Name: 清醒小鼠的高血糖钳夹和低血糖钳夹 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T13:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: 学习高血糖钳夹与低血糖钳夹技术，用于研究清醒小鼠大脑调节血糖的神经机制。该方法帮助研究者评估胰岛素敏感性和分泌，深入理解葡萄糖代谢的调控原理。

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本工作得到了日本文部科学省优秀青年研究者领军计划、科学研究费补助金（B类）（课题编号 JP21H02352）、日本医疗研究开发机构（AMED-RPIME，课题编号 JP21gm6510009h0001、JP22gm6510009h9901）、上原纪念基金会、安斯泰来代谢疾病研究基金会、铃木财团纪念基金会、秋山生命科学基金会以及成重神经科学研究所基金会的资助。我们还感谢 Nur Farehan Asgar 博士对本文初稿的编辑工作。

所有实验程序均经熊本大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。
注意：为缓解疼痛，将布洛芬以0.11 mg/mL浓度加入饮水中给予，持续48小时；并在手术前30分钟腹腔注射布托啡诺（0.05–0.1 mg/kg）。无菌操作条件包括佩戴手套、口罩，以及在动物间使用经环氧乙烷灭菌的器械并辅以高压灭菌器灭菌。手术在设定为37 °C的加热垫上进行，每只动物使用新的实验垫覆盖。术前用聚维酮碘&#160;溶液和酒精清洁手术区域。所有手术器械均经高压灭菌（每套器械用于不超过两次手术）。在切口前，需检查小鼠以确认其已完全麻醉。每只小鼠的麻醉深度在手术前及手术过程中通过夹趾反射进行评估。&#160;每次适应性停留时间不超过5分钟。请遵循所在机构IACUC的相关指导规定。
1. 颈静脉和颈动脉导管的制备
<ol>
	<li>对所有管路、聚丙烯制品（如移液器吸头）和缝合线使用高压灭菌器或环氧乙烷进行灭菌。对于颈静脉，连接8 cm的管路1（见 材料）以及使用胶水将3 cm长的管子2连接图2A将2 mm长的导管1置于顶部，因为导管2（聚乙烯）过硬，可能损伤血管（导管1.1）。</li>
	<li>用于颈静脉输注葡萄糖和胰岛素的延长管（Tubing1.2）
	<ol>
		<li>准备两根30 cm管子和一根10 cm管子，并连接tubing2（图2A）。剪去20 μL移液器吸头的尖端（或任何外径较小的细尖端物品 &#60; 0.5 mm 用于连接导管 1.1），并将三根导管2（30 cm、30 cm 和 10 cm）一并放入其中，用粘合胶密封。</li>
		<li>在 tubing2 的另一端放置 5 cm 的 tubing1。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>颈动脉&#160;（管路1.3）：拉伸管路2使其变细。使用胶水将8 cm的管路1与3 cm拉伸后的管路2连接图2A在距尖端9 mm处做一标记。</li>
	<li>带有非锐端的针头，用于连接管路与注射器：用金属锉在针头（23 G）尖端附近划出刻痕，用钳子轻轻反复弯折数次后折断。在针头中段进行同样的切割，制成一段金属连接件图2A).</li>
	<li>用于抽血的动脉延长管（管路套装1.4）：将10 cm长的管路1与步骤1.4中制备的金属连接器和非锐利针头连接。 
	&#8203;注意：所有导管和缝合线均使用高压灭菌器或环氧乙烷进行灭菌。</li>
</ol>
2. 手术
<ol>
	<li>使用异氟烷（1.5-2.0%）或氯胺酮/赛拉嗪（氯胺酮 10 mg/mL，赛拉嗪 1 mg/mL 溶于 0.9% 无菌生理盐水，按 0.1 mL/10 g 体重 [BW] 经腹腔 [ip] 注射）对小鼠进行麻醉。将小鼠置于 37 °C 的加热垫上以减少生理应激。等待 5-10 分钟直至进入深度麻醉状态。通过脚趾压迫刺激评估肢体反射、呼吸频率和心率，以确认麻醉深度。&#160;手术期间，应使用&#160;手术胶带将鼻罩固定在手术台上，以持续吸入麻醉气体。&#160;涂抹眼用软膏以防止麻醉期间角膜干燥。</li>
	<li>将肝素化生理盐水（100 U/mL）注入导管1.1和1.3中，并连接装有钝头针头的1 mL注射器（图2B）。使用电烙铁熔封导管3（见材料表）的末端，制成用于密封导管1.1和导管1.3的帽盖。</li>
