Name: 使用灌注小鼠肝脏模型量化肝葡萄糖生成、尿素生成和脂肪分解 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: 学习使用原位灌注小鼠肝脏模型实时量化肝糖生成、尿素生成和脂肪分解。该技术保持完整肝组织结构，可维持至少三小时活性，为研究肝脏代谢调控及脂肪肝、糖尿病等代谢性疾病提供高转化价值的研究方法。

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本研究由诺和诺德基金会卓越新兴研究者资助——内分泌学与代谢（申请号 NNF19OC0055001）、欧洲糖尿病研究基金会未来领袖奖（NNF21SA0072746）以及丹麦独立研究基金，Sapere Aude（1052-00003B）提供支持。诺和诺德基金会蛋白质研究中心的经费由诺和诺德基金会提供（资助协议号 NNF14CC0001）。图1B使用biorender.com制作。&#160;我们感谢诺和诺德公司（Novo Nordisk A/S）的Rune E. Kuhre博士在灌流小鼠肝脏实验方面的有益讨论。&#160;

所有动物实验均获得丹麦动物实验监察局、丹麦环境与食品部（许可证号：2018-15-0201-01397）以及当地伦理委员会的批准，符合欧盟指令2010/63/EU、美国国立卫生研究院（出版物编号85-3）以及丹麦关于动物实验的立法（1987年）的规定。本实验为终点性操作，动物在深度麻醉下通过放血和膈肌穿刺致死。
1. 实验动物
<ol>
	<li>获取所需品系、年龄和性别的小鼠。本研究使用11至16周龄的雄性C57BL/6JRj小鼠。每笼饲养不超过5只雄性或8只雌性小鼠，自由摄食和饮水，维持12小时光照/12小时黑暗循环，光照时间为上午6点至下午6点。</li>
</ol>
2. 术前准备
<ol>
	<li>配制肝脏灌注缓冲液。
	<ol>
		<li>Krebs-Henseleit 缓冲液。混合并溶解 118 mmol/L NaCl、4.7 mmol/L KCl、1.2 mmol/L MgSO₄·7H₂O、1.2 mmol/L KH₂PO₄、25 mmol/L NaHCO₃、11 mmol/L 葡萄糖和 2.5 mmol/L CaCl₂·2H₂O。4，以及 1.2 mmol/L KH2PO4 在 dH₂O 中2O. 溶解 1.25 mmol/L CaCl2 在另一个烧杯中加入缓冲液。</li>
		<li>溶解 25 mmol/L NaHCO₃3 边搅拌边缓慢加入缓冲液中。将缓冲液于4 °C保存。该缓冲液至少可稳定保存1个月。 
		注意：如果 CaCl2 和 NaHCO₃3 在加入前未被单独溶解。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将灌注缓冲液通过一个滤器过滤 2 µm 过滤并用 HCl 调节 pH 至 7.5。 
	注意：此步骤应在实验当天进行，因为即使将溶液储存于密闭烧瓶中，其pH值也会随时间推移而升高。</li>
	<li>将待测化合物配制为高于所需终浓度的浓度例如，当通过侧管泵以0.175 mL/min速率输注时，浓度为20倍）溶于过滤并调节pH的Krebs-Henseleit灌流缓冲液中。如适用，将待测化合物用添加1% BSA作为载体的Krebs-Henseleit灌流缓冲液稀释（以避免黏附于管路和玻璃器皿，此步骤对所有肽类均至关重要），并通过适当孔径滤器过滤。</li>
</ol>
3. 操作与灌注
注意：本研究中使用的灌注装置示意图见图1。
<ol>
	<li>将灌注缓冲液（95% O2, 5% CO2）通气至少30分钟，以向肝脏提供充足的氧气，并在手术开始时维持正确的pH值（在持续通气条件下，碳酸氢盐缓冲系统将达到pH 7.4，参见补充图1）。</li>
