Name: 在小鼠模型中使用 Punch-Trephine 技术诱导角膜和角膜缘碱损伤 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-04T12:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: 了解Punch-Trephine技术在小鼠模型中诱导角膜和角膜缘碱损伤的方法。该技术可精确控制损伤范围，为研究角膜再生和干细胞治疗提供标准化动物模型。

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我们感谢NEI P30-EY026877对本研究的支持。我们非常感谢斯坦福大学干细胞生物学与再生医学研究所Charlene Wang以及Irv Weissman博士实验室在提供实验动物方面给予的大力支持与帮助。我们感谢Hirad Rezaeipoor在图像制备与编辑过程中提供的协助。

所有操作均按照斯坦福大学实验动物护理与使用委员会批准的APLAC编号33420、动物用于科学研究的规定，以及ARVO关于在眼科与视觉研究中使用动物的声明进行。共使用了10只8至12周龄的雄性和雌性C57BL/6小鼠，由Irving L. Weissman实验室慷慨提供。动物在12小时光照-黑暗循环环境中适应性饲养，并可自由获取水和饲料。ad libitum。对每只动物的一只眼睛诱导损伤。
1. 实验准备
<ol>
	<li>材料准备 
	注意：所有试剂均需在室温下保存。
	<ol>
		<li>制备穿孔环钻：准备一个直径为 3.5 mm 的皮肤活检穿孔器，并在其杆部距离远端边缘 5 mm 处做标记。将穿孔器牢固固定后，使用双速旋转工具切割其杆部已标记的远端部分。操作过程中需佩戴护目镜。在 3.5 mm 深度处切断杆部，保留最后 1.5 mm 连接部分。将尖端弯曲成 90˚，如图 1所示。</li>
		<li>通过将 1 g NaOH 溶解于 50 mL 蒸馏水中，制备 0.5 M NaOH 溶液。</li>
		<li>通过混合 2 mL 的 100 mg/mL 氯胺酮和 1 mL 的 20 mg/mL 赛拉嗪，制备 10 mL 麻醉混合液。注射前用 7 mL 的 0.9% NaCl（生理盐水）稀释该混合物。</li>
		<li>将 0.1 mL 的 10% AK-Fluor 荧光液体加入 9.9 mL 无菌磷酸盐缓冲液（1× PBS）中，制备 0.1% 荧光素钠溶液。</li>
		<li>通过将 8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4 和 0.23 g NaH2PO4 溶解于 900 mL 蒸馏水中，制备 PBS（1×）。调节溶液 pH 至 7.4，再用蒸馏水定容至 1 L。</li>
		<li>制备用于固定的 4% 多聚甲醛（PFA）溶液。在通风橱中，将 2 g PFA 溶解于 45 mL PBS 中。将混合物加热至 65 °C，并滴定其 pH 至 7.4。待 PFA 完全溶解后，用 PBS 定容至 50 mL。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 动物准备
<ol>
	<li>称重小鼠以确定注射用麻醉剂混合物的合适注射体积。按照 Machholz 等人所述方法正确抓取并固定小鼠后15，以 0.01 mL/g 的剂量将麻醉剂混合物进行腹腔内（IP）注射16,17。腹腔注射时应选择腹部下象限区域，以避免损伤内脏器官。</li>
	<li>皮下注射缓释型布托啡诺注射用混悬液（3.25 mg/kg），以在手术期间及术后提供额外镇痛，因为角膜碱烧伤极为疼痛。</li>
	<li>等待小鼠达到深度麻醉状态。通过脚趾夹捏无反应来判断是否成功达到深度麻醉状态。&#160;在开始手术前，为对侧眼睛涂抹普通眼膏以防止其干燥。       </li>
	<li>麻醉完成后，将小鼠置于根据标准啮齿类动物手术原则准备的手术台上18。在小鼠头部下方放置一个高度为 5 mm 的枕头，并使其处于侧卧位。该枕头有助于在手术过程中支撑小鼠头部。</li>
	<li>滴加盐酸四甲卡因（0.5%）滴眼液以进一步麻醉。使用外科眼用棉签适当干燥眼表，并修剪眼睫毛。</li>
</ol>
3. 诱导碱烧伤
<ol>
	<li>手术开始前，按照标准的啮齿类动物手术原则整理手术台18,19&#160;，并在手术过程中保持手术区域无菌。调整手术显微镜位置，以便清晰观察麻醉后的小鼠，并将计时器设定为30秒。将拧干的纸巾置于动物鼻部，以防止冲洗过程中发生意外的鼻腔吸入。</li>
	<li>使用手术显微镜确定角膜缘区域周长，同时用拇指和食指将小鼠眼睑充分打开。轻轻握住干净的角膜打孔刀，使其与眼球轴线平行，不要施加向下的压力。避免旋转器械，并始终保持打孔刀的轴线与眼球轴线平行。</li>
	<li>请手术助手将3滴NaOH溶液（相当于40 µL）滴入打孔刀的孔洞中，以充满器械并充分覆盖角膜表面。液体的表面张力可防止其从器械中泄漏（图1）。 
	注意：我们使用带有27G针头的1 mm注射器，针头尖端压扁并呈50°角，以便精确滴加NaOH溶液。</li>
	<li>30秒后，立即用5 mL PBS（1x）冲洗角膜及穹窿部。视频1展示了化学损伤诱导的操作过程。</li>
	<li>使用通用pH指示试纸确认受伤眼的角膜表面pH值为7–7.5。随后，在化学损伤的眼表涂抹三种抗生素眼膏。 
	注意：手术过程中若出现尾巴活动，提示麻醉深度不足。应通过腹腔注射追加麻醉混合液（氯胺酮+赛拉嗪）[追加剂量为初始体积的50%（IP）]&#160;&#160;。</li>
	<li>手术后，确认小鼠处于稳定状态。若动物有疼痛表现，给予第二次丁丙诺啡。操作手法同2.2节所述。在动物仍处于麻醉状态下开始术后检查。</li>
	<li>操作结束后，使用70%乙醇清洗、干燥并消毒角膜打孔刀及手术台。</li>
</ol>
4. 临床评估
<ol>
	<li>进行检查时，按照之前步骤 2.1 所述方法麻醉小鼠。</li>
	<li>在裂隙灯生物显微镜下检查眼睛（受伤眼和未受伤眼）。使用相机拍摄照片（本研究中使用了手机相机的电影模式）。</li>
	<li>根据 Yoeruek 评分系统20对角膜混浊程度进行评分：0 = 正常、透明角膜；1 = 轻度混浊；2 = 混浊更明显，但虹膜和瞳孔仍清晰可辨；3 = 虹膜和瞳孔勉强可辨；4 = 角膜完全不透明，瞳孔不可见。</li>
	<li>滴加 0.1% 荧光素眼药水。用棉签吸干多余的荧光液体，使用钴蓝滤光片观察是否存在角膜上皮缺损，并拍照记录。</li>
	<li>持续监测动物，直至其恢复足够的意识以维持胸卧位。在动物完全恢复前，不得将其重新放入与其他动物共处的环境中。</li>
</ol>
5. 去核
<ol>
	<li>在化学损伤诱导后2周，通过颈椎脱位法在3-5秒内处死小鼠21。</li>
	<li>摘除眼球，保留内侧半月皱襞及完整的睑结膜，操作顺序如视频2所示。</li>
	<li>在手术显微镜下，仔细分离半月皱襞与皮肤的连接处。使用有齿镊牵拉半月皱襞，并将手术剪尖端沿睑结膜下方引导至其与睑板的连接处。</li>
