利用密度梯度离心法从人粪便中分离和纯化细菌胞外囊泡

本研究采用密度梯度离心法从粪便中分离、纯化并表征细菌胞外囊泡。我们的目标是优化细菌胞外囊泡与污染物的分离效果，为研究人员提供一种可靠的方法。本方案将离心时间从18小时缩短至7小时。

自上而下模式可改善BEV的分离效果，并减少脂蛋白的污染。我们的方法简化了BEV的分离流程，为未来的研究建立了标准。该方法经过适当改进后可应用于其他体液，有助于加深对BEV的理解并推动其研究，揭示其在人体内的固有异质性。

首先，取准备好的人粪便样本。将高速冷冻离心机预冷至4°C。使用PBS调节样本管的重量至0.1克，然后在4°C条件下以3,000×g离心20分钟。

使用塑料移液管将上清液转移至两个50毫升离心管中，每管留取1毫升。随后在4°C条件下，以12,000G离心30分钟。使用20毫升注射器吸取上清液，并从注射器上取下针头。

将液体通过0.22微米滤器过滤至50毫升离心管中。接着，用75%酒精擦拭桶体，以消除任何残留的污染。将约30毫升过滤后的粪便上清液转移至超速离心管中。

用约八毫升 PBS 填充离心管，管口留出三毫米的间隙。将两支超速离心管分别放入相对位置的超速离心桶中，并使用 PBS 平衡两个离心桶的重量。无论离心桶中是否装有离心管，均需将所有离心桶装入转子中。

将样品放入离心机中，启动真空，于4°C条件下以160,000G离心70分钟。离心一结束，立即释放腔体真空并打开超速离心机的门，随后迅速取出转子。

将离心桶从转子转移到支架上，使用镊子夹取离心管。弃去上清液，保留可见的棕色沉淀。加入1 mL预冷的PBS，充分重悬沉淀。

加入约 37 毫升 PBS 至离心管中，管口留出 3 毫米的间隙。再次进行超速离心后，弃去上清液，并将离心管倒置 5 分钟。用擦拭纸清除管内壁残留的液体。

使用1,000微升移液器，加入1.2毫升预冷的PBS重悬沉淀，并通过移液混合均匀。将1.2毫升PBS BEV溶液从一个超速离心管转移至一个洁净的1.5毫升微量离心管中。首先，取500微升已制备的PBS BEV溶液。

将样品与 3 毫升 PBS 混合，使用 1,000 微升移液器轻轻混匀。将一个 31 毫升超速离心管置于带孔的泡沫板上，并在管壁标记向下的箭头。然后垂直持握 1,000 微升移液器，将 3 毫升 50% 碘克沙醇溶液缓慢加入离心管底部。

将离心管架放置在泡沫板上方略高于离心管开口的位置，并将离心管倾斜至70度角。使用1,000微升移液器，向50%碘克沙醇溶液上方加入3毫升40%碘克沙醇溶液。然后在40%碘克沙醇溶液上方叠加3毫升20%碘克沙醇溶液。

使用1,000微升移液器，在已制备的20%碘克沙醇溶液上方加入三毫升10%碘克沙醇溶液。接着在10%碘克沙醇溶液上方加入3.5毫升PBS BEV溶液，并轻轻将离心管恢复至直立位置。现在将一个31毫升超速离心管置于带孔的泡沫板上，并用向上的箭头标记。

使用1,000微升移液器，垂直向离心管底部加入2.5毫升60%碘克沙醇储备液，并与500微升PBS BEV溶液混合，得到3毫升50%碘克沙醇BEV溶液。通过移液充分混匀该溶液。随后依次加入40%、20%和10%的碘克沙醇溶液进行梯度分层，再使用1,000微升移液器在10%碘克沙醇溶液上方加入3.5毫升PBS。

用PBS调整两个离心管的重量，使其总重量相差在±0.005克以内。接着，将离心管放入转子吊桶中，在4°C条件下以160,000G离心7小时。使用移液器从梯度超速离心管的侧壁由上至下依次收集组分，分别收集到10个独立的38.5毫升超速离心管中。

然后在4摄氏度下，以160,000G超速离心70分钟。弃去上清液，将超速离心管倒置5分钟。接着，使用200微升移液器将沉淀重悬于200微升预冷的PBS中。

将PBS BEV溶液转移至洁净的1.5毫升离心管中。将从一次密度梯度超速离心获得的组分按F1至F10编号，并进行后续分析。