	<li>通过腹腔注射给予小鼠氯胺酮（90 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）进行麻醉。</li>
	<li>将小鼠仰卧位固定于加热的手术台上，并通过脚趾夹捏测试确认其反射消失。用70%乙醇喷洒体表，防止毛发粘附于剪刀上。将小鼠固定在温热表面上有助于提高后续操作的稳定性。</li>
	<li>用剪刀在腹部基部做切口，并沿两侧向上剪至肋骨区域，以暴露腹腔。使用棉签将肠道向右侧移位，暴露门静脉。</li>
	<li>使用弯头镊子在门静脉下方放置两根结扎线，并为每根结扎线预先打一个松结。</li>
	<li>将一根0.7 mm的导管插入门静脉。穿刺成功后，从导管中取出针芯，并将导管沿静脉推进，直至导管尖端接近肝脏（如图2所示）。血液会流入导管。</li>
	<li>收紧结扎线。若导管内无血液充盈，需用灌注缓冲液填充导管，以避免引入气泡。</li>
	<li>连接灌注管路，启动滚压泵，以0.8 mL/min的灌注流速，开始以37 °C的Krebs-Henseleit碳酸氢盐缓冲液灌注肝脏。肝脏在数秒内变为苍白。</li>
	<li>用剪刀剪开肋骨和膈肌。此时动物已被安乐死。使用尖头镊子在肝上段下腔静脉下方放置一根结扎线。在小鼠背部下方放置一支笔、卷起的纱布或其他一次性物品，以便更易接近该静脉。</li>
	<li>通过心脏右心房将导管插入肝上段下腔静脉。穿刺成功后，从导管中取出针芯，并将导管沿静脉推进，直至导管尖端接近肝脏。血液和灌注缓冲液立即流出。</li>
	<li>收紧结扎线，并连接收集灌注流出液的导管。使用防水胶带（如光面胶带或类似产品）固定所有管路。</li>
	<li>使用血管夹适配器，在右肾静脉上方的肝下段下腔静脉处放置血管夹，以防止混合（图2）。</li>
	<li>将灌注流速提高至3.5 mL/min，并启动计时器。开始记录压力。成功的灌注通常产生约10 mm/Hg的压力。</li>
	<li>用生理盐水湿润的无菌手术单覆盖肝脏，并在实验过程中定期添加生理盐水，防止肝脏干燥。</li>
	<li>收集灌注流出液1分钟，并测量体积。体积应约为3.5 mL/min。此阶段不应出现血液混合，且心脏已停止跳动。</li>
	<li>在开始实验前，等待30分钟的平衡期。</li>
</ol>
<img alt="肝脏灌注系统设置：恒温循环器、注射泵；示意图显示流体通路。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65596/65596fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：灌注系统的示意图。（A）手术台置于三脚架上并加热至37 °C。灌注缓冲液经气体饱和（95% O2, 5% CO2），通过蠕动滚轴泵输送，并在内置气泡捕集器的热交换器中加热。系统还包括用于调节灌注压力的压力表和螺杆泵。灌注压力通过换能器在计算机上的压力记录程序中持续记录并可视化。（B）红色框内显示了三个三通旋塞的连接方式。第一个三通旋塞打开，用于通过注射泵输注待测化合物，第二个关闭。第三个三通旋塞打开，用于持续测量压力。第四个旋塞可用于采集输入样品，例如对灌注肝脏进行气体分析。连接器可根据特定实验需求调整，以增加或减少输注管路。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65596/65596fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示门静脉、肝脏、肾脏的小鼠解剖图；标注清晰，用于外科实验。