	<li>剃除并清洁第一切口区（背部肩胛间区域）和第二切口区（颈部前方），依次使用10%聚维酮碘擦拭三次，再用70%无菌酒精进行术前准备。在胸骨头侧约5 mm处做一垂直正中切口，钝性分离组织，暴露动脉。将迷走神经与动脉分离，以减少切除迷走神经对葡萄糖代谢的负面影响。 
	注意：从腹侧切口开始至导管插入静脉并用丝线结扎固定的步骤均需在显微镜下操作。</li>
	<li>在动脉下方放置两根丝线。通过在头侧紧密结扎一根丝线（图2C-1），尾侧松松结扎另一根丝线（图2C-2）来阻断血流，松结应足以阻断血流但后续仍可重新打开。在动脉下方再放置一根丝线（图2C-3）。</li>
	<li>用弹簧剪在图2C-1附近剪断动脉，将导管1.3插入动脉内。在动脉和导管上打一个松结（图2C-3，不要扎紧，以便导管进一步深入动脉）。松开尾侧的结（图2C-2），将导管继续插入，直至导管上的9 mm刻度线到达中间结扎处（图2C-3）。牢固结扎所有结扎线，并用肝素化无菌生理盐水冲洗导管。</li>
	<li>从与右颈总动脉相同的切口暴露右颈静脉，用于颈静脉导管置入。游离静脉头端，并用丝线结扎（图2D-1，材料表）。在暴露的静脉尾端再放置一根丝线（图2D-2）。用弹簧剪在标记图2D-1&#160;附近剪断静脉。</li>
	<li>插入导管（避免插入过深以免穿透血管），结扎固定，并通过肉眼观察确认其可采集血液。用肝素化无菌生理盐水（0.2 mL）冲洗导管，并肉眼确认导管内无残留血液。</li>
	<li>将小鼠转移至新的无菌手术单上，防止来自首个伤口的感染。翻转小鼠体位，依次使用聚维酮碘擦拭三次，再用无菌酒精进行术前准备，在肩胛骨之间做一小切口。</li>
	<li>将持针器从背部切口皮下穿行至腹侧。用持针器夹住导管，将其经皮下引导至背部切口并拉出。清洁切口部位，使用合成&#160;缝线（直径 0.15-0.2 mm）缝合腹侧切口。在肩胛骨之间的切口处，使用微型动脉夹（micro serrefine）夹闭静脉导管。</li>
	<li>在夹子上方1 cm处剪断导管，用肝素化生理盐水冲洗，然后用帽盖封闭（步骤2.4）。对动脉导管执行相同操作。使用合成&#160;缝线（直径 0.15-0.2 mm）缝合背部切口。</li>
	<li>将小鼠放入温暖、洁净的笼具中（图2E）。每日进行术后护理。</li>
</ol>
3. 恢复
<ol>
	<li>将小鼠单独饲养，因为在群养条件下其他小鼠可能会咬到导管。
	<ol>
		<li>为减轻因社会隔离带来的应激，应为小鼠提供环境丰富化设施（例如庇护所）。&#160;每日进行术后护理。为缓解疼痛、痛苦和不适，需提供包括镇痛（在饮水中添加布洛芬（0.11 mg/mL））在内的术后护理措施。</li>
		<li>观察小鼠是否有感染迹象，例如伤口化脓、精神萎靡或切口部位疼痛。大多数健康小鼠在手术后约2小时开始行走和进食。弓背姿势、毛发竖立和摄食量减少可能提示存在疼痛。若观察到上述症状，应立即在深度麻醉下通过断头法或二氧化碳窒息法对小鼠实施安乐死。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>血液会进入动脉导管并形成血凝块。为维持导管通畅，需每日清除血凝块，具体操作步骤见第3至第6步。</li>
	<li>用肝素化生理盐水（100 U/mL）填充1 mL注射器和23 G针头（非锐端）。使用诱导室，&#160;以异氟烷（1.0%–1.5%）对小鼠进行轻度麻醉。随后将小鼠从诱导室中取出，并在鼻罩给予异氟烷麻醉的条件下进行血凝块清除操作。</li>
	<li>使用微型止血夹夹闭小鼠背部动脉端的导管管路，取下帽塞，抽出血液和血凝块。使用另一支装有23 G针头（非锐端）的1 mL注射器，用肝素化生理盐水冲洗导管，然后重新盖上帽塞。若静脉端出现严重凝血，也应参照动脉端的方法进行清洁。</li>
	<li>每天执行一次上述操作，持续3至5天，以清洁导管。</li>
	<li>监测小鼠的体重变化。若小鼠体重较手术当日下降超过10%，应给予支持性护理，努力改善其正常体况评分，并考虑将其用于其他实验。&#160; 
	&#8203;注：本研究中实验动物的体重减轻均低于10%。体重下降会显著影响全身葡萄糖代谢，因此建议等待体重恢复或将其排除在钳夹实验之外。</li>
</ol>
4. 建立泵系统（用于低血糖钳夹）
<ol>
	<li>用含0.1% BSA的生理盐水配制1 U/mL胰岛素溶液，另配制30%葡萄糖生理盐水溶液和肝素化生理盐水。</li>
