通过整合实现骨形成 体内 利用间充质干细胞进行软骨内成骨

我们的研究旨在开发一种能够改善血流不足并适用于大段骨缺损的治疗方法。本文所展示的方案即为我们实现这一目标所采用的方法。该方法利用人工软骨鞘促进骨形成，其结构模拟了胚胎发育过程中散在发育的自然过程。

这种方法在骨再生研究中相对较新。它具有诱导铁新生的优势，而目前临床实践中除带血管骨移植外，尚无其他方法能够实现这一点。传统上，骨再生研究采用的技术是单独或联合使用干细胞、生物材料和生长因子。

通过植入人工软骨实现骨形成的方法，采用了一种将干细胞与作为支架材料的生物材料混合并诱导其向软骨分化的技术。在临床上修复患者的骨缺损需要大量高质量的人工软骨。本方案解决了如何制备高质量人工软骨，以及如何使多个软骨相互融合形成完整骨骼的难题。

我们的方案有助于使用比其他使用或不使用支架材料来制造人工软骨的方案更少的细胞，生成更大、质量更高的软骨。此外，即使在体内植入多个片段，该方案也能形成一块完整的整合性骨组织。这一点非常重要，因为制备形状和尺寸适合骨缺损的临床用软骨是不切实际的。

首先用胰蛋白酶处理人源间充质干细胞，制备成细胞悬液。接着将细胞悬液分装至1.5毫升离心管中，以制备10个构建物。在220 ×g条件下离心3分钟后，使用真空泵吸除上清液。

现在，将细胞沉淀置于冰上。接下来，将巯基修饰的透明质酸、巯基反应性交联剂、聚乙二醇二丙烯酸酯和脱气水瓶恢复至室温。在无菌条件下，使用带针头的注射器向含有透明质酸的瓶子中加入一毫升脱气水。

涡旋溶液，偶尔加热至37摄氏度，直至溶液变澄清，然后将溶液置于冰上。在无菌条件下，向交联剂瓶中加入0.5毫升脱气水。反复倒置使其溶解，然后置于冰上。

现在，向分装的细胞沉淀中加入 120 µL 溶解的透明质酸溶液，并通过反复吹打重悬细胞沉淀。向含有重悬细胞沉淀的离心管中加入 30 µL 溶解的交联剂溶液。通过轻弹管壁确保充分混匀。

混合后，短暂离心溶液。取15微升混合溶液滴加到涂有石蜡的24孔板上。于37摄氏度孵育30分钟，使其凝固。

进行体外分化时，向接种细胞的水凝胶中加入 0.5 毫升软骨诱导分化培养基。三周后，更换为肥大软骨细胞分化培养基，每孔加入 0.5 毫升。软骨诱导分化在透明质酸（HA）和胶原构建物中均产生了硫酸化糖胺聚糖和 II 型胶原阳性的细胞外基质。

然而，透明质酸支架中的细胞分布更为均一。胶原支架则显示出具有异质形态的周边细胞。透明质酸支架中细胞的平均圆度高于胶原支架中的细胞。

在五周时，两种构建物的外缘均检测到钙沉积。在体内HA构建物中，所有植入物在皮下囊袋中相互连接，并形成了整合的骨组织。40%的体内胶原构建物保持独立。

在植入后八周，两种体内构建物的外周区域均形成了具有层状形态的类骨组织。在HA构建物中还观察到软骨的丢失。多个体内HA构建物似乎形成了整合的骨组织，表现为骨组织之间的连接以及存在关节纤维组织。

尽管40%的胶原构建体已融合，但其余构建体彼此分离，或仅有连接而无骨组织相连。两种构建体的骨髓中均可见呈阳性标记的血管，内部软骨被多核破骨细胞所包围。矿化物质沉积于两种构建体的外层类骨质区域，由于HA构建体体积较大，其矿化体积更高。