fisher</td><td>164535</td><td></td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Fisher-Scientific</td><td>A955</td><td></td></tr><tr><td>含 0.1% 甲酸（v/v）的乙腈，Optima LC/MS 级&amp;nbsp;</td><td>Fisher-Scientific</td><td>LS120-4</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0.5 离心过滤单元</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC5010</td><td></td></tr><tr><td>C18 分析柱（0.075 mm &amp;times; 1.7 &amp;mu;m &amp;times; 30 cm，100 &amp;Aring;）</td><td>CoAnn Technologies</td><td>HEB07503001718I</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5424 离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5405000646</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>A39255</td><td></td></tr><tr><td>SPE 小柱筛板，9.5 mm，3 mL，100 个/包</td><td>Agilent</td><td>12131020</td><td></td></tr><tr><td>GL-Tip GC</td><td>GL Sciences Inc&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>7820-11201</td><td></td></tr><tr><td>自研单克隆抗体（in-house mAb）</td><td>Regeneron</td><td></td><td>浓度 200 mg/mL</td></tr><tr><td>碘乙酰胺（30 × 9.3 mg）</td><td>Thermo Fisher</td><td>A39271</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Fisher-Scientific</td><td>149320025</td><td></td></tr><tr><td>L-组氨酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H6034</td><td></td></tr><tr><td>盐酸组氨酸一水合物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>53370</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher-Scientific</td><td>A456-4&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q 超纯水系统</td><td>Millpore</td><td>30035</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 核酸蛋白浓度测定仪</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Exploris 480 质谱仪</td><td>Thermo Fisher</td><td>BRE725539</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind 0.5 mL 离心管</td><td>Eppendorf (VWR)</td><td>22431064</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind 2.0 mL 离心管</td><td>Eppendorf (VWR)</td><td>22431102</td><td></td></tr><tr><td>Proteome Discoverer 软件 2.4 版</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ProteoMiner 蛋白富集大容量试剂盒</td><td>Bio-Rad</td><td>1633007</td><td></td></tr><tr><td>ProteoMiner 蛋白富集小容量试剂盒</td><td>Bio-Rad</td><td>1633006</td><td></td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠（SDC）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>月桂酰肌氨酸钠（SLS）&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5777</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac 真空浓缩仪</td><td>Labconco</td><td>7970010</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer R 恒温混匀仪</td><td>Eppendorf</td><td>22670107</td><td></td></tr><tr><td>三氟乙酸（TFA）</td><td>Fisher-Scientific</td><td>28904</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶（测序级修饰型）&amp;nbsp;（5 × 20 μg）</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>Tube Revolver 旋转混合仪</td><td>Thermo Fisher</td><td>88881001</td><td></td></tr><tr><td>UltiMate 3000 RSLC nano 液相色谱系统</td><td>Thermo Fisher</td><td>ULTIM3000RSLCNANO</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 1 M Tris-HCl，pH 8.0</td><td>Thermo Fisher</td><td>15568-025</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie 2 涡旋振荡器</td><td>VWR</td><td>102091-234</td><td></td></tr><tr><td>含 0.1% 甲酸（v/v）的水，Optima LC/MS 级&amp;nbsp;</td><td>Fisher-Scientific</td><td>LS118-4&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

利用富集珠联合有限消化进行宿主细胞蛋白分析

Host Cell Protein Analysis using Enrichment Beads Coupled with Limited Digestion

宿主细胞蛋白（HCP）是可能对治疗性蛋白产生不利影响的杂质，即使含量极低也是如此。为了评估药物产品相关的潜在风险，已开发出用于鉴定低丰度HCP的方法。开发高灵敏度HCP检测方法的一个关键策略是在分析前通过液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）对HCP进行富集，同时去除单克隆抗体（mAb）。
本方案提供了使用市售蛋白质组富集珠富集宿主细胞蛋白的详细操作步骤。这些微珠含有多种六肽配体文库，可特异性结合不同的蛋白质。该方案还结合了有限酶切及后续的纳米液相色谱-串联质谱（nano LC-MS/MS）肽段检测技术。通过采用这些技术，低丰度宿主细胞蛋白可实现超过7000倍的富集，检测限可低至0.002 ppm。值得注意的是，本方案利用NIST单克隆抗体可高置信度地检出850种宿主细胞蛋白。此外，该方案设计简便易行，并配有视频演示以辅助实施。通过遵循这些步骤，研究人员可有效富集并检测宿主细胞蛋白，从而提高药物产品风险评估的灵敏度与准确性。

