Name: RNA荧光 原 位杂交在人骨肉瘤细胞中长链非编码RNA定位 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: 学习RNA荧光原位杂交技术在人骨肉瘤细胞中定位长链非编码RNA SNHG6的完整实验方案。该方法为癌症研究中lncRNA功能研究提供了可靠的细胞成像参考。

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本工作由以下资助项目支持：（1）国家关键研发计划&amp;中国国家重点研发计划（2020YFE0201600）；国家自然科学基金（81973877 和 82174408）；上海市医院中药制剂工业转化协同创新中心；上海中医药大学预算内研究项目（2021LK047）。
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有关本实验方案中使用的所有材料、试剂和仪器的详细信息，请参见材料表。图1展示了RNA FISH的整体实验流程；表1列出了所有溶液的组成成分，表2列出了本实验方案中使用的引物序列。
1. 探针制备
<ol>
	<li>从 GenBank（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）等数据库中识别并获取目标 lncRNA 的 FASTA 序列。根据网站提示，在线设计原位杂交（ISH）探针19，并参考设计算法的建议，列出需订购的 Cy3 标记探针。</li>
	<li>提前将杂交缓冲液在 37 °C 下孵育 2 小时。</li>
	<li>避光条件下，将 4 光密度（OD）单位的探针溶解于 160 µL 经焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的无核酸酶水（ddH2O）中，使其终浓度为 1 mg/mL。 
	注：光密度（OD）是 DNA 和 RNA 的测量单位。通常，1 OD 单位 = 33 µg/mL DNA。</li>
	<li>为每孔准备 200 µL 探针混合液（含 1.2 µL–10 µL 探针、70 µL 杂交缓冲液，用 DEPC 处理的 ddH2O 补足至 200 µL），并设置一系列浓度梯度：50 µg/mL、25 µg/mL、12.5 µg/mL 和 6 µg/mL。 
	注：探针浓度需预先通过实验探索确定。过高浓度会导致 lncRNA 非特异性结合，而过低浓度则可能导致 lncRNA 检测不灵敏或失败。</li>
	<li>将探针混合物于 73 °C 变性 5 分钟。 
	注：若 Cy3 标记的 DNA 探针为双链，需在 95 °C 下变性 5 分钟以获得单链 DNA，然后立即置于冰上快速冷却 2 分钟。</li>
</ol>
2. 细胞制备
<ol>
	<li>在12孔细胞培养板中，将143B细胞以每孔50,000个的密度接种于无菌玻璃盖玻片上，加入DMEM培养基，在37 °C、5% CO2条件下孵育24小时。 
	注意：此处接种的细胞数量因细胞大小而异，应确保细胞在孵育24小时后达到约50%的汇合度。所用无菌玻璃盖玻片为圆形，适用于12孔板。</li>
	<li>吸除培养基，用1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次，每次5分钟。 
	注意：使用经DEPC处理的ddH2O配制1× PBS。不可使用未经DEPC处理的PBS，因其含有RNase。后续所有操作均需在无RNase条件下进行。</li>
	<li>吸除1× PBS，每孔加入200 µL 100%乙醇，在室温下固定15分钟。</li>
	<li>吸除乙醇，每孔加入200 µL 0.1% Triton X-100（溶于1× PBS），室温孵育15分钟。 
	注意：Triton X-100的透化时间必须严格控制，不可过长。</li>
	<li>吸除0.1% Triton X-100，用1× PBS洗涤两次，每次5分钟。 
	注意：若需在此处暂停实验流程，可将PBS替换为70%乙醇（用无RNase的ddH2O稀释100%乙醇制得），并将样本置于4 °C保存，最长可保存3个月。</li>
	<li>吸除1× PBS，每孔加入200 µL 2×柠檬酸钠-氯化钠（SSC）缓冲液（用无RNase的ddH2O将20× SSC稀释），在37 °C孵育30分钟。</li>
	<li>吸除2× SSC缓冲液，每孔加入200 µL 70%乙醇，室温孵育3分钟。</li>
	<li>弃去70%乙醇，每孔加入200 µL 85%乙醇（用无RNase的ddH2O稀释100%乙醇制得），室温孵育3分钟。</li>
	<li>弃去85%乙醇，每孔加入200 µL 100%乙醇，室温孵育3分钟。</li>
	<li>吸除并弃去100%乙醇，让各孔自然干燥。</li>
</ol>
3. 荧光 原位 荧光原位杂交（FISH）
<ol>
	<li>向每个孔中加入 200 µL 探针混合物（按步骤 1.5 变性处理），在 37 °C 下孵育过夜（16–18 小时）。 
	注意：杂交温度与探针浓度之间存在显著的正相关性；因此，为优化背景信号，应同时降低杂交温度和探针浓度。</li>
	<li>次日，从 37 °C 取出样品，弃去探针混合物。向每个孔中加入 200 µL 预热至 65 °C 的 0.4x SSC/0.3% Tween-20 缓冲液，在室温下洗涤 2 分钟。</li>
	<li>弃去 0.4x SSC/0.3% Tween-20 缓冲液，向每个孔中加入 200 µL 2x SSC/0.1% Tween-20 缓冲液，在室温下洗涤 2 分钟。</li>
	<li>弃去 2x SSC/0.1% Tween-20 缓冲液，向每个孔中加入 200 µL 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色液（1 µg/mL），避光染色 20 分钟。</li>
	<li>弃去 DAPI 染色液，用 1x PBS 在室温下洗涤 2 分钟。</li>
	<li>在载玻片上加入 50 µL 含有树胶的封片剂，将盖玻片盖在载玻片上以固定样本。 
	注意：务必使盖玻片的细胞面朝下放置。</li>
	<li>在荧光显微镜下观察。 
	注意：可使用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜；后者可提供更高灵敏度和更清晰的成像。</li>
</ol>