	<li>沿粘连线剪开结膜至外眦。随后，将手术剪转向结膜与下睑板在结膜下平面的交界处。</li>
	<li>完成结膜解剖后，用拇指和食指从鼻侧牵拉上、下眼睑。在牵拉的同时，将弯头镊尖端绕至突出的泪腺后方并导向视神经。牢固夹住视神经，完整摘出眼球（图2）。</li>
	<li>用PBS（1×）冲洗眼球，然后将其转移至固定液中。</li>
</ol>
6. 苏木精和伊红（H&amp;#38;E）染色与过碘酸-希夫（PAS）染色
<ol>
	<li>将眼球置于10%福尔马林溶液中，室温下固定过夜。</li>
	<li>使用梯度浓度的乙醇依次进行脱水处理，分别为70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇和100%乙醇，每次处理10–15分钟。随后将眼球浸入二甲苯中10分钟。最后将眼球包埋于石蜡中。</li>
	<li>将石蜡包埋块切成6 µm厚的切片，并贴附于载玻片上，用于苏木精-伊红（H&amp;#38;E）染色和过碘酸-希夫（PAS）染色，具体操作详见补充文件1。</li>
</ol>
7. 免疫荧光成像与分析
<ol>
	<li>进行免疫组织化学研究（IHC）时，将眼球置于含有4%多聚甲醛的1 mL PBS（1x）中，在4 ˚C下固定过夜。用1 mL PBS（1x）洗涤样本3次，每次5分钟。</li>
	<li>为防止冰晶形成并保护蛋白质的分子结构，使用10%蔗糖、20%蔗糖和30%蔗糖浓度的PBS进行梯度蔗糖饱和处理。将眼球包埋于光学相干断层扫描溶液（OCT；图2）中，并在-80 °C下保存。</li>
	<li>将OCT包埋块切成12 µm厚的切片，并贴附于玻璃载玻片上，用于IHC染色。</li>
	<li>在载玻片上的组织切片中加入含0.1% Triton X−100的PBS（1x），通透处理15分钟。随后，在室温下用含5% BSA的PBS（1x）封闭非特异性抗原位点，持续1小时。</li>
	<li>将载玻片上的组织切片与用含1% BSA的PBS（1x）配制的目标一抗混合液在4 °C下孵育过夜。本实验中使用的一抗为1:100稀释的兔抗角蛋白13（K13）和抗角蛋白12（K12）抗体，其浓度分别为2.24 µg/mL和1.56 µg/mL。</li>
	<li>孵育后，用PBS（1x）洗涤载玻片上的组织切片3次。随后，使用1:500稀释的驴抗兔IgG二抗检测结合的一抗，在4 ˚C避光孵育1小时。然后用PBS（1x）洗涤3次，每次5分钟。</li>
	<li>在载玻片的组织切片上滴加含DAPI的抗荧光淬灭封片剂，加盖盖玻片。将样本置于避光环境中干燥，并在相同激光设置条件下，使用荧光显微镜观察正常眼和损伤眼的切片。</li>
</ol>

A Modified Biopsy Punch Method for Precise Alkali Burns in Mice

<ol><li>Sridhar, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+cornea+and+ocular+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Anatomy of cornea and ocular surface.</a> Indian Journal of Ophthalmology. 66 (2), 190-194 (2018).</li>
<li>Robaei, D., Watson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+blindness%3A+a+global+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Corneal blindness: a global problem.</a> Clinical & experimental Ophthalmology. 42 (3), 213-214 (2014).</li>
<li>Lamm, V., Hara, H., Mammen, A., Dhaliwal, D., Cooper, D. K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+blindness+and+xenotransplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Xenotransplantation%22%5BJournal%5D)">Corneal blindness and xenotransplantation.</a> Xenotransplantation. 21 (2), 99-114 (2014).</li>
<li>Danjo, S., Friend, J., Thoft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjunctival+epithelium+in+healing+of+corneal+epithelial+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Conjunctival epithelium in healing of corneal epithelial wounds.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 28 (9), 1445-1449 (1987).</li>
<li>Shapiro, M. S., Friend, J., Thoft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+re-epithelialization+from+the+conjunctiva%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Corneal re-epithelialization from the conjunctiva.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 21 (1 Pt 1), 135-142 (1981).</li>
<li>Shah, D., Aakalu, V. K. Murine Corneal Epithelial Wound Modeling. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShah%2C+D+%22Wound+Regeneration%3A+Methods+and+Protocols%22">Wound Regeneration: Methods and Protocols</a>. Das, H. , Springer US. 175-181 (2021).</li>