本方案介绍了一种用于单克隆抗体（mAb）样品中宿主细胞蛋白（HCPs）分析的样品制备流程，称为蛋白富集结合有限消化法（PMLD）。图1展示了PMLD的逐步操作流程。研究人员比较了直接消化法（见图2上图）与PMLD法（见图2下图）在HCP分析中的结果。总离子色谱图（TIC）谱图显示，PMLD显著减少或消除了主要的mAb肽段，同时仍可检测到一些与mAb肽段相当的HCP肽段。文中提供了纳米液相色谱（nano LC）分析的详细参数（Table 1）和质谱/串联质谱（MS/MS）分析参数（Table 2）。此外，Table 3汇总了与NIST mAb相关的已鉴定HCP，包括登录号、HCP名称、物种、覆盖度百分比、肽段谱图匹配数（PSMs）、唯一肽段数、分子量、理论等电点（pI）、Mascot评分、Sequest HT评分，以及由Mascot和Sequest HT鉴定出的肽段数量。
<img alt="蛋白质组学工作流程图：珠子孵育、胰蛋白酶消化、纳米液相色谱-质谱分析用于蛋白质研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65544/65544fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：蛋白质富集结合限切消化（PMLD）的样品制备工作流程。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65544/65544fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="色谱质谱结果；相对丰度与时间关系图；总离子流图，傅里叶变换质谱分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65544/65544fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：NIST 单克隆抗体 HCP 分析的总离子流色谱图（TIC）谱图。 上图：采用直接消化法对 NIST 单克隆抗体进行 HCP 分析的 TIC 谱图。下图：采用 PMLD 方法对 NIST 单克隆抗体进行 HCP 分析的 TIC 谱图。从 TIC 谱图中可以明显看出，与直接消化法相比，PMLD 方法使大部分主要的单克隆抗体肽段信号减弱或消除，而一些属于宿主细胞蛋白（HCP）的肽段得以显现，并且其信号强度与单克隆抗体肽段具有可比性。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65544/65544fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
表1：纳米液相色谱参数。 （A）上样泵梯度。（B）NC泵梯度。（C）离子源特性。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65544/65544_Table%201.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表2：MS/MS 参数。 （A）全扫描参数。（B）MIPS 参数。（C）强度参数。（D）电荷态参数。（E）动态排除。（F）数据依赖性 MS2 扫描参数。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65544/65544_Table%202_FINAL.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表3：通过Proteome Discoverer软件分析NIST单克隆抗体所鉴定出的宿主细胞蛋白（HCP）的代表性汇总表。该表包含登录号、HCP名称、物种、覆盖百分比、肽谱匹配数（PSMs）、唯一肽段数、分子量、理论等电点（pI）、Mascot评分、Sequest HT评分，以及由Mascot和Sequest HT鉴定出的肽段数量等信息。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65544/65544_Table%203.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
补充表1：所用缩略词列表。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65544/65544_Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>

本文介绍了一种从药品（DP）中富集宿主细胞蛋白（HCPs）并利用蛋白质组富集微珠检测肽段的实验方案。该方法采用本实验室制备的单克隆抗体（mAb）原液（DS）进行演示，该原液是一种特性明确的参考物质，可用于评估和比较不同方法的性能。