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65596/65596fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：小鼠腹腔在肝脏灌注前和灌注过程中的照片。（A）绿色圆点表示门静脉导管尖端的位置。导管尖端必须位于门静脉分叉为左、右肝门静脉的分叉点下方，但位于胰十二指肠分支上方，以避免泄漏。黄色圆点表示血管夹在肝下腔静脉上的正确位置，应位于右肾静脉与肝脏之间，以防止血液反流进入灌注中的肝脏。（B，C）灌注后的小鼠肝脏，门静脉中插入了导管（B），肝上腔静脉中也插入了导管（C），血管夹位于肝下腔静脉（B）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65596/65596fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
4. 实验
<ol>
	<li>在平衡期结束时，使用组分收集器采集第一批基线样本，开始实验。按照所需的时间间隔采集样本，并立即置于冰上。 </li>
	<li>定期检查气泡捕集器，当接近排空时，用灌注缓冲液补充。</li>
	<li>在灌流液进入器官之前，通过三通旋塞收集缓冲液样本；同时从插入下腔静脉（经肝脏灌流后）的收集导管中采集样本。</li>
	<li>使用血气分析仪检测样本，以确认器官具有代谢活性（表现为CO₂分压升高）2 pH降低。</li>
	<li>在实验结束时重复步骤 4.3–4.4，以评估整个实验过程中的细胞活力补充图2). 
	注意：由于氧气会从管路、器官等部位逸出，因此氧分压的降低并不能可靠地反映呼吸作用。</li>
	<li>在基线灌注15分钟后，使用注射泵通过三通旋塞以所需的流速注入测试物质，开始第一次刺激例如，通过侧管泵以0.175 mL/min速率输注时，为测试物质的20倍浓度）。或者，将基础缓冲液更换为含有测试化合物的新缓冲液（已氧合并加热），使其达到最终浓度。</li>
	<li>停止刺激，并在开始第二次刺激前收集基线样本20-30分钟。</li>
	<li>实验结束时，灌注适当的阳性对照5-10分钟。</li>
	<li>实验结束后，切除灌注过的肝脏并称重，以根据肝脏重量对结果进行标准化。将肝脏在液氮中速冻，以备后续检测蛋白质含量，从而根据蛋白质含量对结果进行标准化。</li>
</ol>
5. 生物化学检测
<ol>
	<li>使用适用于灌注缓冲液中检测的分析方法（如实验室自制或商用的比色法或ELISA试剂盒），定量检测目标分子的浓度。该缓冲液适用于大多数基于组学的技术，如代谢组学和蛋白质组学。 
	注意：本研究中，尿素的测定基于先前描述的比色法14。葡萄糖和非酯化脂肪酸则使用商用试剂盒进行定量。</li>
</ol>
6. 数据分析
<ol>
	<li>以XY图展示随时间变化的分泌输出数据。 
	注意：这是该方法的优点之一 体外 灌流系统，可将数据表示为实际输出（浓度 × 流速） 例如, µmol/min）而不是输出中的测量浓度（mmol/L），如 体内 研究中，当比较不同小鼠模型时，可考虑将结果归一化至肝脏重量；当比较对照小鼠与肥胖或肝病小鼠模型时，由于肝脏重量的增加可能源于脂肪含量上升，建议将结果归一化至总蛋白含量（通过BCA法测定）。</li>
	<li>将汇总数据以每个动物对应的单个圆点表示，代表基线期以及刺激期（通常为15–30分钟）的平均值或总输出量，或根据研究设计，使用每个刺激期前的基线计算增量输出。</li>
	<li>使用配对t检验（两组）或单因素重复测量方差分析（多于两组），并结合适当的多重检验事后检验方法对数据进行分析。</li>
</ol>