<li>Rittié, L., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+corneal+scarring%5BTitle%5D)+AND+%22Fibrosis%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Mouse models of corneal scarring.</a> Fibrosis: Methods and Protocols. 1627, 117-122 (2017).</li>
<li>Stepp, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wounding+the+cornea+to+learn+how+it+heals%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Wounding the cornea to learn how it heals.</a> Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).</li>
<li>Akowuah, P. K., De La Cruz, A., Smith, C. W., Rumbaut, R. E., Burns, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Epithelial+Abrasion+Model+for+Studying+Corneal+Wound+Healing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing.</a> Journal of Visualized Experiments. (178), 63112(2021).</li>
<li>Bai, J. Q., Qin, H. F., Zhao, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+on+mouse+model+of+grade+II+corneal+alkali+burn%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Research on mouse model of grade II corneal alkali burn.</a> International journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).</li>
<li>Paschalis, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Microglia+and+Peripheral+Monocytes+in+Retinal+Damage+after+Corneal+Chemical+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">The Role of Microglia and Peripheral Monocytes in Retinal Damage after Corneal Chemical Injury.</a> The American Journal of Pathology. 188 (7), 1580-1596 (2018).</li>
<li>Jiang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Shot+Dimension+Measurements+of+the+Mouse+Eye+Using+SD-OCT%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Surgery%2C+Lasers+and+Imaging+Retina%22%5BJournal%5D)">Single-Shot Dimension Measurements of the Mouse Eye Using SD-OCT.</a> Ophthalmic Surgery, Lasers and Imaging Retina. 43 (3), 252-256 (2012).</li>
<li>Shadmani, A., Razmkhah, M., Jalalpoor, M. H., Lari, S. Y., Eghtedari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+Activated+Omental+versus+Allogeneic+Adipose+Tissue-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Corneal+Alkaline+Injury%3A+An+Experimental+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Current+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Autologous Activated Omental versus Allogeneic Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells in Corneal Alkaline Injury: An Experimental Study.</a> Journal of Current Ophthalmology. 33 (2), 136-142 (2021).</li>
<li>Swarup, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PNP+Hydrogel+Prevents+Formation+of+Symblephara+in+Mice+After+Ocular+Alkali+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Vision+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">PNP Hydrogel Prevents Formation of Symblephara in Mice After Ocular Alkali Injury.</a> Translational Vision Science & Technology. 11 (2), 31-31 (2022).</li>
<li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), 2771(2012).</li>
