Name: 使用荧光成像快速体外细胞毒性评估表达嵌合抗原受体的 Jurkat (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 了解利用荧光成像技术快速评估表达嵌合抗原受体的Jurkat细胞对肿瘤细胞的体外细胞毒性。该方法可在96孔板中同时筛选多种CAR结构，为优化CAR-T细胞治疗提供高通量筛选平台。

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MDA-MB-231 细胞系由 Shane Stecklein 博士惠赠。作者感谢堪萨斯大学癌症中心为开展本研究提供的经费支持。

注意：所有细胞培养操作均须在生物安全柜中进行，并穿戴实验服、手套，遵循标准的无菌技术。
1. 生成表达CAR的Jurkat细胞（CAR-J）
<ol>
	<li>从 ATCC 购买 Jurkat 细胞（克隆株 E6-1）。在 T-75 培养瓶中复苏 1 × 106 个细胞，并在 T-75 培养瓶中进行培养。使用添加 10% 胎牛血清（FBS）的 Roswell Park Memorial Institute（RPMI）培养基，在 37 °C、5% CO2 的培养箱中维持细胞悬浮状态，密度为 0.6 × 106 个细胞/mL。</li>
	<li>将 Jurkat 细胞以每孔 1 × 105 个细胞接种于经组织培养处理的 24 孔板中，每孔加入含 4 µg/mL 多聚凝集素（polybrene）的 RPMI 生长培养基 500 µL，以提高慢病毒转导效率。使用基于激光的荧光检测台式细胞分析仪计数细胞。所需孔数取决于待评估的构建体数量。本示例将使用 4 种构建体及一个未转导对照组。CAR 构建体设计见表 1。</li>
	<li>每孔加入 10 µL 各 CAR 构建体对应的慢病毒。CAR 构建体设计及慢病毒制备方法如前所述12。</li>
	<li>次日，向每孔加入 1 mL RPMI 生长培养基，并继续在 37 °C、5% CO2 的培养箱中培养。</li>
	<li>两天后收集细胞（Jurkat 细胞转导后共 72 小时），并进行计数。</li>
	<li>取 1 × 104 个细胞用于流式分析，以确认 Jurkat 细胞表面 CAR 的表达。简要步骤如下：先用 FACS 染色液（FSS）洗涤细胞两次，然后在 4 °C 避光条件下，用针对 Flag 标签的抗体对 CAR-J 进行染色 30 分钟，以检测 CAR 阳性率。再次用 FSS 洗涤两次，随后按照先前描述的方法12通过流式细胞仪检测细胞。抗体使用浓度应遵循生产商推荐。</li>
	<li>Jurkat 细胞易于转导，几乎总是表现出&#62;90% 的 CAR 表达。建议在共培养细胞毒性实验前较早时间制备 CAR-J，并冻存以备后续使用。</li>
</ol>
2. 铺板CFSE标记的肿瘤细胞
注意：MDA-MB-231 细胞（来自 ATCC，HTB-26）由合作者惠赠，EGFR 基因敲除的 MDA-MB-231 细胞系的构建方法如前所述12。
<ol>
	<li>在T-75培养瓶中复苏1 × 106个细胞，并在T-75培养瓶中进行培养。将MDA-MB-231肿瘤细胞及CRISPR EGFR基因敲除（KO）MDA-MB-231肿瘤细胞培养于含10%胎牛血清（FBS）的14 mL DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基）中，置于37 °C、5% CO2的培养箱中培养，当细胞融合度约为70%时进行传代。</li>
	<li>在普通明场显微镜下观察贴壁生长的肿瘤细胞，确保细胞融合度接近70%。</li>
	<li>使用血清移液管从培养瓶中移除培养基。向T75培养瓶中加入3 mL胰蛋白酶，置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育3–5分钟，使细胞从瓶壁脱落。</li>
	<li>加入等体积（3 mL）的完全培养基以中和胰蛋白酶。将细胞悬液收集至离心管中，在400 × g条件下离心4分钟，使细胞沉淀。</li>
	<li>用移液器弃去上清液，将细胞重悬于2 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中。使用细胞计数仪测定细胞浓度。</li>
	<li>取8 × 105个细胞转移至另一支15 mL离心管中，并加入PBS至终体积为1 mL。</li>
	<li>向每管中加入2 µL羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE；储存浓度为5 µM），使用1 mL移液器充分混匀。</li>
	<li>将细胞在37 °C、5% CO2的培养箱中与CFSE共同孵育20分钟。20分钟后从培养箱中取出离心管，向每管中加入5 mL完全培养基。</li>
	<li>在400 × g条件下离心4分钟，使CFSE标记的细胞沉淀。用移液器弃去上清液，加入1 mL新鲜培养基重悬细胞。</li>
	<li>使用细胞计数仪重新测定细胞浓度。取4 × 105个细胞转移至25 mL试剂储液槽中，并加入培养基至总体积为8 mL。
