Name: 使用密度梯度离心从人粪便中分离和纯化细菌胞外囊泡 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: 学习使用密度梯度离心法从人粪便中分离纯化细菌胞外囊泡。该方法将离心时间从18小时缩短至7小时，有效减少脂蛋白污染，为细菌胞外囊泡研究提供标准化方案。

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本工作由以下机构资助： 国家杰出青年科学基金（82025024）；&#160;国家自然科学基金重点项目（82230080）；&#160;国家重点研发计划&amp;中国国家重点研发计划（2021YFA1300604）；国家自然科学基金（81871735、82272438 和 82002245）；&#160;中国广东&#160;自然科学基金&#160;用于&#160;杰出青年学者（2023B1515020058）；&#160;广东省自然科学基金（2021A1515011639）；&#160;中国山东省自然科学基金重大基础研究发展计划（ZR2020ZD11）；&#160;中国博士后科学基金（2022M720059）；南方医科大学南方医院优秀青年发展计划（2022J001）。

本研究经南方医科大学南方医院伦理委员会批准，并在取得参与者知情同意后进行。本研究所采用的所有方法均遵循国际人类微生物组标准（IHMS：&#160;http://www.microbiome-standards.org/）提供的标准操作指南。所有后续液体操作步骤均须在生物安全柜或超净工作台内进行。
1. 粪便样本的采集与分装
<ol>
	<li>向参与者分发粪便采样器、密封袋和冰盒，并提供详细的指导，说明如何采集和保存样本。</li>
	<li>指导每位参与者使用提供的采样器收集粪便样本，并在24小时内将样本运送至实验室，运输过程中保持温度为4 °C。</li>
	<li>样本送达实验室后，使用无菌勺将少于3.5 g的粪便分装至已预先称重的50 mL离心管中。在管壁上标注粪便样本的重量，以供后续预处理步骤使用。 
	暂停点：若无法立即处理样本，应在做好相应记录后，将样本置于-80 °C长期保存。</li>
</ol>
2. 粪便样本制备
<ol>
	<li>将500 mL磷酸盐缓冲液（PBS）置于4 °C预冷。使用50 mL注射器将预冷的PBS通过0.22 µm聚醚砜（PES）滤膜过滤，分装至十个50 mL离心管中。</li>
	<li>将两个50 mL离心管置于冰上，每管加入3.5 g粪便样本。向每管中加入35 mL PBS。 
	注意：根据粪便溶解所需计算PBS用量，确保样本浓度不超过10%（w/v）。若处理更多样本，可根据需要增加离心管数量。</li>
	<li>在4 °C、300 rpm条件下振荡样本2小时，或在4 °C静置至少8小时，直至粪便完全可见地悬浮于溶液中。</li>
</ol>
3. 差速离心
<ol>
	<li>将高速冷冻离心机预冷至 4 °C。</li>
	<li>用 PBS 调节步骤 2.3 中制备的两个样品管的重量，使其总重量达到 0.1 g。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 3,000 × g 离心 20 分钟。</li>
	<li>小心用移液器将上清液转移至两个洁净的 50 mL 离心管中，保留约 1 mL 液体在沉淀上方。此过程使用一次性塑料巴斯德吸管。</li>
	<li>用 PBS 调节两个管的重量，使其总重量在 ± 0.1 g 范围内。</li>
	<li>将转移的上清液在 4 °C 条件下，以 12,000 × g 离心 30 分钟。</li>
	<li>使用 20 mL 注射器吸取上清液，取下注射器针头，通过 0.22 µm 滤膜过滤至 50 mL 管中。此时，上清液体积应约为 30 mL。 
	&#8203;注意：若在 12,000 × g 离心后仍可见大量杂质，则需在 4 °C 条件下重复以 12,000 × g 离心 30 分钟的步骤。若不进行此操作，可能导致过滤过程中因孔隙堵塞而造成 BEV 的显著损失。</li>
</ol>
4. 超高速离心
<ol>
	<li>用75%（v/v）酒精擦拭转子和吊桶，以去除任何残留污染物。</li>
	<li>将一支38.5 mL超速离心管放入试管架中。 
	注意：根据样品体积选择合适的超速离心管。避免使用产品说明书中标明不适用的紫外线或化学试剂对离心管进行灭菌。</li>
	<li>从步骤3.7中转移约30 mL过滤后的粪便上清液至超速离心管中。</li>
	<li>向超速离心管中加入约8 mL PBS，使液面距离管口留有3 mm的间隙。</li>
	<li>将装有样品的两支超速离心管分别置于相对位置的离心吊桶中，例如，1号对应4号（1-4）、2-5、3-6。</li>
	<li>使用PBS调节两个吊桶的重量，使其总重量差异在±0.005 g以内。</li>
	<li>无论是否装载离心管，均将所有吊桶安装到转子上。</li>
	<li>启动真空，于4 °C条件下以160,000 × g 离心70分钟。</li>
	<li>释放腔体真空，待仪器&#160;Home&#160;页面显示&#160;Ready&#160;后，打开舱门。&#160;</li>
	<li>从超速离心机中取出转子。</li>
	<li>将吊桶从转子转移至支架上，并使用镊子取出离心管。</li>
	<li>弃去上清液，管底可见明显的棕褐色沉淀。</li>
	<li>使用1,000 µL移液器吸取1 mL预冷（4 °C）PBS，反复吹打沉淀使其充分重悬。随后用PBS补至约37 mL，使液面距离管口留有3 mm的间隙。</li>
	<li>按照步骤4.5–4.11再次进行超速离心，于4 °C条件下以160,000 × g 离心70分钟，以去除附着在管壁上的部分杂质成分。</li>
	<li>弃去上清液，将两支超速离心管倒置5分钟，并用擦拭纸清除内壁残留液体。 
	注意：清洁内壁可最大限度减少残余污染物对BEV分析的干扰，尤其在颗粒尺寸方面。应选择不会影响BEV分析结果的擦拭纸。</li>
	<li>使用1,000 µL移液器吸取1.2 mL预冷（4 °C）PBS，反复吹打每支管中的沉淀，使其重悬。</li>
	<li>将一支超速离心管中的1.2 mL PBS/BEV溶液转移至一支洁净的1.5 mL微量离心管中。 
	暂停点：从一支超速离心管中收集的PBS/BEV溶液可继续进行步骤6。另一管溶液应储存于-80 °C。</li>
</ol>
5. 密度梯度离心溶液的制备
<ol>
	<li>0.02 M HEPES 缓冲液的制备
	<ol>
		<li>将 0.477 g HEPES 粉末和 0.8 g NaCl 加入 90 mL 去离子灭菌水中混合。</li>
		<li>通过加入 1 M 氢氧化钠（NaOH）调节 pH 至 7.2。用去离子水定容至 100 mL，并通过 0.22 µm PES 膜过滤溶液。 