In Situ Mouse Liver Perfusion Model to Study Metabolic Responses to Substrates

<ol><li>Bale, S. S., Geerts, S., Jindal, R., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+co-culture+of+rat+parenchymal+and+non-parenchymal+liver+cells+to+evaluate+cellular+interactions+and+response%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Isolation and co-culture of rat parenchymal and non-parenchymal liver cells to evaluate cellular interactions and response.</a> Scientific Reports. 6, 25329(2016).</li>
<li>Lauschke, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massive+rearrangements+of+cellular+MicroRNA+signatures+are+key+drivers+of+hepatocyte+dedifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Massive rearrangements of cellular MicroRNA signatures are key drivers of hepatocyte dedifferentiation.</a> Hepatology. 64 (5), 1743-1756 (2016).</li>
<li>Seirup, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+changes+in+chromatin+structure+during+dedifferentiation+of+primary+hepatocytes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Rapid changes in chromatin structure during dedifferentiation of primary hepatocytes in vitro.</a> Genomics. 114 (3), 110330(2022).</li>
<li>Gupta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+in+vitro+human+liver+models+to+in+vivo+human+liver+using+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Archive+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Comparing in vitro human liver models to in vivo human liver using RNA-Seq.</a> Archive of Toxicology. 95 (2), 573-589 (2021).</li>
<li>Bell, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+primary+human+hepatocyte+spheroids+as+a+model+system+for+drug-induced+liver+injury%2C+liver+function%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function, and disease.</a> Scientific Reports. 6, 25187(2016).</li>
<li>Dewyse, L., Reynaert, H., van Grunsven, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practices+and+progress+in+precision-cut+liver+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Best practices and progress in precision-cut liver slice cultures.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 7137(2021).</li>
<li>Li, X., George, S. M., Vernetti, L., Gough, A. H., Taylor, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+glass-based%2C+continuously+zonated+and+vascularized+human+liver+acinus+microphysiological+system+%28vLAMPS%29+designed+for+experimental+modeling+of+diseases+and+ADME%2FTOX%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A glass-based, continuously zonated and vascularized human liver acinus microphysiological system (vLAMPS) designed for experimental modeling of diseases and ADME/TOX.</a> Lab on a Chip. 18 (17), 2614-2631 (2018).</li>
<li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+establishment+of+self-renewing+human+and+mouse+adult+liver+and+pancreas+3D+organoids+and+their+genetic+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1724-1743 (2016).</li>
<li>Bartošek, I., Guaitani, A., Miller, L. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarto%C5%A1ek%2C+I+%22Isolated+Liver+Perfusion+and+its+Applications%22">Isolated Liver Perfusion and its Applications</a>. , Raven Press. New York. (1973).</li>
<li>Gores, G. J., Kost, L. J., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolated+perfused+rat+liver%3A+conceptual+and+practical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The isolated perfused rat liver: conceptual and practical considerations.</a> Hepatology. 6 (3), 511-517 (1986).</li>
<li>Mischinger, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+technique+for+isolated+perfusion+of+rat+livers+and+an+evaluation+of+perfusates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">An improved technique for isolated perfusion of rat livers and an evaluation of perfusates.</a> Journal of Surgical Research. 53 (2), 158-165 (1992).</li>
<li>Vairetti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+the+liver+temperature+employed+during+machine+perfusion+and+reperfusion+damage%3A+role+of+Ca2%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Correlation between the liver temperature employed during machine perfusion and reperfusion damage: role of Ca2.</a> Liver Transplantation. 14 (4), 494-503 (2008).</li>
<li>Ferrigno, A., Richelmi, P., Vairetti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Troubleshooting+and+improving+the+mouse+and+rat+isolated+perfused+liver+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Troubleshooting and improving the mouse and rat isolated perfused liver preparation.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 107-114 (2013).</li>
<li>Zawada, R. J. X., Kwan, P., Olszewski, K. L., Llinas, M., Huang, S. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+determination+of+urea+concentrations+in+cell+culture+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative determination of urea concentrations in cell culture medium.</a> Biochemistry and Cell Biology. 87 (3), 541-544 (2009).</li>
</ol>

作者声明本文不存在相关利益冲突。

离体灌注小鼠肝脏是研究肝脏代谢动态变化及分子机制的强有力研究工具。其能够实现分钟级取样，从而详细评估待测化合物对肝脏的直接作用。与 在 活体研究中，灌注肝脏使我们能够以隔离方式研究肝脏代谢，避免血液携带的肝外因素干扰，并对实验条件实现完全控制。与之相比，肝脏灌注的优势在于 体外 使用分离肝细胞的研究中，肝脏灌注的优势在于能够维持肝脏的结构完整性、细胞极性、分区特征以及血管系统的完整。另一个优势是灌注液样本量较大（3.5 mL/min），可在同一样本中检测多个指标。然而，在研究依赖转录调控效应时，灌注肝脏模型并非理想选择，因为此类机制可能需要数小时才能显现。除代谢研究外，该方案还可应用于其他研究领域，用于探讨肝脏的内分泌功能（如激素和肝源性因子的分泌）以及肝脏对药物和外源性物质的代谢。
该方法最关键的步骤是将导管放置于门静脉内。导管尖端必须准确定位于门静脉分为左右肝门静脉分支之前的部位（图2）。如果导管插入过深，则仅有部分肝脏能够得到充分灌注；若导管位置过于靠近门静脉远端，则可能发生经胰十...