	<ol>
		<li>为确保能够以100 µL培养基接种5000个肿瘤细胞/孔，并满足多通道移液器操作所需的液体体积，同时补偿步骤1.7中可能的细胞损失，建议额外准备10%–20%的细胞和培养基体积。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用5 mL血清移液管充分混匀细胞悬液。使用100 µL多通道移液器，将100 µL细胞悬液加入左侧半区透明平底黑色96孔板的每一行孔中。可参考表2中的示例加样策略。</li>
	<li>以相同方式将EGFR基因敲除细胞加样至96孔板的右侧半区。加样完成后，在生物安全柜操作台面上前后、左右轻摇培养板，确保肿瘤细胞在各孔中均匀分布。</li>
	<li>将培养板置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育4小时，使肿瘤细胞充分贴壁。</li>
</ol>
3. 将表达CAR的Jurkat细胞与CFSE标记的肿瘤细胞共培养
<ol>
	<li>根据未转导和表达CAR的Jurkat细胞计数，将每种CAR-J细胞各4 × 105个转移至25 mL储液槽中。加入DMEM培养基，使总体积为2 mL。</li>
	<li>对于效靶比（E:T）为4:1的条件，使用多通道移液器将2 × 104个CAR-J细胞沿每孔侧壁轻轻加入含培养基的孔中，总体积为100 µL，避免扰动已贴壁的肿瘤细胞。</li>
	<li>使用多通道移液器向含有肿瘤细胞和Jurkat细胞的孔中再沿侧壁加入100 µL培养基。仅含肿瘤细胞的对照组孔中加入200 µL培养基，使所有孔中培养基总体积均为300 µL。</li>
	<li>在平台上前后左右轻缓拖动培养板，以确保Jurkat细胞在肿瘤细胞上均匀分布。</li>
	<li>将共培养体系置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育48小时。</li>
</ol>
4. 成像用培养板的制备
<ol>
	<li>根据孔数及每孔加入100 µL培养基的需要，用低自发荧光培养基配制浓度为1 µg/mL的碘化丙啶（PI）溶液。</li>
	<li>对于84个孔，准备含有PI的9 mL培养基，并用移液器充分混匀。</li>
	<li>通过将Triton-X用去离子水稀释，配制10 mL的20% Triton-X溶液。共培养48小时后，将含有CAR-J的上清液通过将培养板倒置一次并轻敲纸巾的方式弃去。</li>
	<li>使用多通道移液器，向每孔中轻柔加入100 µL上述已配制的含PI培养基（步骤4.2），避免扰动贴壁的肿瘤细胞。</li>
	<li>向每种肿瘤类型的第一个孔中加入20 µL的20% Triton-X溶液，作为完全裂解死亡对照。</li>
	<li>将培养板置于培养箱中孵育20分钟，然后使用荧光成像细胞仪对培养板进行成像。数据将存储在计算机中，可供后续分析。</li>
</ol>
5. 分析荧光图像
<ol>
	<li>使用其中一个仅含肿瘤细胞的孔来设置绿色荧光通道。</li>
	<li>将孔的掩模缩小至98%，以去除孔边缘的细胞，因为边缘处的信号不完整。</li>
	<li>在绿色荧光CFSE通道中识别CFSE标记的肿瘤细胞。调整荧光强度阈值，确保识别孔内所有细胞。</li>
	<li>将最小细胞直径设为25 µm，以去除CFSE通道中检测到的任何碎片。该数值根据所分析的细胞类型而有所不同。</li>
	<li>启用 分离接触物体 功能，以便在细胞相互接触时仍能识别单个细胞。</li>
	<li>在图像显示中选择 CFSE，并查看图形叠加，以确定系统正在识别的内容。</li>
	<li>当CFSE标记的细胞被正确识别后，设置门控以区分活细胞与死细胞群体。</li>
	<li>选中CFSE标记的细胞，生成一个直方图，y轴为计数，x轴为平均PI荧光强度。</li>
	<li>根据添加了Triton-X的孔（步骤4.5），绘制分割线以区分低PI染色与高PI染色的细胞。该孔中的大多数细胞应位于高PI染色区域。 
	注意：活细胞中PI存在基础信号。因此，加入Triton-X可杀死所有细胞，使其在红色荧光通道中强烈染色，从而有助于设置门控以区分死细胞与活细胞。</li>
	<li>调整x轴数值，以便更清晰地观察细胞。现在将低PI染色的细胞标记为活细胞。</li>
	<li>选中活细胞，设置另一个直方图，x轴为细胞面积，y轴为计数。</li>
	<li>利用仅含肿瘤细胞的孔绘制另一条分割线，以捕获细胞并排除碎片。Jurkat处理孔将开始积累CFSE染色的碎片，需从计数中去除。剩余的非碎片部分标记为“Big cells&#34;。</li>
	<li>对整块板运行分析，并导出包含数据的电子表格。</li>
	<li>绘制“Big counts”图表，以确定经CAR-J处理后孔中残留的活CFSE标记肿瘤细胞数量。使用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行统计分析。</li>
</ol>