FISH for Long Non-Coding RNA Localization in Human Osteosarcoma Cells

<ol><li>Djebali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landscape+of+transcription+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Landscape of transcription in human cells.</a> Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).</li>
<li>Li, C. H., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insight+into+the+role+of+long+noncoding+RNA+in+cancer+development+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Insight into the role of long noncoding RNA in cancer development and progression.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 326, 33-65 (2016).</li>
<li>Pan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lncRNA+FBXL19-AS1+regulates+osteosarcoma+cell+proliferation%2C+migration+and+invasion+by+sponging+miR-346%5BTitle%5D)+AND+%22OncoTargets+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">lncRNA FBXL19-AS1 regulates osteosarcoma cell proliferation, migration and invasion by sponging miR-346.</a> OncoTargets and Therapy. 11, 8409-8420 (2018).</li>
<li>Jia, D., Niu, Y., Li, D., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lncRNA+C2dat1+promotes+cell+proliferation%2C+migration%2C+and+invasion+by+targeting+miR-34a-5p+in+osteosarcoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Research%22%5BJournal%5D)">lncRNA C2dat1 promotes cell proliferation, migration, and invasion by targeting miR-34a-5p in osteosarcoma cells.</a> Oncology Research. 26 (5), 753-764 (2018).</li>
<li>Liu, Y., Wang, D., Ji, Q., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LncRNA+MATN1-AS1+for+prediction+of+prognosis+in+osteosarcoma+patients+and+its+cellular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">LncRNA MATN1-AS1 for prediction of prognosis in osteosarcoma patients and its cellular function.</a> Molecular Biotechnology. 64 (1), 66-74 (2022).</li>
<li>Luo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+study+long+noncoding+RNA+biology+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Methods to study long noncoding RNA biology in cancer.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 927, 69-107 (2016).</li>
<li>Zhao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lncRNA+TUSC7+inhibits+osteosarcoma+progression+through+the+miR-181a%2FRASSF6+axis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">lncRNA TUSC7 inhibits osteosarcoma progression through the miR-181a/RASSF6 axis.</a> International Journal of Molecular Medicine. 47 (2), 583-594 (2021).</li>
<li>Tong, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LncRNA+RUSC1-AS1+promotes+osteosarcoma+progression+through+regulating+the+miR-340-5p+and+PI3K%2FAKT+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">LncRNA RUSC1-AS1 promotes osteosarcoma progression through regulating the miR-340-5p and PI3K/AKT pathway.</a> Aging. 13 (16), 20116-20130 (2021).</li>
<li>Qi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ceRNA+in+cancer%3A+possible+functions+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Genetics%22%5BJournal%5D)">ceRNA in cancer: possible functions and clinical implications.</a> Journal of Medical Genetics. 52 (10), 710-718 (2015).</li>
<li>Tripathi, V., Fei, J., Ha, T., Prasanth, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+fluorescence+in+situ+hybridization+in+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA fluorescence in situ hybridization in cultured mammalian cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1206, 123-136 (2015).</li>
<li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li>
<li>Thomsen, R., Nielsen, P. S., Jensen, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dramatically+improved+RNA+in+situ+hybridization+signals+using+LNA-modified+probes%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Dramatically improved RNA in situ hybridization signals using LNA-modified probes.</a> RNA. 11 (11), 1745-1748 (2005).</li>