	<li>测量小鼠体重。根据1 U/mL胰岛素溶液计算胰岛素输注液的用量（10 mU/kg/min），在钳夹实验中以1.7 μL/min的速度向小鼠输注胰岛素溶液。配制300 μL胰岛素输注液时，所需1 U/mL胰岛素的体积（μL）为2.647（μL/g）× 体重（g）。每只小鼠完成一次钳夹实验需使用300 μL胰岛素输注液。表1展示了配制胰岛素输注液的示例。</li>
	<li>将胰岛素输注液和30%葡萄糖溶液分别装入Hamilton注射器中，通过管路1.2连接，并将注射器安装至注射泵上（图3A）。用上述溶液冲洗管路1.2。另取1 mL注射器装入生理盐水，并连接管路1.4（图2A）。</li>
	<li>使用异氟烷（1.0%–1.5%）麻醉小鼠，将管路1.2连接至静脉导管，管路1.4连接至动脉导管（图3A）。使用透明胶带将管路固定在一起。</li>
	<li>将小鼠置于一个空的500 mL烧杯中。 
	&#8203;注意：进行高血糖钳夹实验时，应使用生理盐水代替1 U/mL胰岛素溶液。</li>
</ol>
5. 低血糖钳夹实验
<ol>
	<li>如图3B所示，每5-10分钟测量一次血糖水平，并在-15分钟、10分钟、20分钟、40分钟、60分钟、80分钟、100分钟和120分钟采集血样用于激素测定。按照步骤5.2测量血糖。 
	注意：并非所有时间点都必须测量血糖，但建议至少每10分钟测量一次。当血糖水平和葡萄糖输注速率不稳定时，应每5分钟测量一次。</li>
	<li>夹闭输液管组1.4的上端，连接新的注射器，抽取50 μL血液，将其放入1.5 mL离心管中用于冲洗。&#160;测量血糖水平。 
	注意：由于前次采样后用生理盐水冲洗导管，此血液已被管内生理盐水稀释。50 μL的体积足以用纯血替换稀释的血液。</li>
	<li>保存稀释后的血液（红细胞）。将汇集的血液（约500 μL）用生理盐水洗涤（见步骤5.11-5.12），并回输体内以防止缺氧。</li>
	<li>导管连接至高压动脉，因此当松开夹子时，血液会流出，并可用于便携式血糖仪测量葡萄糖。输注50 μL生理盐水以维持足够的血液液体量。</li>
	<li>采血时，额外抽取50 μL血液，置于冰上的1.5 mL离心管中。输注100 μL生理盐水（50 μL补充量 + 50 μL采样量）。</li>
	<li>在0分钟血糖测量后，启动胰岛素注射泵。首先以30 mU/kg/min的速度快速输注2分钟（5.1 μL/min），随后以10 mU/kg/min（1.7 μL/min）的速度持续输注至实验结束。</li>
	<li>在120分钟内，每5-10分钟测量一次血糖水平，并相应调整葡萄糖输注速率。</li>
	<li>建立稳态，使葡萄糖输注速率保持不变，且血糖水平维持在50 mg/dL。</li>
	<li>在t = 120分钟采集血样后，向颈静脉输注安乐死试剂，并采集组织用于RNA或蛋白质分析。</li>
	<li>将血液在1000 x g 条件下离心5分钟，并根据试剂盒说明书使用ELISA试剂盒测定胰岛素或C肽等激素浓度。</li>
	<li>洗涤血液时，在1000 x g 条件下离心3分钟。弃去上清液，加入500 μL肝素化生理盐水，进行吹打混匀。</li>
	<li>重复洗涤一次，将洗涤后的红细胞置于1 mL注射器中连接动脉。当在步骤5.2和5.3中输注50或100 μL生理盐水时，血细胞将自动回输。需密切监测红细胞压积，以防发生缺氧。 
	&#8203;注意：血糖测量使用了商用便携式血糖仪。</li>
</ol>
6. 高血糖钳夹实验
<ol>
	<li>按照低血糖钳夹技术的步骤操作，但不进行胰岛素输注，并将血糖水平调节至250-300 mg/dL。每5-10分钟测量一次血糖水平，如图3B所示，并在-15分钟、10分钟、20分钟、40分钟、60分钟、80分钟、100分钟和120分钟时采集血样用于激素测定。</li>
	<li>将一个新的注射器连接至管路装置1.4，抽取50 μL血液，放入1.5 mL离心管中用于洗涤。</li>
	<li>采血时，额外抽取50 μL血液，置于冰上的1.5 mL离心管中。随后输注100 μL生理盐水（50 μL用于置换，50 μL补偿采血量）。</li>
	<li>在血糖测定时间为0分钟时，启动葡萄糖注射泵。首先以30 g/kg/min的速率进行2分钟的脉冲输注（5.1 μL/min），随后以10 g/kg/min（1.7 μL/min）的速率持续输注至实验结束。</li>
	<li>在120分钟内每5-10分钟测量一次血糖水平，并相应调整葡萄糖输注速率。建立一个稳态，即葡萄糖输注速率保持稳定，且血糖水平维持在250-300 mg/dL，达到高血糖钳夹状态。</li>
</ol>

