已修改 体内 用于血管生成研究的基质凝胶栓塞实验

我们的研究涉及血管生成，即从已有血管形成新血管的过程。该过程在多种生理和病理过程中发挥关键作用，例如异常发育、动脉粥样硬化、肿瘤发生等。构建可靠的模型以评估血管生成程度，对于血管生成相关疾病的医学研究或药物发现至关重要。

然而，大多数现有模型较为复杂、昂贵，且需要专用设备。本文介绍一种改良的基质凝胶栓塞实验方法，可无需染色，在单一实验中以更直观且高效的方式研究血管生成和血管通透性。首先配制完全内皮细胞培养基：取460毫升内皮细胞培养基，加入50毫升胎牛血清（FBS）、5毫升青霉素-链霉素双抗溶液以及5毫升内皮细胞生长补充剂。

制备好的培养基可在 4 摄氏度下保存一个月。接下来，在一个含有 0.1 百万个血管细胞的 100 毫米组织培养皿中加入 8 毫升制备好的完全内皮细胞培养基。将细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳条件下培养，直至达到 70% 汇合度。

然后，从培养皿中移除培养基，并用 PBS 洗涤细胞两次，以去除未贴壁的细胞和碎片。移除 PBS 后，向细胞中加入 3 毫升含 2.21 毫摩尔/升 EDTA 的 0.25% 胰蛋白酶，将培养皿置于 37 摄氏度孵育 1 分钟。在光学显微镜下以 40 倍放大倍数观察细胞脱落情况。

用七毫升完全内皮细胞培养基中和胰蛋白酶，并轻轻冲洗细胞脱离培养皿。将收集的细胞悬液转移至15毫升离心管中，在400 × g条件下离心10分钟。弃去上清液后，用五毫升完全内皮细胞培养基重悬细胞。

然后，使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将含有200万个细胞的悬液转移至无菌的1.5毫升离心管中。将悬液在400×g离心5分钟，使细胞沉淀，随后弃去上清液。此时血管细胞已准备好，可与基质凝胶混合用于基质凝胶栓塞实验。

首先，通过将 M199 粉末溶解于 90 毫升去离子水中配制成 10 倍浓度，然后加入 10 毫升胎牛血清（FBS），制备 10 倍 M199 培养基。使用 0.22 微米滤器过滤该溶液。过滤后的培养基可在 4 摄氏度下保存长达两个月。

制备含血管细胞的基质凝胶时，使用约200万个血管细胞。将含有适当制备的细胞沉淀的无菌1.5毫升离心管置于冰浴中冷却。在冰浴中完全解冻基质凝胶，切勿混合或涡旋震荡。

同样，将配制好的10倍M199培养基连同待测试剂或药物一起冷却至4摄氏度。接下来，按照8.8:1.0:0.2的体积比，将预冷的基质胶与含有10%FBS的预冷10倍M199培养基以及预冷的待测试剂混合，制备基质胶混合液。最后，将预冷的细胞轻轻悬浮于400微升（µL）制备好的基质胶混合液中，混匀时需轻柔操作，避免产生气泡。

将含有细胞的基质胶管置于冰上，直至小鼠准备好进行基质胶注射。开始前，将30号1毫升胰岛素注射器放入4°C冰箱中预冷。将新配制的含有血管细胞的基质胶混合物置于冰上，直至小鼠准备好接受注射。

接下来，将适当麻醉的小鼠以俯卧位放置在手术板上，并用胶带固定其四肢。用预冷的胰岛素注射器吸取300 µL基质凝胶混合物，避免产生气泡。使用75%酒精棉片对小鼠背部皮肤进行消毒。

然后，将注射器中的基质胶混合物 300 微升皮下注射到动物背部的一侧。轻柔地从注射部位拔出针头，以防止胶混合物泄漏。确保注射部位形成一个小隆起。

将小鼠置于加热垫上两分钟，使基质凝胶混合物凝固并形成栓塞。重复上述步骤，在小鼠背部另一侧形成栓塞。使用记号笔标记隆起处的边缘。

将动物饲养在20至24摄氏度、12小时光照与12小时黑暗循环的特定病原体阴性实验动物实验室中，持续七天。在基质凝胶注射后第七天，向小鼠注射葡聚糖FITC：将0.5毫克葡聚糖FITC重悬于500微升双蒸水中，充分涡旋混匀，配制成浓度为1微克/微升的葡聚糖FITC溶液。

用29号针头的注射器吸取50 µL的FITC标记葡聚糖溶液。将小鼠固定在尾静脉注射装置上。用75%酒精浸湿的棉球消毒尾部，然后小心地将注射器中的50 µL FITC标记葡聚糖溶液注入尾静脉。

用棉签在注射部位施加压力一分钟，以止血。将小鼠放回笼中，使其休息30分钟后再采集基质凝胶塞。采集凝胶塞时，使用手术剪沿凝胶塞标记边界剪开已处死小鼠的皮肤，并移除覆盖在基质凝胶塞上方的皮肤。

收集凝胶塞，并用含有磷酸盐缓冲液的烧杯冲洗，以去除多余的血液。接着，用约0.5毫升的组织包埋胶覆盖组织包埋盒底部。然后迅速将基质胶塞按预定方向放置在组织包埋胶上。

将凝胶块与额外的组织包埋胶一起包埋。在80摄氏度下固化包埋盒12小时。取出固化后的凝胶块后，使用冷冻切片机切出12微米厚的切片。

然后，将切片置于显微镜载玻片上。