宿主细胞蛋白（HCPs）是一类杂质，即使在微量情况下也可能对治疗性蛋白产生不利影响。为评估其潜在风险……

我们已开发出一种高灵敏度方法，利用蛋白质富集 beads 从药物产品中检测低丰度的宿主细胞蛋白。该方法有助于我们查明与药物产品相关的根本原因及潜在风险。有多种方式可提高 HCP 分析的检测限。靶向方法包括但不限于 Protein A 耗竭、有限消化、分子量截留、免疫沉淀以及靶向检测宿主细胞蛋白的方法，如液相色谱、多反应监测和纳米液相色谱平行反应监测。HCP 分析面临的主要挑战在于抗体药物与宿主细胞蛋白之间存在显著的动态范围差异。因此，大多数方法旨在通过在 LC-MS 分析前减少抗体含量并富集 HCP，从而降低抗体肽段与 HCP 肽段之间的动态范围差异。因此，与其它方法相比，ProteoMiner 技术结合有限消化方案显著提高了宿主细胞蛋白（HCP）分析的检测灵敏度。与免疫沉淀法相比，该技术无偏倚性；与 Protein A 耗竭法相比，可适用于不同的药物分子类型。此外，该方案操作简单、直接。ProteoMiner 技术与有限消化方案有助于我们鉴定多种降解聚山梨酯和抗体片段药物的宿主细胞蛋白。结合纳米液相色谱-多反应监测（nano LC-MRM）方法，该富集方法还可提供定量结果，以确定问题宿主细胞蛋白的生物学相关浓度。首先，将单克隆抗体药物产品适当稀释，以进行宿主细胞蛋白的富集。对于浓度高于 50 毫克/毫升的药物产品，向含有 15 毫克单克隆抗体的 2 毫升微量离心管中加入去离子水进行稀释。对于浓度低于 50 毫克/毫升的药物产品，将 20 毫克样品转移至 10 千道尔顿的离心过滤装置中。在室温下以 14,000G 离心 25 分钟，使管中剩余约 100 微升溶液。然后，向滤器中加入 350 微升 pH 为 6 的 10 毫摩尔组氨酸缓冲液。随后涡旋混匀管子，并在室温下以 14,000 × g 离心 25 分钟。将滤器倒置并放入样品收集管中。在室温下以 1,000G 离心样品 5 分钟，收集全部溶液至收集管中。向滤膜中加入 200 微升 10 毫摩尔/升的组氨酸缓冲液，并用移液器反复吹打以回收残留的蛋白质样品。将全部溶液转移至同一收集管中，涡旋混匀，然后如前所述离心沉淀。使用 NanoDrop 测定样品浓度后，加入组氨酸缓冲液将其调整至 50 毫克/毫升。最后，将 300 微升样品转移至一个 2 毫升微量离心管中。首先，取下商用蛋白质富集试剂盒离心柱的上下盖帽，并保留以备后续使用。将未加盖的离心柱放入一个 2 毫升的微量离心管中。在室温下以 1,000 × g 离心 30 至 60 秒，去除并弃去保存液。向离心柱中的富集珠中加入 200 µL 洗涤缓冲液，并用移液器上下吹打数次进行混匀。按照之前演示的方法离心 spin column 后，弃去收集的缓冲液。更换底部盖帽，并在更换顶部盖帽前向 spin column 中加入 200 µL 水。通过移液枪反复吹打混合制备好的水相 beads 悬液，然后将 40 µL 该悬液转移至预先准备好的单克隆抗体药物产品样品中。将试管在室温下旋转孵育两小时。接着，使用16号针头在适当大小的多孔塑料柱上打孔，并将其插入200微升吸头的尖端。将含有磁珠的样品转移至已准备好的吸头中，并将该吸头插入顶部盖子带有孔洞的2毫升微量离心管中。将枪头放入离心管中离心，以去除溶液。向枪头中加入 200 微升洗涤缓冲液，洗涤磁珠。将枪头放入 2 毫升微量离心管中离心，去除洗涤缓冲液。接下来，用200 µL水清洗尖端中的磁珠，并如前所述进行离心，以去除水分。然后，向尖端中加入10 µL洗脱缓冲液，通过上下吹打悬液10次，使磁珠充分浸入缓冲液中。将该尖端转移至一个新的顶部盖子带孔的0.5 mL微量离心管中，并离心收集洗脱出的蛋白质。加入 1.5 微升胰蛋白酶溶液至洗脱液中，在 28 度下过夜消化。然后向样品中加入 1.5 微升浓度为 25 毫克/毫升的二硫苏糖醇，于 90 度孵育 20 分钟。接着，在避光条件下室温孵育样品，加入 1.5 微升 0.25 摩尔的碘乙酰胺，孵育 20 分钟。随后，加入 3.5 µL 的 10% 三氟乙酸（TFA），涡旋混匀样品 2 分钟。在室温下以 14,400 ×g 离心 10 分钟，使 SDC 和 SLS 沉淀。收集酸化后的上清液用于脱盐。向GC脱盐小柱中加入50微升缓冲液B。然后将小柱放入支架中，在室温下以1,000×g离心3分钟。向小柱中加入50微升缓冲液A，并按照之前所示方法离心小柱。现在，将酸化后的样品加入到小柱中。将小柱放入支架中，在室温下以500G离心6分钟。随后，向小柱中加入50微升缓冲液A进行洗涤，并在室温下以500G离心3分钟。通过加入50微升缓冲液B，从GC脱盐小柱中洗脱肽段，并在新离心管中以500×g离心3分钟（室温）。随后，使用真空浓缩仪将收集的洗脱液干燥。将干燥后的洗脱液重悬于30微升0.1%甲酸溶液中。使用分光光度计在214纳米处测定肽混合物的紫外吸收值。最后，将10微升消化后的样品转移至液相色谱样品瓶中，并使用纳米液相色谱-串联质谱（nano LC-MS/MS）分析1微克样品。宿主细胞蛋白的总离子色谱图显示，与直接消化相比，在经过蛋白质富集结合有限消化的本方案处理后，大多数主要的单克隆抗体肽段均显著减少或被消除。

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