Surgical Installation of Hyperglycemic and Hypoglycemic Clamps in Mice

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</ol>

作者声明无竞争利益。

本文所述方法简便，可使用移液器吸头、注射器以及普通实验室中常见的其他物品完成。尽管研究人员可能需要额外购买一些管路和泵，但无需昂贵的设备。因此，与以往报道相比12,13,14，该导管插入与夹闭方案更易于开展。
夹闭技术于20世纪70年代左右开发，已在小鼠和人类中得到应用15。该方法可用于精确测量葡萄糖代谢，被认为是金标准。然而，该技术并未被多数研究人员广泛采用。高胰岛素-正常血糖夹闭技术已在小鼠13和大鼠14中报道，但此处的导管插入方法有所不同，读者可根据实验需求选择更简便的方法。本文的目的之一是降低开展此类实验的门槛。因此，我们提供了自制导管材料、手术操作步骤以及实验时间进程示例的详细信息，这些内容对于首次尝试进行夹闭实验的研究人员具有重要参考价值。
肥胖和糖尿病中的胰岛素分泌具有阶段依赖性。许多研究表明，在肥胖状态下，为降低胰岛素抵抗状态下的血糖水平，胰岛素分泌会增加16，但2型糖尿病（Type 2 DM）中β细胞功能将受到损伤17,18。事实上，已有报道显示，在肥胖小鼠模型（如高脂饮食喂养的小鼠19或瘦素缺乏小鼠20）中，胰腺胰岛的数量和面积以及胰岛素分泌均有所增加。在这些表型明显的小鼠模型中，可通过葡萄糖耐量试验（GTT）给予葡萄糖后15-30分钟检测血清胰岛素水平来判断差异。然而，在某些情况下，胰岛素分泌的差异并不容易确定。例如，若转基因（Tg）小鼠的血糖水平为500 mg/dL，而野生型（WT）小鼠为300 mg/dL，且两者血清胰岛素水平相同，我们能否认为Tg小鼠的胰岛素分泌能力下降？在这种情况下，除非采用本文介绍的方法使血糖水平保持一致，否则无法比较两者的胰岛素分泌能力。这也是目前尚无明确定论说明从肥胖向糖尿病转变过程中β细胞功能何时开始恶化的原因之一。我们还可以通过胰腺原代培养21或离体（ex vivo）实验22来测定胰岛素分泌。然而，这些方法会消除中枢神经系统对胰岛素释放的影响，因为迷走神经的神经支配将被移除。尽管餐后胰岛素分泌已被广泛认知，但大脑和自主神经系统也参与调节胰岛素释放23。因此，研究后者机制的实验应在未麻醉、无束缚且无痛采血的条件下进行。这也是为何在步骤2.3中必须将迷走神经与颈动脉分离的原因。
已有报道称，糖尿病 mellitus 会因胰岛素抵抗以及胰高血糖素24和其他反调节激素分泌增加而导致高血糖25。此外，糖尿病患者由于胰岛素剂量使用不当或其他原因导致反复发生低血糖，可引发一种称为反复性低血糖的状况，使患者更易发生低血糖26。有研究指出，在低血糖钳夹实验中，血糖下降速率会影响外周或中枢对低血糖的感知能力27。缓慢发生的低血糖适用于研究门脉-肠系膜静脉中葡萄糖感受器的作用，而快速降低的血糖则适用于研究脑内葡萄糖感受器27。在瘦型 C57BL 小鼠中使用 1 U/mL 胰岛素即可；但由于肥胖小鼠存在胰岛素抵抗，需使用更高浓度的胰岛素，1 U/mL 不足以降低其血糖水平。
在血糖池的单室模型中（图1A），吸收的葡萄糖量可能影响葡萄糖输入速率14。因此，作为高胰岛素-正葡萄糖钳夹实验主要测量目标之一的葡萄糖生成速率，可能受到禁食时间长短的影响。然而，长时间禁食可能会增加反调节激素的释放。因此，研究人员应根据其分析目的设定禁食时间。另一种钳夹方法包括从小鼠尾部采血，该方法较为简单，仅需插入静脉套管即可14。但采血过程需对小鼠进行固定，从而引起一定程度的束缚应激，并导致血浆儿茶酚胺及其他应激激素水平升高14。此外，相较于外周血液，更理想的是测量体内中心循环血液中的激素浓度。因此，对自由活动小鼠进行动脉采血是生理条件下测量葡萄糖代谢的最佳方式。当小鼠适应实验环境后，通常不会剧烈活动，因此无需使用旋转连接装置。但为防止输液管和采样管缠绕，建议仍使用旋转连接装置。然而，导管1.2和导管套装1.4（图3A）不适合与旋转连接装置联用。若研究人员需使用旋转连接装置，应改进实验系统。回输血细胞不会影响已建立的血糖和胰岛素稳态。本方法也可应用于基于同位素的代谢组学研究。例如，若持续向静脉输注13C-葡萄糖，则可测定全身代谢周转率及细胞内中间代谢物水平28。因此，该方法是分析葡萄糖代谢的有效手段。