		注意：氢氧化钠为强腐蚀性碱类物质。操作人员必须在通风橱中小心操作和配制。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>密度梯度缓冲液的制备
	<ol>
		<li>根据用于密度梯度离心的超速离心管数量（步骤 6）计算每种密度梯度缓冲液所需的体积（在本方案中，60%、50%、40%、20% 和 10% 梯度溶液的体积分别为 2.5 mL、3 mL、6 mL、6 mL 和 6 mL）。</li>
		<li>配制 50%（w/v）碘克沙醇工作液时，按体积比 1:5（0.5 mL:2.5 mL）混合 0.02 M HEPES 缓冲液与 60%（w/v）碘克沙醇储备液。 
		注意：使用一次性 20 mL 注射器吸取碘克沙醇储备液，避免引入空气。</li>
		<li>为配制不同浓度的碘克沙醇缓冲液，使用 1,000 µL 移液器按照 表 1 所示比例，将步骤 5.2.2 中获得的 50% 碘克沙醇工作液与步骤 5.1 中获得的 HEPES 缓冲液混合。 
		&#8203;注意：步骤 5 应在关闭光源的超净工作台中进行。打开的碘克沙醇储备液应于 4 °C 冰箱中保存，以防细菌生长。碘克沙醇溶液和 HEPES 缓冲液均需避光保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 建立密度梯度离心系统
<ol>
	<li>自上而下密度梯度离心模式
	<ol>
		<li>将第4步分离得到的500 µL PBS/BEV溶液与3 mL PBS混合。使用1,000 µL移液器轻轻混匀，得到3.5 mL PBS/BEV溶液。</li>
		<li>将一个31 mL超速离心管放置在带孔的泡沫板上，并标记为“↓”。</li>
		<li>使用1,000 µL移液器垂直将3 mL 50%碘克沙醇溶液加入离心管底部。</li>
		<li>将离心管倾斜至70°角，并将试管架或其他支撑物置于泡沫板水平略上方，位于管口下方。</li>
		<li>使用1,000 µL移液器将3 mL 40%碘克沙醇溶液加至50%碘克沙醇溶液上方。</li>
		<li>使用1,000 µL移液器将3 mL 20%碘克沙醇溶液加至40%碘克沙醇溶液上方。</li>
		<li>使用1,000 µL移液器将3 mL 10%碘克沙醇溶液加至20%碘克沙醇溶液上方。</li>
		<li>使用1,000 µL移液器将6.1.1步得到的3.5 mL PBS/BEV溶液加至10%碘克沙醇溶液上方。</li>
		<li>轻轻将离心管恢复至直立位置。 
		注：移液完成后应可见分层现象。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>自下而上密度梯度离心模式
	<ol>
		<li>将一个31 mL超速离心管放置在带孔的泡沫板上，并标记为“↑”。</li>
		<li>使用1,000 µL移液器垂直将2.5 mL 60%碘克沙醇储备液加入离心管底部。再加入第4步分离得到的500 µL PBS/BEV溶液，轻轻混匀，得到3 mL 50%碘克沙醇/BEV溶液。</li>
		<li>将离心管倾斜至70°角，并将试管架或其他支撑物置于泡沫板水平略上方，位于管口下方。</li>
		<li>使用1,000 µL移液器将3 mL 40%碘克沙醇溶液加至50%碘克沙醇/BEV溶液上方。</li>
		<li>使用1,000 µL移液器将3 mL 20%碘克沙醇溶液加至40%碘克沙醇溶液上方。</li>
		<li>使用1,000 µL移液器将3 mL 10%碘克沙醇溶液加至20%碘克沙醇溶液上方。</li>
		<li>使用1,000 µL移液器将3.5 mL PBS加至10%碘克沙醇溶液上方。</li>
		<li>轻轻将离心管恢复至直立位置。</li>
		<li>此时，第4.17步获得的悬浮液剩余200 µL，可作为名为 &#34;UC&#34; 的组别进行后续分析。 
		&#8203;注：在第6步转移溶液时，移液器吸头应始终紧贴超速离心管管壁，并与管轴垂直。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 密度梯度离心与组分收集
<ol>
	<li>用 PBS 调节两个离心管的重量，使总重量在 ± 0.005 g 范围内。</li>
	<li>按照步骤 4.5 将离心管放入转子吊桶中，在 4 °C 条件下以 160,000 × g 离心 7 小时。</li>
	<li>使用移液器（1000 µL）从管壁一侧由上至下依次收集组分，顺序为：3 mL、2 mL、1 mL、1 mL、1 mL、1 mL、1 mL、1 mL、1.5 mL 和 3 mL，收集至一支 38.5 mL 超速离心管中。 
	&#8203;注意：保持视线与液面处于同一水平。</li>
	<li>对步骤 7.3 中获得的每一份组分，按照步骤 4 的条件在 4 °C 下以 160,000 × g 进行超速离心 70 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，并将超速离心管倒置 5 分钟。</li>
	<li>用 200 µL 移液器将沉淀重悬于 200 µL 预冷（4 °C）的 PBS 中。</li>
	<li>将 PBS/BEV 溶液转移至一支洁净的 1.5 mL 微量离心管中。</li>
	<li>将组分标记为 F1 至 F10，并根据步骤 8 进行分析。 
	暂停点：若步骤 7.8 中获得的样品无法立即处理，可于 -80 °C 保存。</li>
</ol>
8. 收集组分的表征与定量分析
<ol>
	<li>使用微孔板检测仪，以空白对照测定各组分的吸光度值（OD 340 nm），并计算其相应的密度。 
	注意：将 PBS/BEV 溶液（步骤 6.1.1 和步骤 6.2.2）替换为 PBS，以建立空白对照。
	<ol>
		<li>根据 50% 储备液（步骤 5.2.2），用 0.02 M HEPES 将碘克沙醇溶液稀释为 0%、5%、10%、12.5% 和 20% 的溶液，每种各取 100 µL 作为标准品，其对应的密度分别为 1.0058 g/mL、1.0318 g/mL、1.058 g/mL、1.0708 g/mL 和 1.111 g/mL。</li>
		<li>将空白对照（步骤 7.3 制备）的每种组分各取 50 µL，以及步骤 8.1.1 制备的每种标准溶液各取 50 µL，分别加入 96 孔板的复孔中。</li>
		<li>将波长设为 340 nm，测定终点光密度，并计算各组分的密度。</li>
		<li>根据密度确定 F4–F9 为 BEV 组分的范围。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用二辛可宁酸法（BCA）测定 BEV 组分的蛋白浓度。
	<ol>
		<li>按照生产商提供的 PBS 将物质稀释十倍，制备成 0.5 µg/µL 的标准蛋白溶液。</li>