<li>Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-copy+gene+detection+using+branched+DNA+%28bDNA%29+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).</li>
<li>Hazra, R., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+visualization+of+RNA+transcripts+and+proteins+in+whole-mount+mouse+preimplantation+embryos+using+single-molecule+fluorescence+in+situ+hybridization+and+immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous visualization of RNA transcripts and proteins in whole-mount mouse preimplantation embryos using single-molecule fluorescence in situ hybridization and immunofluorescence microscopy.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 986261(2022).</li>
<li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lncRNA+SNHG6+regulates+EZH2+expression+by+sponging+miR-26a%2Fb+and+miR-214+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hematology+%26+Oncology%22%5BJournal%5D)">lncRNA SNHG6 regulates EZH2 expression by sponging miR-26a/b and miR-214 in colorectal cancer.</a> Journal of Hematology & Oncology. 12 (1), 3(2019).</li>
<li>Yan, K., Tian, J., Shi, W., Xia, H., Zhu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LncRNA+SNHG6+is+associated+with+poor+prognosis+of+gastric+cancer+and+promotes+cell+proliferation+and+EMT+through+epigenetically+silencing+p27+and+sponging+miR-101-3p%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%3A+International+Journal+of+Experimental+Cellular+Physiology%2C+Biochemistry%2C+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">LncRNA SNHG6 is associated with poor prognosis of gastric cancer and promotes cell proliferation and EMT through epigenetically silencing p27 and sponging miR-101-3p.</a> Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 42 (3), 999-1012 (2017).</li>
<li>Zhu, X., Yang, G., Xu, J., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+SNHG6+induced+cell+autophagy+by+targeting+miR-26a-5p%2FULK1+signaling+pathway+in+human+osteosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+International%22%5BJournal%5D)">Silencing of SNHG6 induced cell autophagy by targeting miR-26a-5p/ULK1 signaling pathway in human osteosarcoma.</a> Cancer Cell International. 19, 82(2019).</li>
<li>Birgani, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+non-coding+RNA+SNHG6+as+a+potential+biomarker+for+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Pathology+Oncology+Research%3A+POR%22%5BJournal%5D)">Long non-coding RNA SNHG6 as a potential biomarker for hepatocellular carcinoma.</a> Pathology Oncology Research: POR. 24 (2), 329-337 (2018).</li>
<li>Nielsen, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+lncRNA+by+LNA-based+in+situ+hybridization+in+paraffin-embedded+cancer+cell+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detection of lncRNA by LNA-based in situ hybridization in paraffin-embedded cancer cell spheroids.</a> Methods in Molecular Biology. 2348, 123-137 (2021).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+noncoding+RNA+SNHG6+regulates+p21+expression+via+activation+of+the+JNK+pathway+and+regulation+of+EZH2+in+gastric+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Long noncoding RNA SNHG6 regulates p21 expression via activation of the JNK pathway and regulation of EZH2 in gastric cancer cells.</a> Life Sciences. 208, 295-304 (2018).</li>
<li>Traylor-Knowles, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+techniques+for+paraffin-embedded+adult+coral+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization techniques for paraffin-embedded adult coral samples.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e57853(2018).</li>
<li>Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+RNA+FISH+%28smFISH%29+in+whole-mount+mouse+embryonic+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Single molecule RNA FISH (smFISH) in whole-mount mouse embryonic organs.</a> Current Protocols in Cell Biology. 83 (1), 79(2019).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