葡萄糖是细胞的重要能量来源，缺乏葡萄糖可能导致多种症状和并发症。当血糖水平过低（即低血糖，通常空腹血糖水平低于 70 mg/dL，但不应仅凭单一数值判断1）时，最常见的症状包括虚弱、意识混乱、出汗和头痛。低血糖还可能干扰大脑功能，并增加心血管事件和死亡风险2。相反，高血糖是一种医学状况，指血浆葡萄糖浓度超过正常水平（通常空腹血糖水平&#62; 126 mg/dL3），常见于胰岛素分泌或利用存在缺陷的糖尿病患者。高血糖可导致糖尿病酮症酸中毒，即机体无法利用葡萄糖供能，转而分解脂肪酸作为能量来源。高血糖高渗状态也会增加死亡率4。长期高血糖可损害血管、神经和器官，导致多种慢性并发症的发生，如心血管疾病、视网膜病变和肾脏疾病。因此，血糖浓度必须维持在 100 mg/dL 至 120 mg/dL 的狭窄范围内。
血糖由单室模型中葡萄糖输入与输出之间的平衡来调节（图1A）。葡萄糖输入包括从食物中吸收的葡萄糖以及肝脏、肾脏和小肠产生的葡萄糖。葡萄糖输出则包括组织对葡萄糖的摄取以及肾脏对葡萄糖的排泄。葡萄糖输入和输出的量均受内分泌激素的调控。例如，当血糖水平降低时，胰高血糖素、皮质酮和儿茶酚胺等被称为反调节激素的激素会被释放5。它们可刺激糖原分解以及主要来自肝脏的葡萄糖合成；这两个过程分别称为糖原分解和糖异生。高血糖会促进胰腺β细胞释放胰岛素，并刺激肌肉、脂肪组织和心脏对葡萄糖的摄取6,7,8,9。运动可增加不依赖胰岛素的葡萄糖摄取10。交感神经系统可增加肌肉和棕色脂肪组织对葡萄糖的摄取6,11。为了测量外周组织调节葡萄糖代谢的能力，研究人员通常采用葡萄糖耐量试验（GTT）和胰岛素耐量试验（ITT）（图1B、C）。在GTT中，必须考虑两个因素：胰岛素释放和胰岛素敏感性（图1B）。然而，每只小鼠在120分钟测试期间的葡萄糖浓度曲线各不相同，这可能影响不同量的激素释放。在ITT中，血糖受胰岛素敏感性和反调节激素释放的共同调节。因此，在血糖水平不恒定的情况下，很难准确判断GTT和ITT中葡萄糖代谢、胰岛素释放和胰岛素敏感性的具体含义。
为解决这些问题，理想的方法是将血糖水平维持在一个恒定水平（或称为&#34;钳夹&#34;）。在高血糖钳夹实验中，通过向血液中输注葡萄糖，使血糖水平升高至特定目标值，并在一段时间内维持该水平。根据每5–10分钟一次的血糖水平测量结果，调整葡萄糖输注速率，以保持稳态。该技术特别适用于研究在固定血糖水平下胰岛素分泌的相关参数。低血糖钳夹是一种通过输注胰岛素来维持低血糖水平的方法，同时以可变速率输注葡萄糖，以维持设定的特定血糖浓度。若小鼠无法自行恢复血糖水平，则应增加葡萄糖输注量。
尽管高血糖和低血糖钳夹实验具有诸多优势，但其手术和实验操作在技术上被认为较为困难，因此能够开展此类实验的研究团队较少。我们的目标是为那些在经费和人力方面受限的研究人员提供方法描述，使其能够在较低预算下启动这些实验。