		<li>根据试剂说明书，向 96 孔板各孔中加入不同体积的步骤 8.2.1 制备的标准蛋白溶液，并用 PBS 补足至每孔总体积为 20 µL。</li>
		<li>向各孔中分别加入步骤 7.8 制备的样品以及步骤 6.2.9 定义的超速离心（UC）后剩余的样品各 20 µL。</li>
		<li>将试剂 A 和试剂 B 按 50:1 的比例混合，每孔转移 200 µL。</li>
		<li>将 96 孔板置于 37 °C 水浴中孵育 30 分钟。</li>
		<li>使用微孔板读数仪测定吸光度值，根据步骤 8.2.2 中稀释的标准溶液所生成的标准曲线（x：光密度；y：蛋白浓度）计算样品的蛋白浓度（µg/µL），并确定样品的蛋白含量（µg）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用透射电子显微镜（TEM）对步骤 8.1.4 定义的 BEV 组分进行表征，以验证 BEVs 的存在。以下所有操作均应在冰上进行。
	<ol>
		<li>将步骤 7.8 分离得到的 F4–F9 各组分以及步骤 6.2.9 定义的超速离心后剩余的样品各取 10 µL，滴加至 Formvar/碳支持铜网上，孵育 20 分钟，用滤纸吸去多余液体。</li>
		<li>用 100 µL PBS 洗涤样品三次，每次 1 分钟，用滤纸吸去液体。</li>
		<li>用 100 µL 1%（w/v）戊二醛固定样品 5 分钟，用滤纸吸去液体。</li>
		<li>用 100 µL PBS 洗涤铜网十次，每次 2 分钟，用滤纸吸去液体。</li>
		<li>用 50 µL 1.5%（w/v）醋酸铀染色 10 分钟，用滤纸吸去液体。 
		注意：醋酸铀具有放射性，接触皮肤或吸入时具有极高毒性。操作含醋酸铀的溶液时应在通风橱中进行，并采取适当的安全防护措施。</li>
		<li>将铜网转移至 1%（w/v）甲基纤维素液滴中 5 分钟，用滤纸吸去液体。</li>
		<li>将风干后的铜网置于避光、无尘环境中保存，直至观察。</li>
		<li>使用透射电子显微镜拍摄图像并进行分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用纳米颗粒追踪分析（NTA）对步骤 8.1.4 定义的 BEV 组分进行表征，以计数颗粒数量。
	<ol>
		<li>使用 110 nm 聚苯乙烯颗粒校准系统。</li>
		<li>用 PBS 清洗样品池。</li>
		<li>将步骤 7.8 获得的不同组分样品以及步骤 6.2.9 定义的超速离心后剩余的样品稀释至浓度范围为 105–109 颗粒/mL，最佳浓度为 107 颗粒/mL。</li>
		<li>在 23–30 °C 温度范围内，记录并分析 11 个位置的数据，每个位置重复三次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过考马斯亮蓝染色（CBBS）和蛋白质印迹（WB）分析样品的蛋白组成。
	<ol>
		<li>若需定量，使用 PBS 和 5 × 上样缓冲液将步骤 7.8 获得的不同组分 BEV 样品以及步骤 6.2.9 定义的超速离心后剩余的样品稀释至终浓度为 0.5 或 1 µg/µL，确保步骤 8.5.2 中每孔上样量足够（20 µL，即 10 µg 或 20 µg）。将样品在 95 °C 下煮沸 10 分钟。</li>
		<li>将预制聚丙烯酰胺凝胶组装至电泳槽中，并将样品加入加样孔。</li>
		<li>进行垂直电泳，参数设置为：160 V，50 分钟。</li>
		<li>将凝胶置于考马斯亮蓝染色液中染色 1 小时，用去离子水冲洗至蓝色背景变浅，用相机拍摄图像。</li>
		<li>对其他凝胶进行蛋白转膜，参数设置为：400 mA，20 分钟。</li>
		<li>用 5%（w/v）BSA 溶液在室温下封闭转印膜 1 小时。</li>
		<li>用 TBST 缓冲液洗涤膜三次，每次 5 分钟。</li>
		<li>在 4 °C 下，用一抗（BEV 标记物：LPS、OmpA、LTA；EEV 标记物：CD63、CD9、TSG-101、Syntenin、Integrin β1；其他污染标记物：Flagellin、Calnexin）孵育膜 8–12 小时。</li>
		<li>用 TBST 缓冲液洗涤膜三次，每次 10 分钟。</li>
		<li>在室温下，用二抗孵育膜 1 小时。</li>
		<li>重复步骤 8.5.9。</li>
		<li>使用化学发光装置显影转印膜。</li>
		<li>将 PBS/BEV 溶液（步骤 6.1.1 和步骤 6.2.2）替换为大肠杆菌（Escherichia coli）来源的 BEVs，建立阳性对照（参见材料表中粗提 E. coli-BEVs 的操作流程），并完成上述所有实验以表征 BEVs。 
		暂停点：根据上述表征结果，确定 F6–F8 为富含 BEV 的组分分布范围，并在后续分析中使用此缩小后的范围。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>计算颗粒和蛋白的回收率，以评估两种密度梯度离心（DGC）模式的效率。以下结果以百分比形式表示。
	<ol>
		<li>计算自上而下（Top-down）模式的颗粒回收率：F6–F8 中的总颗粒数 / 步骤 6.2.9 定义的超速离心后颗粒数。</li>
		<li>计算自下而上（Bottom-up）模式的颗粒回收率：F6–F8 中的总颗粒数 / 步骤 6.2.9 定义的超速离心后颗粒数。</li>
		<li>计算自上而下（Top-down）模式的蛋白回收率：F6–F8 中的总蛋白含量（µg）/ 步骤 6.2.9 定义的超速离心后蛋白含量（µg）。</li>
		<li>计算自下而上（Bottom-up）模式的蛋白回收率：F6–F8 中的总蛋白含量（µg）/ 步骤 6.2.9 定义的超速离心后蛋白含量（µg）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>计算颗粒/蛋白比值，以评估超速离心（UC）及两种 DGC 模式传统定义的纯度，以下结果均以百分比形式表示。
	<ol>
		<li>步骤 6.2.9 定义的超速离心后的颗粒/蛋白比值：超速离心后颗粒数 / 超速离心后蛋白含量（µg）。</li>
		<li>自上而下（Top-down）模式的颗粒/蛋白比值：F6–F8 中的总颗粒数 / F6–F8 中的蛋白含量（µg）。</li>
		<li>自下而上（Bottom-up）模式的颗粒/蛋白比值：F6–F8 中的总颗粒数 / F6–F8 中的蛋白含量（µg）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>选择最适合粪便 BEV 纯化及后续分析的离心模式（本方案中选择自上而下模式）。</li>
</ol>

