RGBradford：使用智能手机摄像头进行蛋白质定量

我们的研究重点是在生化层面理解动物如何适应极端环境和条件。我们探讨动物对缺氧以及代谢率受抑制情况的响应机制。具体而言，我们研究动物在恶劣环境中所依赖的内源性抗氧化物质、氧化应激以及细胞应激反应，并为此经常对样本中的蛋白质水平进行定量分析。

本方案旨在解决在资源有限的情况下获取蛋白质定量数据的替代方法需求，使其在教育和研究环境中均可应用。RG 宽度检测法提供了一种实用且可靠的蛋白质浓度测定方案，在无法获得常规设备（如酶标仪）的情况下，该方法仍具有可及性、简便性和准确性。开始进行 Bradford 蛋白质测定的样品制备时，应将蛋白质样品稀释，以获得处于标准曲线范围（0.025 至 1.0 毫克/毫升）内的蛋白质浓度。

在此范围内为每个样品制备多个稀释度。对于零蛋白点，向指定孔中加入 10 微升用于配制标准溶液的缓冲液或培养基，然后将每种蛋白标准溶液各 10 微升分别加入一组三个孔中，作为 96 孔微孔板中的三复孔。在同一块 96 孔微孔板的另一组孔中，将每种样品稀释液各 10 微升以三复孔形式加入。

接下来，向所有孔中加入 250 µL Bradford 蛋白质测定试剂。最终的微孔板设置布局将显示在屏幕上。在加入测定试剂后的 5 至 15 分钟内，于光线充足的房间中记录结果。

用一只手将微孔板紧贴均匀的白色背景，并确保其与工作台面平行；同时用另一只手将智能手机保持与台面及微孔板平行。随后拍摄多张包含整个微孔板的图像。对于 iOS 设备，可在相机设置中启用网格选项，以打开相机水平指示器。

对于安卓设备，可在相机设置中启用网格线以实现相同效果。尽管无需特殊的照明设备，但在拍摄图像时仍需谨慎操作。避免遮挡培养皿或背景，并防止产生过度反光。

同时，确保不要倾斜平板。检查图像的背景均匀性、阴影和反射情况。同时，检查孔板的角度。

每个孔的中心应能直接可见。如有需要，可使用酶标仪读取微孔板，以将图像的颜色数据与微孔板的吸光度读数进行比较。为从智能手机相机拍摄的微孔板图像中提取Bradford测定数据，请下载软件ImageJ及以文本文件形式提供的read plate插件。

打开 ImageJ 后，依次点击 plugins（插件），然后选择 install（安装），并选中已下载的 read plate plugin（读板插件）文本文件。通过点击 analyze（分析），然后选择 set measurements（设置测量）来设定测量参数，在选项中勾选 area（面积）、standard deviation（标准差）、minimum and maximum gray value（最小和最大灰度值）、mean gray value（平均灰度值）、modal gray value（众数灰度值）。在窗口底部，将 redirect to（重定向为）设置为 none（无），decimal places（小数位数）从零到九设置为三位。

转到文件，点击打开，选择使用智能手机拍摄的微孔板图片。然后转到插件，选择读取微孔板。阅读说明后，点击确定。

选择孔数为96。使用插件自动加载的矩形选择工具，从A1孔中心开始，到H12孔中心结束绘制一个矩形，然后单击“确定”。选择蓝色通道，单击“确定”，然后单击“确定”确认默认参数。

检查软件是否在每个孔内划定了区域，并确认所选区域未覆盖存在异常阴影或反光的区域。检查无误后，点击“确定”。在对绿色通道重复相同操作前，先保存结果。

使用每种颜色的众数计算蓝绿比值。从微孔板图像自动获取的RGB颜色数据显示，BSA标准品的蓝色值呈典型上升趋势，而红色和绿色值则下降。此外，从图像中提取的颜色数据准确反映了在450和590纳米波长处记录的吸光度读数。

使用提取的颜色数据绘制的信号与BSA浓度的标准曲线呈线性关系，符合预期。在两种不同的蛋白质样品中，吸光度读数以及提取的颜色数据均显示出样品稀释倍数与信号之间的线性关系。对于这两种蛋白质样品，部分稀释浓度超出了标准曲线的线性范围。

然而，在忽略这些点后，利用RGB数据计算出的两个样本的蛋白浓度与利用吸光度读数计算出的结果一致。为了从智能手机拍摄的微孔板图像中手动提取Bradford测定数据，请下载Inkscape，这是一款免费的开源图形编辑软件。打开Inkscape，进入文件菜单，点击打开，选择使用智能手机拍摄的微孔板图片。

选择位于左上角、以箭头图标表示的“选择并变换对象 S”工具，然后单击图像。虚线边框将显示当前选区，接着选择位于左侧、以滴管图标表示的“从图像 D 选取颜色”工具。随后，单击孔板中某个孔的中心位置。

下方面板中的填充颜色将相应改变。单击该颜色，右侧将弹出填充与描边选项卡。将平面颜色下拉菜单更改为 RGB。

记录每个孔中蓝色和绿色通道显示的数值。使用记录的数值计算蓝绿荧光比值。