<table><tbody><tr><td>粘合胶水</td><td>Henkel AG &amp;amp; Co. KGaA</td><td>LOCTITE 454</td><td></td></tr><tr><td>ELISA试剂盒（C肽）</td><td>莫林加生物科学研究所股份有限公司</td><td>M1304</td><td>小鼠C肽ELISA试剂盒</td></tr><tr><td>ELISA试剂盒（胰岛素）</td><td>富士胶片和光纯药株式会社</td><td>633-03411</td><td>LBIS 小鼠胰岛素 ELISA 试剂盒（U型）</td></tr><tr><td>便捷式血糖仪</td><td>尼普洛株式会社</td><td>11-777</td><td>Free Style Freedom Lite</td></tr><tr><td>胰岛素（100U/ml）</td><td>Eli Lilly &amp;amp; 公司</td><td>428021014</td><td>Humulin R（100U/ml）</td></tr><tr><td>小鼠</td><td>Japan SLC 公司</td><td>C57BL/6NCrSlc</td><td>C57BL</td></tr><tr><td>缝合</td><td>南津製作所</td><td>C-23S-560 第2号</td><td>灭菌的</td></tr><tr><td>注射泵</td><td>Pump Systems Inc.</td><td>NE-1000</td><td></td></tr><tr><td>合成缝合线</td><td>V&amp;Ouml;MEL</td><td>HR-17</td><td></td></tr><tr><td>导管1</td><td>AS ONE 公司</td><td>9-869-01</td><td>LABORAN(R) 硅胶管</td></tr><tr><td>导管2</td><td>Fisher Scientific</td><td>427400</td><td>BD Intramedic PE 导管</td></tr><tr><td>导管3</td><td>IGARASHI IKA KOGYO CO., LTD.</td><td>5号大小</td><td>聚乙烯管，规格5</td></tr></tbody></table>

清醒小鼠的高血糖钳夹与低血糖钳夹技术

Hyperglycemic Clamp and Hypoglycemic Clamp in Conscious Mice

糖尿病（DM）是由于胰腺β细胞胰岛素分泌不足（1型DM）以及肌肉、肝脏和脂肪组织对胰岛素敏感性降低（2型DM）所致。胰岛素注射可用于治疗DM患者，但会导致低血糖这一副作用。为应对低血糖，机体释放皮质醇和儿茶酚胺，激活肝脏的葡萄糖生成，这一过程称为反调节反应（CRR）。在利用啮齿类动物模型进行的DM研究中，通常采用葡萄糖耐量试验和2-脱氧葡萄糖注射分别测量胰岛素分泌和CRR。然而，实验过程中血糖浓度持续变化，使得评估胰岛素净分泌量和CRR存在困难。本文介绍一种方法，可在清醒小鼠中将血糖分别维持在250 mg/dL或50 mg/dL，以分别比较胰岛素和CRR激素的释放情况。
将聚乙烯导管植入小鼠的颈动脉和颈静脉中，并让小鼠从手术中恢复。颈静脉导管连接至带有注射泵的汉密尔顿注射器，以实现胰岛素或葡萄糖以恒定或可变速率输注。颈动脉导管用于采集血液。在高血糖钳夹实验中，将30%葡萄糖溶液注入静脉，每5分钟或10分钟从动脉血中测定一次血糖水平。逐步增加30%葡萄糖的输注速率，直至血糖水平达到250 mg/dL。随后采集血液以测定胰岛素浓度。在低血糖钳夹实验中，以10 mU/kg/min的速率输注胰岛素，同时输注30%葡萄糖，其输注速率可调，以维持血糖水平在50 mg/dL。当葡萄糖输注速率和血糖水平均达到稳态时，采集血液以测定反调节激素水平。高血糖钳夹和低血糖钳夹实验采用相同的手术操作和实验装置。因此，该方法对系统性葡萄糖代谢研究的科研人员具有重要应用价值。