Enhanced Bacterial Extracellular Vesicles Isolation for Microbiota Multi-Omics

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作者声明不存在利益冲突。

细菌胞外囊泡（BEVs）是由细菌分泌的脂质双层纳米颗粒，携带大量蛋白质、脂质、核酸及其他生物活性分子，有助于介导细菌的功能效应20。源自肠道的BEVs已被证实参与炎症性肠病、克罗恩病和结直肠癌等疾病的发生发展，同时还影响整体代谢并介导认知功能障碍4,16,17,20,21,22,23,24,25,26。目前，从人体样本——粪...

肠道被广泛认为是人体内定植微生物群落最丰富的器官，其中参与定植和增殖的细菌超过90%1,2。大量证据表明，肠道微生物群通过受损的肠屏障调节肠道微环境，并与远端器官的功能障碍发生相互作用3,4。越来越多的研究表明，肠道微生物群失衡与炎症性肠病（IBD）的进展5,6以及通过肠-脑轴介导的认知障碍密切相关5,6,7,8。细菌产生的细菌胞外囊泡（BEVs）在这些病理过程中发挥着重要作用。
细菌外膜囊泡（BEVs）是包裹细菌衍生物的纳米级颗粒，直径范围为20至400 nm。研究表明，这些颗粒能够促进细菌与其宿主生物之间的相互作用9,10。尽管无法直接观察到，但由于其在诊断生物标志物、治疗靶点和药物递送载体方面的广阔应用前景，这些颗粒已引起研究人员越来越多的关注11。人类粪便常被用作研究BEVs的生物样本，主要来源于肠道细菌，其中含有水、细菌、脂质、蛋白质、未消化的食物残渣以及脱落的上皮细胞等复杂混合物。粪便成分的复杂性给BEVs的分离和纯度带来了挑战，从而阻碍了对BEVs进行全面、客观和真实地分析。因此，如何有效减少污染物成分的干扰并提高BEVs的得率，已成为亟待解决的关键问题。
现有的分离策略主要依赖于超高速离心（UC）、密度梯度离心（DGC）和尺寸排阻色谱（SEC）等技术12,13,14,15,16,17。目前，DGC 是细菌胞外囊泡（BEV）分离领域应用最广泛的方法之一，包含两种沉降-漂浮模式：&#34;Top-down&#34; 和 &#34;Bottom-up&#34;，其模式由样品的初始加样位置决定。这些方法基于大小和密度差异将细胞外囊泡（EVs）与其他成分区分开来，但所得纯度和回收率存在差异。先前的研究表明，单一方法难以充分将体液样本中的EVs与可溶性蛋白质（如血液中的脂蛋白18和尿液中的Tamm-Horsfall蛋白19）有效分离。此外，真核细胞来源的细胞外囊泡（EEVs）的尺寸分布常与BEVs重叠，因此需要进一步优化方法以提高BEV的得率。因此，推进BEV研究的关键在于发展高效分离与纯化技术。值得注意的是，Tulkens 等人15采用正交生物物理策略实现了粪便BEVs与EEVs的分离，其中Bottom-up DGC模式的离心时间长达18小时。相比之下，本研究将其缩短至7小时，显著节省了梯度超速离心时间并简化了操作流程。
在本研究中，我们通过一系列从低速到超高速的差速离心富集细菌外膜囊泡（BEVs）后，在优化的缓冲条件下采用两种密度梯度离心（DGC）模式对粪便来源的BEVs进行了分离与纯化。基于形态学、粒径及浓度的评估结果表明，该改进方法具有良好的分离效果。本研究可为未来的研究奠定基础，将其应用拓展至更广泛的领域，并有助于揭示人体内BEVs的异质性特征，同时也促进了BEV分离与分析技术的标准化进程。