Evaluating Quantitative Tumor Cell Killing by CAR-Expressing Jurkat Cells

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<li>Labanieh, L., Mackall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+immune+cells%3A+design+principles%2C+resistance+and+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">CAR immune cells: design principles, resistance and the next generation.</a> Nature. 614, 635-648 (2023).</li>
<li>Sterner, R. C., Sterner, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-T+cell+therapy%3A+current+limitations+and+potential+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cancer+J%22%5BJournal%5D)">CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies.</a> Blood Cancer J. 11 (4), 69(2021).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文提出了一种快速、高效评估CAR在Jurkat细胞中表达所诱导的靶标特异性细胞溶解活性的方法。所有CAR构建体均含有相同的scFv，但铰链区和跨膜区不同，而这些区域已被证明会影响CAR-T细胞的效力13。为进一步评估这些CAR-J细胞的非特异性杀伤作用，将其与抗原敲除（KO）细胞共培养。结果表明，细胞杀伤作用具有肿瘤抗原特异性，而非由CAR-J的本底激活所致。通过该方法可轻松确定不同效靶比（E:T）下的细胞毒潜力，从而明确在特定时间点清除肿瘤细胞所需的最少效应细胞数量。此外，还可使用同一种或不同癌症类型的多种细胞系以及正常细胞，以评估这些构建体的特异性。在CAR-J平台中筛选出的最具活性的候选分子，可进一步通过在PBMC来源的CD3+ T细胞中表达CAR，并进行类似的杀伤实验，同时检测其在接触抗原阳性与阴性肿瘤细胞后的耗竭和活化状态，从而完成深入表征。
需要注意的是，Jurkat 细胞是 CD4+ 细胞，其 T 细胞受体（TCR）信号通路发生改变15。因此，CAR 结构的胞内信号结构域...