低血糖钳夹实验在雄性C57BL/6N小鼠（8周龄，体重超过25 g）中进行，实验开始前小鼠禁食3小时（图4A，B）。初始血糖水平为136 mg/dL（t = -15 min）。如果初始血糖低于90 mg/dL，可能是由于手术操作不理想、动脉导管插入过深，或有血栓进入血液循环所致。术后小鼠的状态会影响其能量代谢。在健康状况不佳的情况下，无法准确测量生理性的葡萄糖代谢。C57BL小鼠术后较易发生血栓；而体重较大的小鼠（如FVB或ICR小鼠）在术后因冲洗血栓导致体重下降的风险较低。因此，初学者练习钳夹操作时，建议优先选用FVB小鼠。C57BL小鼠需要更精细的术后护理。将9 mm导管插入动脉后，即使在FVB和ICR小鼠中也未出现采血困难的情况。胰岛素输注从t = 0 min开始，血糖水平随之下降（图4A）。在t = 0 min至t = 70 min期间，葡萄糖输注速率（GIR）尚未稳定；此后自80 min起逐渐达到稳态。
在雄性C57BL/6N小鼠（8周龄，体重超过25 g）中也进行了高血糖钳夹实验，实验开始前禁食3小时（图4C、D）。在t = -15 min和t = -5 min时测量血糖并采集血样后，从t = 0 min开始输注葡萄糖。在t = 40 min时，血糖水平达到250 mg/dL。稳态从t = 30 min持续至实验结束。
<img alt="葡萄糖代谢示意图；方程 ΣFx=0, MA=0；葡萄糖耐量试验；数据图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65581/65581fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：血糖水平的调节。（A）说明体内血糖调节的概念示意图。（B、C）（B）葡萄糖耐量试验（GTT）和（C）胰岛素耐量试验（ITT）中葡萄糖代谢的调节。多种因素共同调节血糖水平。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65581/65581fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于流体输送的手术管路装置示意图，包含注射器及啮齿类动物手术操作。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65581/65581fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：管路制备及手术步骤。（A）颈动脉和颈外静脉用管路的示意图。管路编号与实验方案中的步骤编号相对应。（B）手术用管路的制备方法。（C、D）用于结扎丝线的编号位置，以将导管插入（C）动脉和（D）静脉。动脉前端（C-(1)）和后端（C-(2)）各有一条丝线结扎位置，中间另加一条（C-(3)）（步骤2-4）。静脉前端（D-(1)）和后端（D-(2)）各有一条丝线结扎位置，中间另加一条（D-(3)）（步骤2-6）。（E）动脉和静脉套管从背部引出的示意图 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65581/65581fig02largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="胰岛素输注实验示意图，显示注射器装置及葡萄糖测量数据表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65581/65581fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图 3：钳夹实验的设置。（A）示意图，显示管路、泵、注射器和小鼠的连接装置。（B）用于记录血糖水平和葡萄糖输注速率的记录表。在 t = -15 min、10 min、20 min、40 min、60 min、80 min、100 min 和 120 min 时采集 50 μL 血液。胰岛素输注速率在 t = 0 至 2 min 期间为 5.1 μL/min，从 t = 2 min 起调整为 1.7 μL/min。血糖水平每 10 分钟测定一次；当血糖水平不稳定时，则每 5 分钟测定一次。每次测定血糖后均调整葡萄糖输注速率。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65581/65581fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="低血糖和高血糖钳夹结果、血糖、葡萄糖输注速率、科学图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65581/65581fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：低血糖钳夹和高血糖钳夹的代表性结果。 （A）低血糖钳夹期间的血糖水平和（B）葡萄糖输注速率。（C）高血糖钳夹期间的血糖水平和（D）葡萄糖输注速率。数据以均值 ± 标准误表示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65581/65581fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>溶液</td>
			<td>计算方法</td>
			<td>用于20 g小鼠</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 U/mL 胰岛素</td>
			<td>(2.647 × 体重) μL</td>
			<td>52.9 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1% BSA 生理盐水</td>
			<td>300 μL - 胰岛素体积 (μL)</td>
			<td>247.1 μL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：配制胰岛素输注液的计算示例。

高血糖钳夹法用于在维持较高血糖浓度的条件下测定胰岛素的释放。低血糖钳夹法用于测定由反向调节反应诱导的葡萄糖生成。这两种方法采用相同的手术操作。本文中，我们介绍一种用于评估全身葡萄糖代谢的钳夹技术。