该RNA FISH方案不仅可以检测lncRNA在细胞内的定位，还可以检测其他RNA、DNA或蛋白质在细胞内的共定位，也可用于检测lncRNA在石蜡包埋组织中的位置。然而，在此类情况下具体方案有所不同，因为石蜡包埋组织需要进行脱蜡处理21。该实验操作可应用于48孔或96孔板，但384孔板过小，不适用于此实验。
该方法有几个关键步骤需要注意，包括无RNase环境、探针浓度、杂交温度以及阴性对照和阳性对照的设置。首先，无RNase环境至关重要，因为RNase会破坏核苷酸之间的化学键，导致长链非编码RNA（lncRNA）普遍降解。其次，通常推荐的探针浓度范围为5至50 µg/mL。探针浓度过高会导致lncRNA的非特异性结合，而浓度过低则可能导致lncRNA检测不敏感或失败19。如果使用极高浓度的探针，即使仅使用乱序探针（阴性对照），在荧光显微镜下也能观察到背景染色；因此，在初步实验中探索合适探针浓度时，通常使用相同浓度的阴性对照以建立基线（与内参对照相同），从而避免任何非特异性结合。在阴性对照...

近年来，全基因组技术的进步极大地拓展了我们对人类基因组的认识。人类基因组中约有93%的区域可以转录为RNA，但其中仅有2%的RNA能够翻译成蛋白质；其余98%不具有蛋白质翻译功能的RNA被称为非编码RNA（ncRNA）1。作为一类非编码RNA（ncRNA），长链非编码RNA（lncRNA）包含超过200个核苷酸2，因其参与细胞的多种生理与病理过程，如分化、周期调控、凋亡、迁移和侵袭等，而受到越来越多的关注3,4,5。lncRNA通过多种机制发挥功能，例如调控染色质结构和核内基因表达、调节mRNA剪接过程以及参与转录后修饰6。lncRNA在转录水平和转录后水平上均能调控恶性肿瘤的发生、发展及转移。转录水平的调控主要在细胞核内通过与染色体结构结合影响RNA转录实现，而转录后调控则在细胞质中通过内源性竞争性RNA（ceRNA）机制调控靶基因实现5, 7, 8。ceRNA揭示了一种新的RNA相互作用机制，即lncRNA可作为“分子海绵”吸附miRNA，从而抑制miRNA介导的相关靶基因降解9。因此，了解lncRNA的亚细胞定位信息——即特定lncRNA是位于细胞质还是细胞核——对于揭示其生物学功能具有重要意义。
目前，lncRNA 的定位主要通过两种方法检测：一种是细胞核/细胞质分馏分离实验，另一种是 RNA 荧光原位杂交（RNA FISH）。在前一种方法中，分别提取细胞质和细胞核组分中的 RNA，然后使用特异性的 lncRNA 引物进行 PCR 扩增，以检测 lncRNA 在细胞质与细胞核中的比例。该方法的优点是耗时较短，缺点在于细胞质和细胞核中 lncRNA 的相对比例并不能直接反映 lncRNA 的实际定位情况。RNA FISH 通过设计针对 lncRNA 的特异性反义链序列，并用荧光染料标记，从而在细胞内检测 lncRNA 的定位10。随着探针技术和检测方法的进步，RNA FISH 技术已得到改进，包括使用荧光标记的多寡核苷酸探针组11、锁核酸（LNA）探针12以及分支 DNA（bDNA）探针13。RNA FISH 不仅可用于检测 lncRNA 的定位，还可结合双色或多色免疫荧光技术，检测其与其他 RNA、DNA 或蛋白质的共定位情况14。
本研究以RNA荧光原位杂交（RNA FISH）技术检测成骨肉瘤细胞（143B）中长链非编码RNA小核仁RNA宿主基因6（SNHG6）的亚细胞定位为例，提供了详细的实验方案。SNHG6在成熟剪接形式下为600–730个核苷酸长度的长链非编码RNA，已被鉴定为多种人类癌症中的新型癌基因，包括结直肠癌、胃癌、卵巢透明细胞癌、成骨肉瘤和肝细胞癌15,16,17,18。已有研究证实SNHG6参与调控癌细胞的多种生物学行为，如增殖、上皮-间质转化（EMT）和自噬，并显示其主要定位于细胞质中，可能通过结合（“海绵吸附”）miRNA来调控靶基因的表达15,16,17。本文详细介绍了利用RNA FISH技术检测SNHG6在细胞内定位的实验流程。