CAR-T细胞疗法在血液系统恶性肿瘤中已展现出巨大前景，美国国家癌症研究所报告称，自2017年以来已有6种CAR-T产品获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准1。目前还有众多针对实体瘤的CAR-T细胞疗法正处于临床试验阶段。设计新型CAR靶点并优化CAR结构对CAR-T细胞的疗效至关重要。针对不同应用选择理想的CAR结构，对于准确靶向肿瘤相关抗原（TAA）同时避免正常组织中低水平TAA表达所导致的脱靶效应具有重要意义2。
CAR 结构主要由五个部分组成：（1）靶向肿瘤抗原的胞外单链可变区片段（scFv）结构域；（2）铰链区；（3）跨膜结构域；（4）胞内T细胞共刺激结构域；（5）信号传导结构域。对这些结构域中的任何一个进行修饰，均会影响CAR-T细胞与靶细胞相互作用的精确性3因此，评估这些CAR结构的细胞毒性和交叉反应性 体外 选择合适的构建体对于推进研究至关重要 体内 实验。目前评估T细胞溶解作用的方法包括 51铬释放试验、乳酸脱氢酶释放试验、生物发光成像试验、基于实时阻抗的细胞分析以及基于细胞的流式细胞术试验4,5基于荧光成像的检测平台可直接计数活细胞与死细胞的数量，从而直接定量T细胞的细胞毒作用，而非采用间接方法评估T细胞的细胞毒活性。
本研究介绍了一种简便、低成本、快速且高通量的技术，可最小化人为干预，用于评估表达表皮生长因子受体（EGFR）嵌合抗原受体（CAR）的Jurkat细胞对MDA-MB-231三阴性乳腺癌（TNBC）细胞及EGFR CRISPR敲除的MDA-MB-231细胞的细胞毒性。Jurkat细胞是一种永生化的人T淋巴细胞6，已被广泛用于T细胞活化和信号转导机制的研究7。此外，Jurkat细胞已在多项研究中被用于体外（in vitro）CAR功能检测8,9,10,11。Jurkat细胞易于被慢病毒转导，并具有持续增殖能力，本研究利用该系统优化了多种EGFR CAR结构中的铰链区结构域。
该检测可用于筛选靶向多种肿瘤抗原的多个CAR结构，并可用于针对多种贴壁肿瘤细胞系以及不同效应细胞与肿瘤细胞（E:T）比例的实验。此外，可评估多个时间点，并可调整重复次数，以在不同CAR结构中鉴定出最佳杀伤效果。最佳CAR结构需通过外周血单个核细胞（PBMCs）来源的CD3 T细胞进行验证。开发该方法的总体目标是以高通量方式快速优化CAR铰链区结构，克服诸如转导效率低等技术障碍，随后在PBMC来源的T细胞中进行确认。

<table><tbody><tr><td>15 mL 圆锥形离心管（无菌）</td><td>Midwest Scientific</td><td>#C15B</td><td>任何类似产品均可使用</td></tr><tr><td>50 mL 圆锥形离心管（无菌）</td><td>Thermo Scientific</td><td>339652</td><td>任何类似产品均可使用</td></tr><tr><td>黑色/透明 96 孔板</td><td>Falcon</td><td>353219</td><td>Celligo 提供兼容孔板列表</td></tr><tr><td>Celigo 四通道成像细胞仪</td><td>Nexcelcom Bioscience</td><td>200-BFFL-5C</td><td>任何类似产品均可使用</td></tr><tr><td>Celigo 软件</td><td>Nexcelcom Bioscience</td><td>版本 5.3.0.0</td><td>任何类似产品均可使用</td></tr><tr><td>细胞培养孵育箱</td><td>Thermo Scientific</td><td>HeraCell 160i</td><td>任何类似产品均可使用</td></tr><tr><td>细胞培养处理烧瓶（T75，多种规格，无菌）</td><td>TPP</td><td>90076</td><td>任何类似产品均可使用</td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Tonbo</td><td>13-0850-U500</td><td>任何类似产品均可使用</td></tr><tr><td>Cytek Muse 细胞分析仪</td><td>Cytek</td><td>0500-3115</td><td>任何类似产品均可使用</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11995-040</td><td>任何类似产品均可使用</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gemini bio-products</td><td>900-108</td><td>任何类似产品均可使用</td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>Cytek, BD 等</td><td>Aurora, LSR II 等</td><td>任何类似产品均可使用</td></tr><tr><td>FlowJo 软件</td><td>Becton Dickinson &amp;amp; Company&amp;nbsp;</td><td>版本 10.7.1</td><td>任何类似产品均可使用</td></tr><tr><td>Fluorobrite DMEM</td><td>Gibco</td><td>A18967-01</td><td>任何类似产品均可使用</td></tr><tr><td>GraphPad 软件</td><td>GraphPad</td><td>版本 9.3.1 (471)</td><td>任何类似产品均可使用</td></tr><tr><td>多通道移液器</td><td>Thermo Scientific</td><td>Finnpipette F2</td><td>任何类似产品均可使用</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-031</td><td>任何类似产品均可使用</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液（PenStrep）</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td>任何类似产品均可使用</td></tr><tr><td>移液器吸头（无菌，带滤芯，1 mL，多种规格）</td><td>Pr1ma</td><td>PR-1250RK-FL 等</td><td>任何类似产品均可使用</td></tr><tr><td>移液器&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>Finnpipette F2</td><td>任何类似产品均可使用</td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>Invitrogen</td><td>P1304MP</td><td>任何类似产品均可使用</td></tr><tr><td>RPMI 培养基</td><td>Corning</td><td>10-041-cv</td><td>任何类似产品均可使用</td></tr><tr><td>血清移液管辅助器</td><td>Drummond Scientific</td><td>4-000-105</td><td>任何类似产品均可使用</td></tr><tr><td>血清移液管（无菌，多种规格）</td><td>Pr1ma</td><td>PR-SERO-25 等</td><td>任何类似产品均可使用</td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Corning</td><td>25-000-CI</td><td>任何类似产品均可使用</td></tr><tr><td>无菌储液槽</td><td>Midwest Scientific</td><td>RESE-2000</td><td>任何类似产品均可使用</td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>任何类似产品均可使用</td></tr></tbody></table>

