人源干细胞衍生中脑多巴胺能神经元的表型分析

我们构建分化后的人类细胞（如神经元）的表型谱。我们的目标是更深入地理解化学化合物处理对细胞产生的整体效应。表型谱可为后续的机制研究提供更具客观性的切入点。

人源多巴胺能神经元分化方案的质量已显著提升，能够生产出大量同质性的神经元。此外，实验室自动化技术在长期、可重复地处理分化细胞方面的应用日益增多，当然，基于成像的数据获取也变得更加快速和精细。目前面临的一个重大挑战是确保表型特征既可量化又可重复。

为实现这一目标，关键在于生产出均一的神经元批次，并确定一种适合自动化的方案。然而，在自动化方案中，技术可行性与生理相关性之间往往需要权衡。在此，我们找到了一个较好的平衡点。

我们开发了一种即用型解决方案，通过成像方法对人类多巴胺能神经元进行系统表征。该自动化方案以及图像与数据分析流程将帮助更多科研人员建立神经元的表型谱。我们希望更深入地了解单基因遗传型与特发性帕金森病之间的表型谱差异。

我们还希望探究多巴胺能神经元与其他脑细胞类型（例如小胶质细胞）相互作用时表型特征的变化。在接种当天解冻神经元时，将水浴预热至37摄氏度。同时，在避光条件下将完全维持培养基平衡至室温。

同时，从液氮罐中取出含有商品化冷冻神经元的小瓶，转移至干冰上。随后，将小瓶置于37摄氏度水浴中两分钟，以确保完全解冻，接着使用70%乙醇对小瓶进行消毒。使用P1000移液器将小瓶中约370微升解冻后的神经元转移至50毫升离心管中。

用 630 微升完全维持培养基冲洗空瓶，然后使用移液器将培养基以 45 度角逐滴加入 50 毫升离心管中。以类似方式，使用 P1000 移液器向 50 毫升离心管中加入 1 毫升完全维持培养基。随后，缓慢向管中再加入 2 毫升完全维持培养基。

接下来，取10微升的台盼蓝与10微升细胞悬液在微量离心管中混匀。然后将10微升混合液加入细胞计数板中进行细胞计数。完成细胞计数并将神经元转移至15毫升离心管后，在室温下以400 ×g离心5分钟。

随后，移除上清液。使用 P1000 移液器，将神经元沉淀物小心地重悬于一毫升完全维持培养基中。最后，加入适量培养基，以达到在当天接种神经元所需的浓度。

首先，从冰箱中取出预先包被多聚-D-赖氨酸并每孔含有25微升层粘连蛋白的384孔板，在细胞培养罩内将该板平衡至室温，约30分钟。在接种细胞前，使用自动液体处理仪或16通道移液器从每孔中吸出15微升包被液。然后，向每孔中加入50微升细胞悬液，其中含有每毫升300,000个神经元。

为尽量减少可能的边缘效应，请避免在第1、2、23和24列以及A、B、O和P行的孔中加样。将未使用的孔中加入80 µL磷酸盐缓冲液。将培养板置于37 °C、5% CO₂条件下孵育。

将适量的完全维持培养基在室温下预温，并避光保存。使用完全维持培养基配制所需测试浓度的1.5倍浓缩化合物溶液。利用自动移液系统，从含有神经元的培养板每孔中弃去40微升培养基，每孔保留20微升培养基。

然后，每孔加入 40 微升 1.5 倍浓缩的化合物溶液，以达到所需的最终浓度。根据既定方案，成功培养了健康供体或携带 LRRK2 G2019S 突变的中脑多巴胺能神经元六天，并用二甲基亚砜或 LRRK2 激酶抑制剂进行处理。神经元使用核染料以及针对 α-突触核蛋白、酪氨酸羟化酶和 MAP2 的抗体进行染色。

为了处理使用共聚焦荧光显微镜获取的荧光标记神经元图像，可使用 PhenoLink 软件进行图像分割和特征提取。在软件中加载选定的样品板以访问数据，并选择目标图像。对经过照明校正的原始图像进行图像分割时，需调整荧光强度以可视化不同通道。

通过实验为每块培养板确定相应的通道强度阈值，以确保所获得的分割信号与原始图像中的信号一致，并最大限度地减少背景信号。为了区分活细胞与死细胞，需设定细胞核大小和强度的阈值。通过双击测量细胞核大小，并查看显示的强度。

使用40倍图像时，保持默认参数并运行处理流程。根据生成的表格定量数据，构建表型谱以比较不同的细胞系或处理条件。使用Jupyter软件逐个执行Jupyter笔记本中的单元格，以生成和可视化表型谱。

对图像进行分割并提取了表型特征。共确定了126个可整合为基于孔板的表型谱的定量特征。部分特征在化合物处理后显示出变化。

例如，在使用 LRRK2 激酶抑制剂 PFE-360 处理后，酪氨酸羟化酶（TH）阳性细胞中的 α-突触核蛋白荧光强度降低。其他特征，如 MAP2 神经突网络长度或 TH 阳性神经元的比例，在不同测试细胞系之间存在差异，但在化合物处理后未表现出显著变化。