<li>Jaber, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose+Regimens%2C+Variability%2C+and+Complications+Associated+with+Using+Repeat-Bolus+Dosing+to+Extend+a+Surgical+Plane+of+Anesthesia+in+Laboratory+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Dose Regimens, Variability, and Complications Associated with Using Repeat-Bolus Dosing to Extend a Surgical Plane of Anesthesia in Laboratory Mice.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (6), 684-691 (2014).</li>
<li>Navarro, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Anesthesia%3A+The+Art+and+Science%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+Journal%22%5BJournal%5D)">Mouse Anesthesia: The Art and Science.</a> ILAR Journal. 62 (1-2), 238-273 (2021).</li>
<li>Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+in+Aseptic+Rodent+Surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Techniques in Aseptic Rodent Surgery.</a> Current Protocols in Immunology. 1, 1.12.1-1.12.14 (2008).</li>
<li>ACLAM Medical Records Committee. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medical+Records+for+Animals+Used+in+Research%2C+Teaching%2C+and+Testing%3A+Public+Statement+from+the+American+College+of+Laboratory+Animal+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+Journal%22%5BJournal%5D)">Medical Records for Animals Used in Research, Teaching, and Testing: Public Statement from the American College of Laboratory Animal Medicine.</a> ILAR Journal. 48 (1), 37-41 (2007).</li>
<li>Yoeruek, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety%2C+penetration+and+efficacy+of+topically+applied+bevacizumab%3A+evaluation+of+eyedrops+in+corneal+neovascularization+after+chemical+burn%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">Safety, penetration and efficacy of topically applied bevacizumab: evaluation of eyedrops in corneal neovascularization after chemical burn.</a> Acta Ophthalmologica. 86 (3), 322-328 (2008).</li>
<li>Shomer, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+rodent+euthanasia+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Review of rodent euthanasia methods.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 59 (3), 242-253 (2020).</li>
<li>Kvanta, A., Sarman, S., Fagerholm, P., Seregard, S., Steen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Matrix+Metalloproteinase-2+%28MMP-2%29+and+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+%28VEGF%29+in+Inflammation-associated+Corneal+Neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Expression of Matrix Metalloproteinase-2 (MMP-2) and Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) in Inflammation-associated Corneal Neovascularization.</a> Experimental Eye Research. 70 (4), 419-428 (2000).</li>
<li>Tseng, S. C., Hirst, L. W., Farazdaghi, M., Green, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Goblet+cell+density+and+vascularization+during+conjunctival+transdifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Goblet cell density and vascularization during conjunctival transdifferentiation.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (10), 1168-1176 (1984).</li>
<li>Huang, A. J., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+epithelial+wound+healing+in+the+absence+of+limbal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">Corneal epithelial wound healing in the absence of limbal epithelium.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 32 (1), 96-105 (1991).</li>