<table><tbody><tr><td>1 %（w/v）戊二醛（用去离子水将2.5 %储备液稀释配制）</td><td>ACMEC</td><td>AP1126</td><td>在步骤8.3.3中使用透射电子显微镜对BEV进行形态学观察</td></tr><tr><td>1 %（w/v）甲基纤维素（以去离子水从原始粉末配制）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7027</td><td>在步骤 8.3.6 中使用透射电子显微镜对 BEV 进行形态学观察</td></tr><tr><td>1.5 % (w/v) 醋酸铀酰（用去离子水从原始粉末配制）</td><td>Polysciences</td><td>21447-25</td><td>在步骤8.3.5中使用透射电子显微镜对BEV进行形态学观察</td></tr><tr><td>1000 &amp;mu;L，200 &amp;mu;L, 10 &amp;mu;L 移液管</td><td>KIRGEN</td><td>KG1313, KG1212, KG1011</td><td>转移溶液</td></tr><tr><td>5 %（w/v）牛血清白蛋白溶液（用TBST缓冲液将原始粉末配制而成）</td><td>Fdbio 科学</td><td>FD0030</td><td>用于第 8.5.6 步的 Western 印迹封闭</td></tr><tr><td>5 &amp;times; 上样缓冲液</td><td>Fdbio 科学</td><td>FD006</td><td>在第8.5.1步中用于蛋白质印迹和考马斯亮蓝染色</td></tr><tr><td>75 % (v/v) 乙醇</td><td>LIRCON</td><td>LIRCON-500 mL</td><td>表面消毒</td></tr><tr><td>96孔板</td><td>Rar</td><td>A8096</td><td>测定吸光度值&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>抗钙联蛋白抗体</td><td>Abcam</td><td>ab92573</td><td>蛋白质印迹（一抗）</td></tr><tr><td>抗CD63抗体</td><td>Abcam</td><td>ab134045</td><td>Western 印迹（一抗）</td></tr><tr><td>抗CD9抗体</td><td>Abcam</td><td>ab236630</td><td>蛋白质印迹（一抗）</td></tr><tr><td>抗鞭毛蛋白抗体</td><td>Sino Biological</td><td>40067-MM06</td><td>蛋白质印迹（一抗）</td></tr><tr><td>抗整合素β1抗体</td><td>Abcam</td><td>ab30394</td><td>蛋白质印迹（一抗）</td></tr><tr><td>抗LPS抗体</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>MA1-83152</td><td>蛋白质印迹（一抗）</td></tr><tr><td>抗LTA抗体</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>MA1-7402</td><td>蛋白质印迹（一抗）</td></tr><tr><td>抗OmpA抗体</td><td>CUSABIO</td><td>CSB-PA359226ZA01EOD，https://www.cusabio.com/</td><td>蛋白质印迹（一抗）</td></tr><tr><td>抗Syntenin抗体</td><td>Abcam</td><td>ab133267</td><td>蛋白质印迹（一抗）</td></tr><tr><td>抗TSG101抗体</td><td>Abcam</td><td>ab125011</td><td>蛋白质印迹（一抗）</td></tr><tr><td>高压灭菌</td><td>ZEALWAY</td><td>GR110DP</td><td>实验所用物品和培养基的灭菌</td></tr><tr><td>平衡</td><td>Mettler Toledo</td><td>AL104</td><td>用PBS平衡已加样的离心管</td></tr><tr><td>二辛可宁酸法测定&amp;nbsp;</td><td>Fdbio 科学</td><td>FD2001</td><td>在步骤 8.2 测定 BEVs 的蛋白质含量</td></tr><tr><td>BioRender</td><td>BioRender</td><td>https://app.biorender.com</td><td>制备图1所示的BEVs分离与纯化的示意图工作流程</td></tr><tr><td>生物安全柜</td><td>Haier</td><td>HR1200-II B2</td><td>进行粪便样本处理的相关操作</td></tr><tr><td>Centrifuge 5810 R；转子 F-34-6-38</td><td>Eppendorf</td><td>5805000092；5804727002，适配器：5804774000</td><td>BEVs 预处理（步骤 3）</td></tr><tr><td>化学发光装置</td><td>BIO-OI</td><td>OI600SE-MF</td><td>用于第 8.5.12 步 Western 印迹中的信号检测</td></tr><tr><td>Cytation 5</td><td>BioTek</td><td>F01</td><td>用于测量吸光度（步骤 8.1）和荧光值（图 6）的微孔板检测仪&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dil标记的低密度脂蛋白</td><td>ACMEC</td><td>AC12038</td><td>干扰组分分布的定义&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>电泳设备</td><td>Bio-rad</td><td>1658033</td><td>用于第8.5.2、8.5.3和8.5.5步的蛋白质印迹实验中的蛋白质分离与转膜</td></tr><tr><td>增强型化学发光HRP试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Fdbio科学</td><td>FD8020</td><td>用于第8.5.12步的Western印迹信号检测</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;大肠杆菌&amp;nbsp;&lt;/em&gt;</td><td>美国典型培养物保藏中心</td><td>ATCC8739</td><td>以BEVs作为阳性对照进行分离。方案：将25 g LB培养基粉末溶解于1 L去离子水中，高压灭菌。转移800 &amp;mu;将保存的 L 型大肠杆菌接种至培养基中。37 ℃培养 &amp;deg;在培养摇床中孵育。然后在3,000离心 &amp;times; 4℃下20分钟2000 × g离心 &amp;deg;C, 12, 000 &amp;times; 4℃下30分钟3000 × g离心 &amp;deg;C，将上清液通过0.22 μm滤膜过滤 &amp;mu;m 膜，并在 160,000 下进行超速离心 &amp;times; 4℃下70分钟离心，转速为g &amp;deg;C. 将定义为大肠杆菌粗提BEV的沉淀重悬于1.2 mL PBS中（步骤3、4）。