快速 体外 使用荧光成像法评估表达嵌合抗原受体的jurkat细胞的细胞毒性

Rapid In Vitro Cytotoxicity Evaluation of Jurkat Expressing Chimeric Antigen Receptor using Fluorescent Imaging

嵌合抗原受体（CAR）T细胞处于肿瘤学研究的前沿。CAR由一个靶向结构域（通常为单链可变区片段，scFv）、一个链内连接子、随后的铰链区、跨膜区以及共刺激结构域组成。链内连接子和铰链区的修饰可显著影响CAR介导的杀伤作用。考虑到CAR结构中每个部分均有多种不同的选择，其组合数量极为庞大。制备CAR-T细胞是一个耗时且昂贵的过程，构建和测试多种CAR结构需要投入大量时间和材料。本实验方案描述了一种在Jurkat细胞中快速评估铰链区优化型CAR结构的平台（CAR-J）。Jurkat细胞是一种永生化的T细胞系，具有高效的慢病毒摄取能力，可实现CAR的高效转导。本文介绍了一种利用荧光成像仪快速评估CAR-J功能的平台，并进一步在PBMC来源的T细胞中验证其细胞溶解活性。

在72小时评估了CAR-J1对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞表面EGFR靶向作用的E:T比范围（1:8至8:1）。如步骤2所述，使用含polybrene的CAR慢病毒转导Jurkat细胞以生成CAR-J细胞。CAR-J1的细胞毒性随E:T比升高而显著增强，在1:8比例下杀伤效果无明显差异（图1）。在4:1的E:T比下，72小时内观察到超过50%的肿瘤细胞被杀伤。后续实验采用该E:T比，并将作用时间缩短至48小时，以便快速评估多种CAR结构的细胞毒性。设计了铰链区修饰的靶向EGFR的CAR结构（Table 1）。所使用的4种不同铰链分别为IgG长型、IgG中型、IgG短型和CD8α，如文献13所述。这3种结构在Jurkat细胞中表达，并通过流式细胞术检测Flag标签阳性细胞比例来确定CAR表达水平（图2A-D），方法见文献12。未转导的Jurkat细胞作...

一种用于评估表达靶向单一肿瘤抗原的嵌合抗原受体（CAR）的Jurkat细胞对肿瘤细胞杀伤能力的定量实验方案。该方案可作为筛选平台，用于在外周血来源的T细胞中验证之前快速优化CAR铰链结构的实验。

快速 体外 使用荧光成像法评估表达嵌合抗原受体的Jurkat细胞的细胞毒性

嵌合抗原受体（CAR）T细胞处于肿瘤学研究的前沿。CAR由一个靶向结构域（通常为单链可变区片段）...

