利用灌流小鼠肝脏模型定量测定肝葡萄糖生成、尿素生成及脂解作用

在我们的实验室中，我们研究肝脏对常见及罕见肝病的反应，以及这些适应性变化如何导致糖尿病前期状态。肝脏会通过相关基因的转录增加来响应营养物质可用性及激素浓度的变化，但更重要的是，也通过急性且非转录性的调控机制作出反应。利用灌流肝脏模型，我们可以对代谢的所有方面进行定量分析，包括以分钟级分辨率检测代谢物的释放情况。

与其它体外模型相比，该技术的优势在于肝脏保持原位且肝组织结构完整，且肝脏活性可维持至少三小时，使得每只小鼠的肝脏均可作为自身的对照，从而显著提高实验结果的转化应用价值。利用小鼠灌流肝脏系统，我们能够鉴定并表征胰高血糖素激素的新型信号级联通路。这一发现可能具有重要意义，因为胰高血糖素以及其他激素可能在脂肪肝疾病和糖尿病患者肝脏的代谢紊乱状态中发挥关键作用。

首先，将麻醉后的C57 Black 6 JRJ小鼠仰卧置于加热的手术台上。通过捏压脚趾确认其无反射反应。用70%乙醇喷洒小鼠体表，以防止毛发粘附在剪刀上。

使用剪刀在基部做腹部切口，沿两侧向上剪至肋骨处，以暴露腹腔。用棉签将肠道移至右侧，暴露门静脉。使用弯钳，在门静脉下方放置两根结扎线，并将每根结扎线松松地系上。

接下来，将一根0.7毫米的导管插入门静脉。穿刺成功后，将针头从导管中取出，并引导导管沿静脉推进，直至导管尖端接近肝脏。然后，扎紧结扎线。

观察肝脏。设置滚压泵的流速，并连接灌注管。在 37 摄氏度下开始对肝脏进行灌注。

当肝脏变为苍白色后，使用剪刀剪开肋骨和膈肌。然后，用尖头镊子将结扎线置于肝上段下腔静脉下方。接着，通过心脏的右心房将导管插入肝上段下腔静脉。

穿刺成功后，拔出针头，将导管沿静脉向肝脏方向送入。随后扎紧结扎线。连接收集灌流液的导管，并用防水胶带固定所有导管。

使用血管夹适配器，将血管夹置于肝下腔静脉、右肾静脉上方，以防止灌注液残留混合。随后，将灌注流速提高至 3.5 毫升每分钟。启动计时器并开始记录压力。

用无菌纱布覆盖肝脏，并以生理盐水润湿。平衡 30 分钟，并测量流出液的体积。平衡 30 分钟后，开始实验并收集第一份基线样品至组分收集器中。

定期监测气泡捕集器，当其中液体接近排空时，及时补充灌注缓冲液。在缓冲液进入器官之前，通过三通旋塞收集样本，并从插入下腔静脉的收集导管中获取另一份样本。使用血气分析仪检测所收集的样本，以确认器官具有代谢活性。

在基础灌注15分钟后，使用注射泵通过三通旋塞以所需的流速注入测试物质，开始第一次刺激。在第一次刺激结束后，于第二次刺激开始前收集20至30分钟的基础样本。在每次刺激前均保持稳定基础期的灌注肝脏中尿素的生成表明，尿素对连续两次混合氨基酸刺激的反应具有一致性。

在胰高血糖素输注前，葡萄糖和非酯化脂肪酸呈现稳定的基础释放；而在胰高血糖素输注期间，两者水平显著升高。基础状态与胰高血糖素输注期间的平均值表明，胰高血糖素可迅速刺激肝糖原分解和脂解作用。然而，若缺乏稳定的基础期，则无法区分前后相继的尿素反应。