<li>Rama, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+stem-cell+therapy+and+long-term+corneal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration.</a> New England Journal of Medicine. 363 (2), 147-155 (2010).</li>
<li>Deng, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+consensus+on+the+definition%2C+classification%2C+diagnosis+and+staging+of+limbal+stem+cell+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Global consensus on the definition, classification, diagnosis and staging of limbal stem cell deficiency.</a> Cornea. 38 (3), 364-375 (2019).</li>
<li>Wei, Z. G., Wu, R. L., Lavker, R. M., Sun, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+growth+and+differentiation+of+rabbit+bulbar%2C+fornix%2C+and+palpebral+conjunctival+epithelia%3A+Implications+on+conjunctival+epithelial+transdifferentiation+and+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">In vitro growth and differentiation of rabbit bulbar, fornix, and palpebral conjunctival epithelia: Implications on conjunctival epithelial transdifferentiation and stem cells.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 34 (5), 1814-1828 (1993).</li>
<li>Kao, W. W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratin+expression+by+corneal+and+limbal+stem+cells+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Keratin expression by corneal and limbal stem cells during development.</a> Experimental Eye Research. 200, 108206(2020).</li>
<li>Park, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+ocular+surface+epithelia%3A+Using+a+murine+model+of+limbal+stem+cell+deficiency+to+delineate+metaplasia+and+transdifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Plasticity of ocular surface epithelia: Using a murine model of limbal stem cell deficiency to delineate metaplasia and transdifferentiation.</a> Stem Cell Reports. 17 (11), 2451-2466 (2022).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+for+Differential+Localization+of+Putative+Corneal+Epithelial+Stem+Cells+in+Mouse+and+Human%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification for Differential Localization of Putative Corneal Epithelial Stem Cells in Mouse and Human.</a> Scientific Reports. 7 (1), 5169(2017).</li>
<li>McKenna, C. C., Lwigale, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innervation+of+the+Mouse+Cornea+during+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Innervation of the Mouse Cornea during Development.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (1), 30-35 (2011).</li>
<li>He, J., Bazan, H. E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroanatomy+and+Neurochemistry+of+Mouse+Cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Neuroanatomy and Neurochemistry of Mouse Cornea.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (2), 664-674 (2016).</li>
</ol>

所有作者均对本研究中提及的任何公司或产品无任何经济利益。作者声明不存在其他利益冲突。

本研究提出了一种创新装置—— punch-trephine，可用于在小鼠模型中成功诱导出有效且可重复的角膜和角膜缘损伤。该角膜缘干细胞缺乏模型非常适合研究损伤后角膜伤口愈合和结膜化的动态过程。