肝脏是代谢过程中的重要器官，通过调节葡萄糖、脂质和氨基酸代谢，在全身能量平衡的调控中发挥关键作用。全球范围内肝脏疾病的增加正成为一项重大的公共卫生负担，迫切需要进一步了解其病理生理机制及其对肝脏功能的影响。
各种 体外 已开发出多种模型用于肝脏研究，以作为补充 体内 研究中广泛使用从啮齿类动物和人类分离并培养的原代肝细胞。利用差速离心和梯度离心可将非实质细胞与肝细胞分离，不同类型细胞的共培养对于研究细胞间相互作用具有重要意义。1尽管原代人肝细胞被认为是检测药物毒性的金标准，但多项研究表明，这些肝细胞在组织培养中会迅速去分化，导致肝功能丧失2,3,4. 三维球状体系统中的肝细胞培养可改善去分化现象，具有更高的稳定性，并且更接近模拟肝脏功能 体内 比传统的二维培养系统更高程度5精密切割肝组织片是另一种成熟的方法 体外 保持肝脏组织结构完整并包含肝脏中非实质细胞的模型6更高级的 体外 模型包括肝脏芯片7 和肝类器官8然而，采用所有这些方法时，均存在结构完整性和血流动力学的损失，包括门静脉-肝静脉的定向血流，这可能影响结果的普适性。
离体灌注大鼠肝脏最早由 Claude Bernard 于1855年描述9，至今仍广泛应用于肝脏生物学、毒理学和病理生理学等领域的科学研究。与上述体外（in vitro）模型相比，灌注肝脏的优势包括保留肝脏的组织结构、血管灌注、肝细胞极性与分区特性，以及肝细胞与非实质细胞之间的相互作用。与体内（in vivo）研究相比，灌注肝脏可在排除血液携带的肝外因素干扰的情况下，独立地研究肝脏代谢，并实现对实验条件的完全控制。多年来，研究人员对大鼠肝脏灌注模型进行了多项改进10,11,12,13。尽管小鼠也已被用于离体灌注肝脏研究，但相关文献报道较少。本文介绍一种通过门静脉和肝后下腔静脉插管实现小鼠肝脏原位（in situ）灌注的方法，用于实时测定小鼠肝静脉流出液中肝脏对代谢底物和激素的急性直接代谢反应。

<table><tbody><tr><td>三通旋塞阀</td><td>BD</td><td>394601</td><td></td></tr><tr><td>Altromin 繁殖饲料</td><td>Altromin Spezialfutter</td><td>1319</td><td></td></tr><tr><td>二水合氯化钙（CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#183;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O）</td><td>Sigma</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>导管（0.7 mm）</td><td>BD</td><td>381812</td><td></td></tr><tr><td>滤纸（孔径 2.0 &amp;#181;m）</td><td>Millipore</td><td>AP2029325</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖检测试剂盒</td><td>QuantiChromTM</td><td>DIGL-100</td><td>低浓度方案</td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>MSD Animal Health</td><td>511485</td><td>90 mg/kg</td></tr><tr><td>结扎线（黑色无菌丝线）</td><td>Agnthos</td><td>14739</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镁（MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;）</td><td>Sigma</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>非酯化脂肪酸检测试剂盒</td><td>Fujifilm Wako Chemicals</td><td>NEFA-HR(2)</td><td></td></tr><tr><td>加热式手术台，三脚架支架，型号 873</td><td>Harvard Bioscience, Inc.</td><td>733776</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾（KCl）</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾（KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;）</td><td>Merck</td><td>1.04877</td><td></td></tr><tr><td>滚柱泵，四通道</td><td>Harvard Bioscience, Inc.</td><td>730100</td><td></td></tr><tr><td>医用胶带</td><td>Mediq danmark</td><td>4001910</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠（NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;）</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Sigma</td><td>S1679</td><td></td></tr><tr><td>恒温循环器</td><td>Harvard Bioscience, Inc.</td><td>730125</td><td>浴槽体积 3 L，230 V/50 Hz</td></tr><tr><td>管路</td><td>Tygon</td><td>E3603</td><td>内径 1.59 mm，外径 3.18 mm</td></tr><tr><td>通用灌流系统</td><td>Harvard Bioscience, Inc.</td><td>732316</td><td>基本单元 uniper UP-100，型号 834</td></tr><tr><td>Vamin</td><td>Fresenius Kabi</td><td>B05ABA01</td><td>混合氨基酸</td></tr><tr><td>血管夹适配器</td><td>Deutsche Biomedical</td><td>DBC1002</td><td></td></tr><tr><td>血管夹</td><td>Deutsche Biomedical</td><td>DBC1005</td><td></td></tr><tr><td>Windkessel</td><td>Harvard Bioscience, Inc.</td><td>732068</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>Rompun Vet</td><td>530701</td><td>10 mg/kg</td></tr></tbody></table>