&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>50 mL Falcon管</td><td>KIRGEN</td><td>KG2811</td><td>BEVs 预处理（步骤 3）</td></tr><tr><td>甲胎蛋白染色缓冲液</td><td>AbSci</td><td>ab.001.50</td><td>第8.5.4步考马斯亮蓝染色</td></tr><tr><td>滤纸</td><td>Biosharp</td><td>BS-TFP-070B</td><td>在步骤 8.3（吸取溶液）中使用透射电子显微镜对 BEV 进行形态学观察</td></tr><tr><td>铜网，Formvar/碳膜支持&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TEM-FCF200CU50</td><td>在步骤8.3中使用透射电子显微镜对BEV进行形态学观察</td></tr><tr><td>HEPES 粉末</td><td>Meilunbio</td><td>MB6078</td><td>制备不同浓度的碘克沙醇缓冲液用于密度梯度离心</td></tr><tr><td>HRP AffiniPure 山羊抗小鼠 IgG（H+L）</td><td>Fdbio 科学</td><td>FDM007</td><td>蛋白质印迹（二抗）</td></tr><tr><td>HRP AffiniPure 山羊抗兔 IgG（H+L）</td><td>Fdbio 科学</td><td>FDR007</td><td>蛋白质印迹（二抗）</td></tr><tr><td>摇床培养箱</td><td>Qiangwen</td><td>DHZ-L</td><td>培养大肠杆菌&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Kimwipes&amp;trade; 精细操作擦拭布</td><td>Kimtech Science</td><td>34155</td><td>在步骤 4.15 中擦拭超速离心管的内壁</td></tr><tr><td>LB肉汤</td><td>Hopebio</td><td>HB0128</td><td>培养大肠杆菌&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>低温冰箱（-80） &amp;deg;C)</td><td>Haier</td><td>DW-86L338J</td><td>储存样品</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Alalddin</td><td>M116118</td><td>用于第8.5.5步Western blot实验中PVDF膜的活化</td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>KIRGEN</td><td>KG2211</td><td>密度梯度离心后回收组分</td></tr><tr><td>2 mL 微量离心管</td><td>KIRGEN</td><td>KG2911</td><td>密度梯度离心后回收组分</td></tr><tr><td>5 mL 微量离心管</td><td>BBI</td><td>F610888-0001</td><td>密度梯度离心后回收组分</td></tr><tr><td>酶标仪&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>Multiskan MK3</td><td>在步骤 8.2 测定 BEVs 的蛋白质含量</td></tr><tr><td>Millipore 滤膜 0.22 &amp;mu;m</td><td>默克密理博</td><td>SLGP033RB</td><td>过滤除菌；材质：聚醚砜，PES</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>GHTECH</td><td>1.01307.040</td><td>密度梯度离心液</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>GHTECH</td><td>1.01394.068</td><td>密度梯度离心溶液（pH 调整）</td></tr><tr><td>Optima&amp;trade; XPN-100</td><td>贝克曼库尔特</td><td>A94469</td><td>第4步和第7步中用于BEVs分离的超速离心</td></tr><tr><td>OptiPrep&amp;trade;</td><td>Serumwerk Bernburg AG</td><td>1893</td><td>密度梯度离心储备液</td></tr><tr><td>轨道摇床</td><td>尤宁</td><td>CS-100</td><td>在步骤2中溶解粪便</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Procell</td><td>PB180327</td><td>在第2步溶解粪便</td></tr><tr><td>移液器</td><td>Eppendorf</td><td>3120000267, 3120000259</td><td>转移溶液</td></tr><tr><td>塑料巴斯德吸管</td><td>ABCbio</td><td>ABC217003-4</td><td>在预处理步骤3.4中去除上清液</td></tr><tr><td>聚偏二氟乙烯（PVDF）膜</td><td>Millipore</td><td>ISEQ00010, IPVH00010</td><td>用于第8.5.5步蛋白质印迹中的蛋白转膜</td></tr><tr><td>预制聚丙烯酰胺凝胶，4&amp;ndash;20% 15孔板</td><td>ACE</td><td>F15420Gel</td><td>用于第8.5.2、8.5.3步的蛋白质印迹实验中的蛋白质分离</td></tr><tr><td>一抗稀释液</td><td>Fdbio 科学</td><td>FD0040</td><td>在第 8.5.8 步的蛋白质印迹实验中使用</td></tr><tr><td>蛋白标准品</td><td>Fdbio 科学</td><td>FD0672</td><td>在第8.5步中用于蛋白质印迹和考马斯亮蓝染色</td></tr><tr><td>快速蛋白质印迹溶液</td><td>UBIO</td><td>UW0500</td><td>用于第8.5.5步蛋白质印迹中的蛋白转印</td></tr><tr><td>SW 32 Ti 摆动桶转子</td><td>贝克曼库尔特</td><td>369650</td><td>第4步和第7步中用于BEVs分离的超速离心</td></tr><tr><td>20 mL、50 mL 注射器&amp;nbsp;</td><td>捷运通道</td><td>ZSQ-20ML，YCXWJZSQ-50 mL</td><td>转移缓冲液并去除预处理中的上清液</td></tr><tr><td>TBS 粉末</td><td>Fdbio 科学</td><td>FD1021</td><td>在第 8.5 步的蛋白质印迹实验中使用</td></tr><tr><td>透射电子显微镜（TEM）</td><td>日立&amp;nbsp;</td><td>H-7650</td><td>第8.3步中对BEV的形态学观察</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fdbio 科学</td><td>FD0020</td><td>在第8.5步的蛋白质印迹实验中使用</td></tr><tr><td>超速离心管</td><td>贝克曼</td><td>326823, 355642</td><td>第4步和第7步中用于BEVs分离的超速离心</td></tr><tr><td>超净工作台</td><td>AIRTECH</td><td>SW-CJ-2FD</td><td>执行液体处理的相关操作</td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Bluepard</td><td>CU600</td><td>用于第8.2.5步中测量BEVs的蛋白质含量</td></tr><tr><td>ZetaView</td><td>Particle Metrix</td><td>S/N 21-734，软件 ZetaView（版本 8.05.14 SP7）</td><td>纳米颗粒跟踪分析（NTA）用于在步骤 8.4 中测量 BEV 的粒径和浓度</td></tr></tbody></table>