<table><tbody><tr><td>自动细胞计数仪</td><td>上海西默生物科技有限公司</td><td>IC1000</td><td>细胞计数</td></tr><tr><td>12孔细胞培养板</td><td>上海约年生物科技有限公司</td><td>3513,corning</td><td>将盖玻片放置于培养板中</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;细胞系 (143B)</td><td>中国科学院细胞库</td><td>CRL-8303</td><td>骨肉瘤癌细胞系</td></tr><tr><td>离心管 (15 mL, 50 mL)</td><td>上海约年生物科技有限公司</td><td>&amp;nbsp;430790, Corning</td><td>离心细胞</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>上海约年生物科技有限公司</td><td>abs7026</td><td>将细胞接种于盖玻片上</td></tr><tr><td>Cy3标记的SNHG6 DNA探针</td><td>上海吉玛制药技术有限公司</td><td>A10005</td><td>检测SNHG6定位</td></tr><tr><td>DMEM培养基</td><td>上海约年生物科技有限公司</td><td>LM-E1141</td><td>细胞培养基</td></tr><tr><td>干式恒温孵育器</td><td>海门麒麟-贝尔实验仪器有限公司</td><td>DKT200-2&amp;nbsp;</td><td>在不同高温条件下孵育</td></tr><tr><td>100%乙醇&amp;nbsp;</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>10009218</td><td>脱水</td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>上海外海生物科技有限公司</td><td>Olympus BX43 配备 Olympus U-TV0.5XC-3 相机 (SN:5J01719), olympus</td><td>观察与定位</td></tr><tr><td>培养箱</td><td>上海一恒科学仪器有限公司</td><td>DHP-9051</td><td>样品在37 &amp;deg;C下孵育</td></tr><tr><td>封片剂</td><td>生工生物工程（上海）股份有限公司</td><td>E675004</td><td>将盖玻片固定于载玻片上</td></tr><tr><td>摇床</td><td>海门麒麟-贝尔实验仪器有限公司</td><td>TS-8S</td><td>洗涤样品</td></tr><tr><td>载玻片</td><td>上海约年生物科技有限公司</td><td>188105</td><td>将盖玻片置于载玻片上</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>生工生物工程（上海）股份有限公司</td><td>A600198</td><td>通透细胞膜和核膜</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;胰蛋白酶 (0.25%)</td><td>上海约年生物科技有限公司</td><td>25200056, Gibco</td><td>细胞胰酶处理</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>生工生物工程（上海）股份有限公司</td><td>A600560</td><td>去垢剂</td></tr></tbody></table>

rna 荧光 原位 杂交法用于长链非编码 rna 在人骨肉瘤细胞中的定位

RNA Fluorescence In Situ Hybridization for Long Non-Coding RNA Localization in Human Osteosarcoma Cells

长链非编码RNA（lncRNA）在癌症中的重要作用已被广泛研究，例如调控癌细胞的增殖、上皮-间质转化（EMT）、迁移、浸润以及自噬等过程。对lncRNA在细胞内的定位检测有助于揭示其生物学功能。通过设计特异性的lncRNA反义链序列并标记荧光染料，可应用RNA荧光原位杂交（FISH）技术来检测lncRNA的细胞定位。随着显微镜技术的发展，RNA FISH技术现已能够实现对表达水平较低的lncRNA的可视化观察。该方法不仅能单独检测lncRNA的定位，还可结合双色或多色免疫荧光技术，实现与其他RNA、DNA或蛋白质的共定位分析。本文以人骨肉瘤细胞（143B）中lncRNA小核仁RNA宿主基因6（SNHG6）为例，详细介绍了RNA FISH实验的操作步骤及注意事项，旨在为希望开展RNA FISH实验、尤其是lncRNA FISH实验的研究人员提供参考。