糖尿病（DM）由胰腺β细胞胰岛素分泌不足（1型DM）以及肌肉、肝脏等组织对胰岛素的敏感性下降（2型DM）所致。

我们的研究探讨大脑如何调节血糖水平的稳态，以及哪些神经元、神经肽和神经回路参与这一过程。此外，进食记忆、心理压力、疼痛及其他躯体感觉如何受到影响？准确评估葡萄糖代谢十分困难。我们必须检测胰岛素分泌和反向调节反应中的胰岛素敏感性或胰岛素抵抗。我们还应检测哪些组织改变了葡萄糖的摄取和葡萄糖的生成，以评估胰岛素敏感性或胰岛素抵抗。我们认为，不仅胰岛素敏感性，而且胰岛素分泌和反向调节反应在健康状态下均会影响正常的血糖水平。我们正致力于全面理解大脑对葡萄糖的调控机制。我们的实验方案成本低廉，无需使用特殊且昂贵的设备即可建立钳夹技术。这将使研究人员能够方便、快速地开展钳夹实验。由于本方案可帮助研究人员非常便捷地使用夹具，我们预期该方案将促进生命科学整个领域的更多研究。首先，准备好所有所需的无菌管路、聚丙烯材料和缝合线。在组装颈静脉导管或管路1.1时，取8厘米长的聚丙烯管路一，将其一端用3厘米长的聚乙烯管路二粘合。然后将两毫米长的导管一端置于导管二的开口端。对于颈动脉插管或导管1.3，将导管二的一端拉伸使其变细，然后以与之前相同的方式将另一端与导管一连接。从变细的一端或尖端起，在九毫米处做一标记。手术过程中，将肝素化生理盐水注入已组装好的颈静脉和颈动脉导管中，并将每根导管连接至装有非锐利针头的1毫升注射器。使用将3号导管一端封口制成的帽封闭导管末端。开始手术时，将适当麻醉的小鼠置于37摄氏度的保温垫上，以减少其生理应激。用10%聚维酮碘对两个已剃毛的切口部位各擦拭三次，随后用无菌70%酒精擦拭。在胸骨头侧5毫米处做一垂直切口，分离迷走神经后暴露右侧颈总动脉。在动脉下方穿入两根丝线，一根在近心端（头侧）结扎以阻断血流，另一根松放在远心端（尾侧）备用。在动脉下方再缝一针。使用弹簧剪刀，在靠近颅侧缝合处剪断动脉，将颈动脉导管插入其中，并松松地结扎动脉和导管。保持套索侧结处于开放状态，插入导管，直至导管上的9毫米刻度线到达中间的结扎处。牢固结扎所有结扎线后，用肝素化无菌生理盐水冲洗导管。接下来，从与右侧颈总动脉相同的切口暴露右侧颈静脉。用丝线结扎分离出的头端，并将缝线置于暴露静脉的尾端。使用弹簧剪在颅缝附近剪断静脉。将连接在注射器上的颈静脉导管插入静脉并结扎固定。在肉眼确认其采集到血液前，先用 0.2 毫升含肝素的无菌生理盐水冲洗，并肉眼确认导管内无残留血液。按照之前演示的方法擦拭背部第二个切口部位后，在肩胛骨之间做一个小切口。从背部切口处将持针器经皮下穿过至腹侧。用持针器夹住已植入的导管，将其经皮下引过，并拉出至体外。清洁切口部位后，使用合成缝线缝合腹部切口。然后缝合背部切口。在肩胛骨之间的切口处，用微型止血夹夹住静脉导管。在夹子上方1厘米处剪断导管，并用肝素化生理盐水冲洗，然后用帽封闭。术后用酒精消毒垫清洁切口周围的皮肤。遵循正确的术后护理和监测措施。首先建立低血糖或高血糖钳夹实验的泵系统。具体操作为：将胰岛素输注液和30%葡萄糖溶液分别装入两个Hamilton注射器中。将装满溶液的注射器连接至延长管装置中用于葡萄糖和胰岛素输注的两条长管上。将注射器组件连接至相应的注射泵后，将每种溶液分别注入对应的延长管中。接着，用一毫升注射器及其延长管吸入生理盐水，用于从动脉抽血。然后，将用于输注的延长管连接至已适当麻醉小鼠预先植入的颈静脉导管，将用于抽血的延长管连接至动物的颈动脉导管。使用透明胶带将导管固定在一起。将带有导管的小鼠放入一个装有垫料的500毫升空烧杯中。在将延长管的顶端连接至新的注射器时，夹住其顶端以防止血液流出。抽取50 µL血液，转移至1.5 mL离心管中，并测定血糖水平。随后输注50 µL生理盐水。为收集用于激素测定的血液，再额外抽取50 µL血液，并转移至置于冰上的1.5 mL离心管中。在零分钟血糖测量后，启动胰岛素注射泵以输注适当剂量的胰岛素。在120分钟的监测时间内，持续测量血糖水平，并每5至10分钟调整一次葡萄糖输注速率，直至达到稳态。对于高血糖钳夹实验，参照低血糖钳夹实验的步骤进行操作，但不进行胰岛素输注，并调整至目标稳态血糖水平。

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