利用密度梯度离心法从人粪便中分离和纯化细菌胞外囊泡

Isolation and Purification of Bacterial Extracellular Vesicles from Human Feces Using Density Gradient Centrifugation

细菌胞外囊泡（BEVs）是由细菌产生的纳米级囊泡，在细菌与细菌之间以及细菌与宿主之间的通讯中发挥重要作用，可传递来自亲代细菌的蛋白质、脂质和核酸等生物活性分子。源自肠道微生物群的BEVs不仅在胃肠道内发挥作用，还可到达远端器官，对生理和病理过程产生重要影响。理论上深入探究来源于人类粪便的BEVs的类型、数量及其功能，对于理解肠道微生物群分泌BEVs的机制及其生物学作用至关重要。这些研究同时也要求进一步优化当前BEVs的分离与纯化策略。
本研究通过建立两种密度梯度离心（DGC）模式——自上而下法（Top-down）和自下而上法（Bottom-up），优化了BEV的分离与纯化工艺。BEV在第6至第8组分（F6-F8）中富集分布。根据颗粒形态、大小、浓度及蛋白质含量评估该方法的有效性。计算了颗粒和蛋白质的回收率，并通过检测特异性标志物分析两种DGC模式的回收率与纯度。结果表明，自上而下离心模式的污染水平较低，且回收率和纯度与自下而上模式相当。7小时的离心时间足以实现每毫克粪便样本中108个BEV的浓度。
除了粪便外，根据成分和黏度的差异进行适当修改后，该方法也可应用于其他类型的体液。总之，这一详细且可靠的方案将有助于标准化地分离和纯化BEVs，从而为后续的多组学分析和功能实验奠定基础。

确定富含细菌胞外囊泡（BEV）的组分分布 
为确定富含细菌胞外囊泡（BEVs）的组分分布，设立空白对照以测定在OD 340 nm处的吸光度值，并根据测定结果及碘克沙醇说明书（步骤8.1）计算各组分的密度。表2展示了密度测定结果，显示F4至F9组分的密度处于通常与胞外囊泡相关的范围内。该结果表明，大部分BEVs被分离于这些组分中，因此将F4–F9定义为BEVs的粗略范围。采用透射电子显微镜（TEM）对从F4–F9组分中分离得到的粪便BEVs的形态特征进行表征，如图1所示。TEM图像（图2）显示存在典型的杯状结构，这是BEVs的特征性形态。通过纳米颗粒追踪分析（NTA）和双辛可宁酸蛋白定量法（BCA）分别测定颗粒数量和蛋白质浓度，以进一步评估回收率和纯度。图3展示了各组分的蛋白质和颗粒浓度，结果显示F6和F7组分的浓度最高，其次是F5和F8组分。随后进行考马斯亮蓝染色（CBBS）和蛋白质印迹...