人骨肉瘤细胞中SNHG6荧光原位杂交的代表性图像如图（图2）所示。阴性对照使用阴性对照探针处理，阳性对照使用U6探针处理20。SNHG6探针和U6探针均用Cy3标记，可发出红色荧光。DAPI为DNA染色剂，可发出蓝色荧光。结果表明，SNHG6主要定位于细胞质，该信息可为SNHG6的进一步研究提供重要方向。
如果使用浓度过高的探针，荧光显微镜下可观察到背景着色。图3展示了在RNA FISH中使用高浓度SNHG6探针时的代表性图像。白色箭头表示非特异性染色。
<img alt="原位荧光杂交示意图：探针、细胞制备、显微镜分析的FISH步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65545/65545fig01.jpg" data-altu...

本实验方案描述了一种RNA荧光原位杂交方法，用于定位人骨肉瘤细胞中的长链非编码RNA（lncRNA）。

RNA 荧光 原位 杂交法用于长链非编码 RNA 在人骨肉瘤细胞中的定位

长链非编码RNA（lncRNAs）在癌症中的重要作用已被广泛研究，例如调控细胞增殖、上皮-间质转化……

本研究的目的是提供一份详细的RNA FISH实验方案，为希望开展RNA FISH实验的科研人员提供参考。我们的研究已证实，RNA FISH可用于定位人骨肉瘤细胞中的长链非编码RNA（IncRNA）。本方案以人骨肉瘤细胞中IncRNA SNHG6为范例，提供了完整的RNA FISH实验流程及注意事项。首先，在获得目标长链非编码RNA后，将杂交缓冲液在37摄氏度下孵育两小时。接着，避光条件下将四光密度探针溶解于160微升经焦碳酸二乙酯处理的去离子水中。每孔准备200微升探针混合液，并配制一系列浓度分别为50、25、12.5和6微克/毫升的溶液。将探针混合物在73摄氏度下变性5分钟。取一个12孔细胞培养板，其中含有生长在无菌玻璃盖玻片上的143B细胞。吸去培养基，并用PBS洗涤两次，每次5分钟。将细胞置于摇床上。随后吸除 PBS，每孔加入 200 µL 100% 乙醇，室温固定 15 分钟。然后吸除乙醇，每孔加入 200 µL 0.1% Triton X-100，室温孵育 15 分钟。去除0.1% Triton X-100，并用PBS洗涤两次，每次五分钟。接着去除PBS。向每个孔中加入200 µL的2× SSC缓冲液，在37°C下孵育30分钟。移除2X SSC缓冲液。向每个孔中加入200微升70%乙醇，在室温下孵育3分钟。弃去70%乙醇，然后向每个孔中加入200微升85%乙醇，在室温下孵育3分钟。接下来，弃去85%乙醇。向每个孔中加入200 µL 100%乙醇，在室温下孵育3分钟。随后，吸去并弃除100%乙醇，让各孔干燥。接下来，向每个孔中加入 200 微升变性探针混合物。然后在 37 摄氏度下孵育过夜。次日，将样品从 37 摄氏度取出，弃去探针混合物，向每个孔中加入 200 微升预热的 0.4X SSC 0.3%Tween-20 缓冲液，在室温下洗涤两分钟。移除 0.4X SSC 0.3%Tween-20 缓冲液。向每个孔中加入 200 微升 2X SSC 0.1%Tween-20 缓冲液，在室温下洗涤 2 分钟。接着，弃去 2X SSC 0.1%Tween-20 缓冲液，向每个孔中加入 200 微升 DAPI 染色液，在避光条件下于摇床上染色 20 分钟。染色后，弃去DAPI溶液，用PBS在室温下洗涤2分钟。最后，向载玻片上加入50微升含甘油的封片剂，并加盖盖玻片以固定样本。图中显示了人骨肉瘤细胞中SNHG6的代表性FISH图像。用Cy3标记的SNHG6探针可发出红色荧光，结果显示SNHG6主要定位于细胞质中。当使用高浓度探针时，可观察到背景颜色。

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癌症研究

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建立人传统型骨肉瘤的肿瘤干细胞培养

学习RNA荧光原位杂交技术在人骨肉瘤细胞中定位长链非编码RNA SNHG6的完整实验方案。该方法为癌症研究中lncRNA功能研究提供了可靠的细胞成像参考。

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