利用灌流小鼠肝脏模型定量测定肝葡萄糖生成、尿素生成及脂解作用

Hepatic Glucose Production, Ureagenesis, and Lipolysis Quantified using the Perfused Mouse Liver Model

肝脏具有多种功能，包括营养物质代谢。与其他器官相比 体外 和 体内 肝脏研究模型中，离体灌注肝脏技术可在完整肝组织结构条件下，将肝脏与肝外因素的影响相分离，从而对整个肝脏的生物学特性及代谢过程进行研究。肝脏灌注技术最初为大鼠建立，但该方法也已成功应用于小鼠。本文描述了一种小鼠离体肝脏灌注的实验方案 原位 小鼠肝脏灌流。通过门静脉顺行灌流含氧的Krebs-Henseleit碳酸氢盐缓冲液，并夹闭肝下下腔静脉，从肝上下腔静脉收集流出液，以形成闭合回路。利用该方法，可对受试化合物的直接肝脏效应进行高时间分辨率的详细评估。肝脏功能和活性至少可稳定维持3小时，允许在同一实验中设置内部对照。该模型具有广泛的实验应用潜力，有助于深入理解肝脏生理学及肝脏疾病机制。

为了确定某种刺激物或底物是否引起目标分子的释放，必须具备稳定的基线。图3A展示了一项成功实验的示例。灌注肝脏中尿素的生成以每2分钟为间隔进行测定，结果以均值±标准误（SEM）表示。每次刺激前的基线期均保持稳定。图3B显示了两次刺激期间及其相应基线期的平均尿素生成量。各时间段之间的统计学差异采用重复测量单因素方差分析（one-way ANOVA）进行检验。根据这些结果可以得出结论：连续两次使用混合氨基酸刺激所引发的尿素反应相似，这一结果是评估不同剂量或测试化合物重复刺激效应时重要的对照实验。
除了尿素生成外，还可利用上述方案研究肝脏糖原分解和脂解作用。图3C-F展示了另一项实验中胰高血糖素输注期间的数据。葡萄糖...