本研究描述了一种从人粪便中富集、分离和纯化细菌胞外囊泡（BEVs）的方法 通过 密度梯度离心（DGC）可识别BEV的形态、粒径和浓度等物理特性，并探讨DGC方法在临床与科学研究中的潜在应用。

细菌胞外囊泡（BEVs）是由细菌产生的纳米级囊泡，在细菌与细菌之间以及细菌与宿主之间的相互作用中发挥重要作用……

本研究采用密度梯度离心法从粪便中分离、纯化并表征细菌胞外囊泡。我们的目标是优化细菌胞外囊泡与污染物的分离效果，为研究人员提供一种可靠的方法。本方案将离心时间从18小时缩短至7小时。自上而下模式可改善BEV的分离效果，并减少脂蛋白的污染。我们的方法简化了BEV的分离流程，为未来的研究建立了标准。该方法经过适当改进后可应用于其他体液，有助于加深对BEV的理解并推动其研究，揭示其在人体内的固有异质性。首先，取准备好的人粪便样本。将高速冷冻离心机预冷至4°C。使用PBS调节样本管的重量至0.1克，然后在4°C条件下以3,000×g离心20分钟。使用塑料移液管将上清液转移至两个50毫升离心管中，每管留取1毫升。随后在4°C条件下，以12,000G离心30分钟。使用20毫升注射器吸取上清液，并从注射器上取下针头。将液体通过0.22微米滤器过滤至50毫升离心管中。接着，用75%酒精擦拭桶体，以消除任何残留的污染。将约30毫升过滤后的粪便上清液转移至超速离心管中。用约八毫升 PBS 填充离心管，管口留出三毫米的间隙。将两支超速离心管分别放入相对位置的超速离心桶中，并使用 PBS 平衡两个离心桶的重量。无论离心桶中是否装有离心管，均需将所有离心桶装入转子中。将样品放入离心机中，启动真空，于4°C条件下以160,000G离心70分钟。离心一结束，立即释放腔体真空并打开超速离心机的门，随后迅速取出转子。将离心桶从转子转移到支架上，使用镊子夹取离心管。弃去上清液，保留可见的棕色沉淀。加入1 mL预冷的PBS，充分重悬沉淀。加入约 37 毫升 PBS 至离心管中，管口留出 3 毫米的间隙。再次进行超速离心后，弃去上清液，并将离心管倒置 5 分钟。用擦拭纸清除管内壁残留的液体。使用1,000微升移液器，加入1.2毫升预冷的PBS重悬沉淀，并通过移液混合均匀。将1.2毫升PBS BEV溶液从一个超速离心管转移至一个洁净的1.5毫升微量离心管中。首先，取500微升已制备的PBS BEV溶液。将样品与 3 毫升 PBS 混合，使用 1,000 微升移液器轻轻混匀。将一个 31 毫升超速离心管置于带孔的泡沫板上，并在管壁标记向下的箭头。然后垂直持握 1,000 微升移液器，将 3 毫升 50% 碘克沙醇溶液缓慢加入离心管底部。将离心管架放置在泡沫板上方略高于离心管开口的位置，并将离心管倾斜至70度角。使用1,000微升移液器，向50%碘克沙醇溶液上方加入3毫升40%碘克沙醇溶液。然后在40%碘克沙醇溶液上方叠加3毫升20%碘克沙醇溶液。使用1,000微升移液器，在已制备的20%碘克沙醇溶液上方加入三毫升10%碘克沙醇溶液。接着在10%碘克沙醇溶液上方加入3.5毫升PBS BEV溶液，并轻轻将离心管恢复至直立位置。现在将一个31毫升超速离心管置于带孔的泡沫板上，并用向上的箭头标记。使用1,000微升移液器，垂直向离心管底部加入2.5毫升60%碘克沙醇储备液，并与500微升PBS BEV溶液混合，得到3毫升50%碘克沙醇BEV溶液。通过移液充分混匀该溶液。随后依次加入40%、20%和10%的碘克沙醇溶液进行梯度分层，再使用1,000微升移液器在10%碘克沙醇溶液上方加入3.5毫升PBS。用PBS调整两个离心管的重量，使其总重量相差在±0.005克以内。接着，将离心管放入转子吊桶中，在4°C条件下以160,000G离心7小时。使用移液器从梯度超速离心管的侧壁由上至下依次收集组分，分别收集到10个独立的38.5毫升超速离心管中。然后在4摄氏度下，以160,000G超速离心70分钟。弃去上清液，将超速离心管倒置5分钟。接着，使用200微升移液器将沉淀重悬于200微升预冷的PBS中。将PBS BEV溶液转移至洁净的1.5毫升离心管中。将从一次密度梯度超速离心获得的组分按F1至F10编号，并进行后续分析。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

使用密度梯度离心从人粪便中分离和纯化细菌胞外囊泡

来源：Watson, D. C., et.al. 大肠杆菌及其他细菌来源细胞外囊泡的可扩展分离与纯化. J. Vis. Exp.

细菌外膜来源的胞外囊泡的分离与富集

来源：Watson, D. C., 等. 从大肠杆菌及其他细菌中可扩展地分离与纯化细胞外囊泡. J. Vis. Exp.

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本视频展示了基于密度梯度超速离心的纯化方法，用于分离适合进行表征研究的细胞外囊泡亚群。...

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高产量细胞外囊泡与病毒分离纯化

细菌会分泌携带生物活性分子的纳米级细胞外囊泡（EVs）。EV研究主要关注其生物发生机制、在微生物间及宿主-微生物相互作用和疾病中的作用，以及潜在的治疗应用。本文介绍了一种可放大的从多种细菌中分离EV的方法流程，以促进EV研究的标准化。...

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从Drosophila胚胎中分离与纯化驱动蛋白

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