LTE的制备与优化 Leishmania tarentolae 衍生的无细胞蛋白表达系统用于重组蛋白生产

我们的无细胞蛋白表达系统通常需要冷链运输，而现在已推出开创性的冻干版本。该版本在常温下保持稳定，成为首个以这种形式提供的真核表达系统，从而简化了向实验室及野外应用环境的运输过程。

无细胞蛋白质生产的当前实验挑战包括优化反应条件，以确保重组蛋白正确折叠并具有活性。尽管无细胞技术与传统体内蛋白质表达相比在成本效益方面仍面临重大挑战，但我们的真核生物LTE无细胞系统的简便性有助于缓解这一问题。LTE无细胞系统可快速重建并分析蛋白质网络和生物合成途径。

它与AlphaLisa和体内检测等技术的结合，能够对复杂系统进行功能分析，包括SARS-CoV-2的蛋白质相互作用网络和钩虫分泌组。LTE无细胞系统能够以多重形式快速、低成本地生产难以表达的蛋白质。该系统易于优化蛋白质合成，尤其擅长生成复杂或有毒性的蛋白质。

该系统具有可扩展性，且能提供稳定一致的批次间质量。首先，收集利什曼原虫（Leishmania tarentolae）的过夜培养物。用培养基将培养物稀释10倍后，于600纳米波长处测定其收获液的光密度。

计算目标浓缩体积，以获得在600纳米处终末光密度为300的样品。将收获的细胞培养物转移至适当的离心管中，在4摄氏度下以2,500g离心10分钟。然后小心地将上清液倾倒至容器中，作为培养废弃物处理。

用 500、200 和 20 毫升 SEB 缓冲液洗涤细胞沉淀。然后将用 SEB 重悬的浓缩液倒入一个合适且已洗涤过的量筒中。用冷的 SEB 定容至目标体积，再用移液器轻轻混匀。

将细胞浓缩物转移至预冷的、加压至70巴的氮气破壁装置中，在冰上孵育45分钟。接着，打开破壁装置的排气阀，将裂解液排入置于冰上的洁净真空接收瓶中。然后将裂解液转移至离心管中，在4°C条件下以10,000 G离心15分钟。

将上清液转移至新的离心管后，在4°C条件下以30,000g离心15分钟。然后将上清液转移至置于冰上的新离心管中。每10毫升裂解液设置四根PD-10重力驱动凝胶过滤柱，将其置于支架中，确保柱体可将液体滴入合适的收集托盘。

向每个柱中加入 2.5 毫升裂解液。待裂解液完全进入柱中后，加入 0.5 毫升洗脱缓冲液以沉降裂解液。移除废液托盘，并在柱下方放置新的收集托盘。

然后加入2.5毫升洗脱缓冲液，以洗脱凝胶过滤后的裂解液。将凝胶过滤后的裂解液收集至新的离心管中。接着，使用NanoDrop分光光度计在280纳米处测定过滤后裂解液的吸光度。

按2:5的比例向裂解液中加入五倍体积的培养液，充分涡旋混匀。将混合液分装至1.5毫升微量离心管中，随后在液氮中快速冷冻，以供后续使用。