在此，我们介绍一种可靠的实验方法 原位 通过灌注小鼠肝脏，在不破坏肝脏结构但排除肝外因素干扰的条件下，研究肝脏代谢的急性与直接调控机制。

肝脏具有多种功能，包括营养物质代谢。与其它体外及体内肝脏研究模型相比，离体灌注的……

在我们的实验室中，我们研究肝脏对常见及罕见肝病的反应，以及这些适应性变化如何导致糖尿病前期状态。肝脏会通过相关基因的转录增加来响应营养物质可用性及激素浓度的变化，但更重要的是，也通过急性且非转录性的调控机制作出反应。利用灌流肝脏模型，我们可以对代谢的所有方面进行定量分析，包括以分钟级分辨率检测代谢物的释放情况。与其它体外模型相比，该技术的优势在于肝脏保持原位且肝组织结构完整，且肝脏活性可维持至少三小时，使得每只小鼠的肝脏均可作为自身的对照，从而显著提高实验结果的转化应用价值。利用小鼠灌流肝脏系统，我们能够鉴定并表征胰高血糖素激素的新型信号级联通路。这一发现可能具有重要意义，因为胰高血糖素以及其他激素可能在脂肪肝疾病和糖尿病患者肝脏的代谢紊乱状态中发挥关键作用。首先，将麻醉后的C57 Black 6 JRJ小鼠仰卧置于加热的手术台上。通过捏压脚趾确认其无反射反应。用70%乙醇喷洒小鼠体表，以防止毛发粘附在剪刀上。使用剪刀在基部做腹部切口，沿两侧向上剪至肋骨处，以暴露腹腔。用棉签将肠道移至右侧，暴露门静脉。使用弯钳，在门静脉下方放置两根结扎线，并将每根结扎线松松地系上。接下来，将一根0.7毫米的导管插入门静脉。穿刺成功后，将针头从导管中取出，并引导导管沿静脉推进，直至导管尖端接近肝脏。然后，扎紧结扎线。观察肝脏。设置滚压泵的流速，并连接灌注管。在 37 摄氏度下开始对肝脏进行灌注。当肝脏变为苍白色后，使用剪刀剪开肋骨和膈肌。然后，用尖头镊子将结扎线置于肝上段下腔静脉下方。接着，通过心脏的右心房将导管插入肝上段下腔静脉。穿刺成功后，拔出针头，将导管沿静脉向肝脏方向送入。随后扎紧结扎线。连接收集灌流液的导管，并用防水胶带固定所有导管。使用血管夹适配器，将血管夹置于肝下腔静脉、右肾静脉上方，以防止灌注液残留混合。随后，将灌注流速提高至 3.5 毫升每分钟。启动计时器并开始记录压力。用无菌纱布覆盖肝脏，并以生理盐水润湿。平衡 30 分钟，并测量流出液的体积。平衡 30 分钟后，开始实验并收集第一份基线样品至组分收集器中。定期监测气泡捕集器，当其中液体接近排空时，及时补充灌注缓冲液。在缓冲液进入器官之前，通过三通旋塞收集样本，并从插入下腔静脉的收集导管中获取另一份样本。使用血气分析仪检测所收集的样本，以确认器官具有代谢活性。在基础灌注15分钟后，使用注射泵通过三通旋塞以所需的流速注入测试物质，开始第一次刺激。在第一次刺激结束后，于第二次刺激开始前收集20至30分钟的基础样本。在每次刺激前均保持稳定基础期的灌注肝脏中尿素的生成表明，尿素对连续两次混合氨基酸刺激的反应具有一致性。在胰高血糖素输注前，葡萄糖和非酯化脂肪酸呈现稳定的基础释放；而在胰高血糖素输注期间，两者水平显著升高。基础状态与胰高血糖素输注期间的平均值表明，胰高血糖素可迅速刺激肝糖原分解和脂解作用。然而，若缺乏稳定的基础期，则无法区分前后相继的尿素反应。

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使用灌注小鼠肝脏模型量化肝葡萄糖生成、尿素生成和脂肪分解

从头脂肪生成和β-脂肪酸氧化是肝细胞中的关键代谢途径，这些途径在多种代谢性疾病（包括脂肪肝病）中发生紊乱。本文中，我们演示了小鼠原代肝细胞的分离，并描述了β-脂肪酸氧化和脂肪生成的定量方法。...

小鼠原代肝细胞中脂肪酸氧化与脂质生成的测定

此处优化了生成方法 体内 和 体外 描述了肝脂肪变性模型的建立方法，以及对脂肪变性表型和相关生理参数的分析。...

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多囊卵巢综合征小鼠模型中肝糖生成的评估

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Ex Vivo 小鼠门静脉肝脏灌注

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通过原位肝脏灌注评估小鼠胰岛素清除率

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通过完整胰腺小鼠血管灌注进行葡萄糖刺激的胰岛素分泌

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通过进行实验可实现对动物器官生理学的研究 离体 灌流系统。将猪肾作为一种稳态器官，添加到我们先前开发的 离体...

自体操作步骤 离体 灌流猪肝脏-肾脏实验

学习使用原位灌注小鼠肝脏模型实时量化肝糖生成、尿素生成和脂肪分解。该技术保持完整肝组织结构，可维持至少三小时活性，为研究肝脏代谢调控及脂肪肝、糖尿病等代谢性疾病提供高转化价值的研究方法。

利用灌流小鼠肝脏模型定量测定肝葡萄糖生成、尿素生成及脂解作用

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