CAR T细胞正在不断改进，以在人类临床试验中获得更好的治疗效果。我们正在实验室中探索利用无偏倚的高通量方法评估这些改进策略的途径，例如采用荧光成像技术来筛选最有效的组合方案。通过改变胞外区和铰链区的结构构型，可为任何单链可变区片段设计出多种不同的构建组合。我们设计了该实验方案，旨在利用Jurkat细胞鉴定在清除靶细胞方面效果最佳的组合。这是一种高通量快速筛选方法，基于CAR构建体对Jurkat细胞的靶细胞毒性进行筛选。当该方法经传统T细胞验证后，可在96孔板中同时检测十余种不同的CAR构建体。在Akhavan实验室，我们采用高通量方式，以绝对数值定量分析表达CAR的Jurkat细胞对靶细胞的直接细胞毒性，从而实现对多种CAR构建体的筛选。本实验室的主要目标是提高CAR T细胞疗法对高级别脑肿瘤的临床转化效果。我们采用高通量药物筛选作为一种手段，以增强CAR T细胞的细胞毒性，并靶向肿瘤微环境。首先，使用血清移液管，吸除含有70%融合度MDA-MB-231细胞培养物的T75培养瓶中的生长培养基。向培养瓶中加入 3 毫升胰蛋白酶，于 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下孵育 3 至 5 分钟，使细胞从培养瓶壁脱离。随后加入 3 毫升 DMEM 以中和胰蛋白酶。将细胞悬液收集至离心管中，以 400 ×g 离心 4 分钟。用移液器弃去上清液，并将沉淀重悬于 2 毫升 PBS 中。使用细胞计数仪测定细胞浓度。将 8 × 10⁵ 个细胞转移至 15 毫升离心管中，并加入 PBS 至终体积为 1 毫升。然后向离心管中加入两微升 CFSE，使用一毫升移液器充分混匀细胞悬液。将离心管置于37摄氏度、含5%二氧化碳的培养箱中孵育20分钟。接着向管中加入五毫升 DMEM，离心以沉淀 CFSE 标记的细胞。弃去上清液，并将沉淀重悬于1毫升DMEM中。重新测定细胞浓度后，将4 × 10⁵个细胞转移至25毫升试剂储液槽中。加入DMEM至终体积为8毫升，并用5毫升血清移液管混匀细胞悬液。使用多通道移液器，将 100 微升细胞悬液加入黑色 96 孔板左侧每行的孔中。同样，将 EGFR 敲除细胞悬液加入该板右侧的各孔中。为确保细胞均匀分布，将板在平台上前后左右轻轻晃动。将培养板在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育4小时，使肿瘤细胞贴壁。根据未转导和表达CAR的Jurkat细胞计数，将4 × 10⁵个CAR-J细胞转移至25毫升储液槽中。向储液槽中加入DMEM，终体积为2毫升。按照效应细胞与肿瘤细胞4:1的比例，沿孔壁一侧在每孔中加入2 × 10⁴个CAR-J细胞，体积为100 µL培养基，注意不要扰动已贴壁的肿瘤细胞。随后，在含有肿瘤细胞和Jurkat细胞的孔中沿孔壁一侧再加入100 µL DMEM，使每孔总体积达到300 µL。按照演示方式轻柔移动培养板，以确保Jurkat细胞在肿瘤细胞上均匀分布。将共培养体系置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养48小时。在CAR表达的Jurkat细胞与CFSE标记的肿瘤细胞共培养后，将培养板轻轻倒置在纸巾上并轻敲，以去除含有CAR-J的上清液。使用多通道移液器向各孔中加入100 µL含碘化丙啶（propidium iodine）或PI的FluoroBrite DMEM培养基，注意不要扰动贴壁的肿瘤细胞。然后向每种肿瘤类型的第一个孔中加入 20 微升 20% Triton X，作为完全裂解对照。将培养板在 37°C 和 5% 二氧化碳条件下孵育 20 分钟，然后进行成像。荧光成像后，使用一个仅含肿瘤细胞的孔来校准绿色荧光通道。为排除孔边缘的细胞，将孔的掩膜缩小至98%。在绿色荧光通道中识别CFSE标记的肿瘤细胞，并调整荧光强度阈值，以捕获孔内所有细胞。将细胞最小直径设置为25微米，以排除CFSE通道中检测到的碎片。然后启用分离接触对象功能，以识别单个细胞。接下来，设置门控以区分活细胞与死细胞群体。选择CFSE标记的细胞，并生成一个直方图，纵轴显示细胞计数，横轴显示平均PI荧光强度。调整横轴数值以更清晰地显示细胞分布，并设置分割线以区分低PI染色细胞和高PI染色细胞。将低PI染色的细胞标记为活细胞。接着，在活细胞上设置另一个直方图，以横轴表示面积，纵轴表示计数。将非碎片细胞标记为大活细胞。然后使用仅含肿瘤细胞的孔绘制另一个分选器，以捕获细胞并过滤碎片。在对整块板完成分析后，导出包含数据的电子表格。绘制大细胞数量的图表，以确定经 CAR-J 处理后孔中残留的活 CFSE 标记肿瘤细胞数量。最后，使用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行统计学分析。CAR-J1 的细胞毒性随着效应细胞与肿瘤细胞比例的升高而增强，在效应细胞与肿瘤细胞比例为4:1时，杀伤率超过50%。针对EGFR的CAR构建体（其铰链区经过修饰）可特异性杀伤表达EGFR的MDA-MB-231细胞，而对EGFR基因敲除细胞则未观察到显著杀伤作用。CAR 结构也在外周血单个核细胞来源的 CD3 T 细胞上表达。然而，含 CD8 铰链区的 EGFR CAR 未见表达。与 IgG 长型和 IgG 中型相比，IgG 短型对 MDA-MB-231 细胞的细胞毒活性最低。

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癌症研究

使用荧光成像快速体外细胞毒性评估表达嵌合抗原受体的 Jurkat

我们介绍一种用于监测非黏附性免疫细胞径向迁移能力的实验方案 体外 使用细胞沉降多联管/载玻片装置，在肿瘤细胞单层或细胞外基质蛋白上追踪细胞迁移。通过明场显微镜和荧光显微镜观察，可评估细胞运动性及细胞毒性功能。...

逆转录病毒复制载体转导的非黏附性同种反应性T淋巴细胞的径向迁移能力与细胞毒性功能

本文介绍一种基于细胞的流式细胞术方法，用于检测中和抗体或其他干扰酶替代疗法在人源性基质（如脑脊液（CSF）或人血清）中细胞摄取的因素。...

利用基于细胞的检测法检测中和酶替代疗法细胞摄取的抗体

我们介绍一种基因组工程工作流程，用于构建可模拟前病毒在特定基因组位点整合的新一代体外HIV-1感染模型。通过CRISPR-Cas9介导的位点特异性基因组编辑，可实现对HIV来源报告基因的靶向整合。本文提供了单细胞克隆生成、筛选及正确靶向验证的详细实验方案。...

基于CRISPR-Cas9的基因组工程构建整合位点特异的HIV-1感染Jurkat报告模型

我们描述了一种定量实时体外细胞裂解检测系统，用于评估靶向液体和实体肿瘤细胞的嵌合抗原受体T细胞的杀伤效力。该方案可扩展用于评估其他免疫效应细胞以及联合治疗方法。...

一种针对实体瘤及血液系统癌细胞的嵌合抗原受体T细胞实时效价检测方法

本文介绍了一种体外共培养方法，用于反复刺激靶向肿瘤的T细胞，从而实现对T细胞抗肿瘤活性的表型和功能分析。...

体外肿瘤细胞再攻击用于预测性评估嵌合抗原受体T细胞的抗肿瘤功能

本方案用于成像免疫突触的形成过程以及随后向免疫突触定向的分泌性物质运输。细胞 conjugates 由经超抗原刺激的 Raji 细胞（作为抗原呈递细胞）与 Jurkat 克隆细胞（作为效应辅助性 T...

成像人类免疫突触

本方案描述了非侵入性追踪经基因工程改造以表达嵌合抗原受体的T细胞的方法学 体内...

动态成像嵌合抗原受体T细胞与[18F]四氟硼酸盐正电子发射断层扫描/计算机断层扫描

本文介绍了一种制备双乳液滴的方法，该液滴包封单个T细胞和一个癌细胞靶标，用于在单细胞水平上研究细胞杀伤作用。该方法能够在大量T细胞中同时定量检测细胞毒性分子和靶细胞的凋亡情况。...

基于液滴的单细胞水平评估嵌合抗原受体T细胞毒性的检测方法

本方案提供了一种标准化的 体外...

利用活细胞成像和流式细胞术定量分析嵌合抗原受体与治疗性抗体增强的自然杀伤细胞毒性

本方案描述了一种快速处理死后弥散性内生型桥脑胶质瘤样本的方法，用于建立患者来源的细胞培养模型，或直接对肿瘤细胞及微环境细胞进行表征。...

一种快速进行弥漫性内生型桥脑胶质瘤（DIPG）死后细胞培养的方案

了解利用荧光成像技术快速评估表达嵌合抗原受体的Jurkat细胞对肿瘤细胞的体外细胞毒性。该方法可在96孔板中同时筛选多种CAR结构，为优化CAR-T细胞治疗提供高通量筛选平台。

快速体外使用荧光成像法评估表达嵌合抗原受体的Jurkat细胞的细胞毒性

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