有证据表明，小鼠角膜的角膜缘生态位和中央区域均含有干细胞30。因此，要建立干细胞缺乏模型，需要对角膜和角膜缘造成有效的损伤，而本研究所采用的损伤模型可使弯曲的角膜缘在特定时间内暴露于化学物质。为了确定氢氧化钠（NaOH）损伤的最佳浓度和作用时间，研究人员采用了不同浓度和作用时间的NaOH进行损伤实验。结果发现，较高的NaOH浓度或较长的暴露时间会导致更严重的组织损伤和纤维化。因此，研究人员可根据其研究的具体目标以及所需的损伤严重程度，调整这些参数。
为了成功复制该角膜和角膜缘损伤模型，应考虑几个关键因素。首先，必须测量目标眼睛的角膜缘至角膜缘直径，以确定合适的打孔器尺寸。建议选择外径比该直径大 0.5 - 1 mm 的活检打孔器。
所用液体的表面张力是防止角膜表面与打孔刀边缘界面处发生泄漏的重要因素，如图1G所示。因此，无需对打孔活检的尖端施加压力。
为避免对组织造成机械性损伤，必须将打孔钻以与眼球平行的轴向持握，并避免对角巩膜缘施加压力。若打孔钻轴向调整不当，可能增加渗漏风险，导致损伤部位偏心以及实验结果不准确。
该技术的一些潜在局限性包括需要选择合适的打孔尺寸、掌握持打孔钻的技术，以及可能造成机械性损伤的风险。然而，通过练习并遵循本方案中所述的步骤，这些局限性可以得到克服。小鼠的品系和年龄范围也是影响再上皮化过程的其他因素，在研究中必须予以考虑。
此外，本方案的优势在于详细描述了一种去核方法，该方法可保留球结膜和睑结膜，并能在无需使用手术缝线作为标记的情况下确定眼球的鼻侧部位。既往研究表明，与角膜其他区域相比，眼部鼻侧区域的神经支配最少，因此更容易发生新生血管化且再生能力降低31,32。
综上所述，LSCD 的临床表现，如角膜混浊（CO）、持续性上皮缺损和角膜新生血管（NV），以及所观察到的组织学改变，包括杯状细胞化生、角膜表面表达 K13 以及角膜表面缺乏 K12，均证实了该模型中 LSCD 的存在。这些结果表明，这种新型技术在诱导 LSCD 方面是有效的。该化学损伤模型可用于临床前研究，以探索角膜损伤与再生领域的新型药物和药物治疗方法。

角膜对视觉至关重要，具有独特的特性，包括透明性，这是清晰视觉的先决条件。除了发挥重要的保护作用外，角膜还承担了眼球屈光力的三分之二1。由于其在视觉中的重要作用，角膜损伤和混浊会导致显著的视力下降，是全球可预防性失明的第二大原因2,3。在伴有严重角膜缘功能障碍的角膜损伤中，角膜缘的屏障功能减弱，导致结膜细胞向角膜表面迁移，引发角膜结膜化4,5，从而严重损害视力。因此，迫切需要有效的预防和治疗策略，以应对全球范围内角膜盲及相关功能障碍带来的负担。
目前对人角膜伤口愈合过程的理解基于以往研究，这些研究探讨了角膜对各种损伤的反应。已有多种技术与动物模型被用于诱导不同类型的化学性或机械性角膜损伤6,7,8,9，并研究角膜伤口愈合过程的各个方面。
碱烧伤模型是一种成熟的损伤模型，通过将氢氧化钠（NaOH）直接作用于角膜表面或使用平面滤纸实施10。碱性损伤会导致促炎性介质释放以及多形核细胞的浸润，不仅发生在角膜和眼前房，也累及视网膜。这会诱发非预期的视网膜神经节细胞凋亡以及CD45+细胞的活化11。因此，在使用碱烧伤模型时，精确定位损伤部位以避免过度的非预期损伤至关重要。
小鼠眼球的轴长约为 3 mm12。由于角膜与视网膜之间的距离较短，角膜曲率较大，从而提供较高的屈光力，使光线能够聚焦在视网膜上（图 1A）。正如我们先前所报道的13，使用平面滤纸对这种高曲率表面造成化学损伤较为困难，尤其是在角膜缘区域（图 1B）。若要对角膜缘造成损伤，需倾斜滤纸操作，这可能意外损伤穹隆部及邻近的结膜14。另一种方法是将化学试剂以滴液形式直接施加于角膜表面。然而，该方法难以控制暴露时间，且液体可能扩散至结膜、穹隆部和眼睑，存在造成这些区域损伤的潜在风险。
为了克服这些局限性，本研究提出了一种新型的打孔-环钻法以诱导损伤。该技术具有多项优势，包括：（i）在小鼠模型中对整个角膜表面及角膜缘诱导有效的化学性损伤；（ii）可在角膜上诱导出局限且边界清晰的损伤；（iii）能够将任何感兴趣的液体在预设时间内施加于角膜；（iv）通过选择合适的活检打孔器，可诱导出不同大小的角膜损伤。该方法同样适用于大鼠和兔的损伤模型，这些动物也具有曲面状的角膜结构，是研究眼表创伤愈合常用的动物模型。

<table><tbody><tr><td>抗K12抗体</td><td>ABCAM</td><td>ab185627</td><td></td></tr><tr><td>抗K13抗体</td><td>ABCAM</td><td>ab92551</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>B14</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6小鼠</td><td>Dr Weissman Lab, Stanford University</td><td></td><td></td></tr><tr><td>弯头镊子</td><td>Storz</td><td>E1885</td><td></td></tr><tr><td>一次性90度弯针</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>一次性活检打孔器</td><td>Med blades</td><td></td><td></td></tr><tr><td>驴抗兔IgG H&amp;L</td><td>ABCAM</td><td>ab150073</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T038181000CS</td><td></td></tr><tr><td>Ethiqa XR（缓释注射用布托啡诺混悬液）</td><td>Fidelis Animal Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小鼠加热垫&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>盐酸氯胺酮</td><td>Ambler</td><td>ANADA 200-055</td><td></td></tr><tr><td>OCT包埋剂</td><td>Tissue-Tek 4583</td><td></td><td></td></tr><tr><td>眼科手术剪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH指示试纸</td><td>Whatman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>含DAPI的Prolong Gold抗荧光淬灭封片剂</td><td>Invitrogen</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>裂隙灯显微镜</td><td>NIDEK</td><td>SL-450</td><td></td></tr><tr><td>荧光素钠AK-氟10%</td><td>Dailymed</td><td>NDC17478-253-10</td><td></td></tr><tr><td>无菌灌注液（BSS）</td><td>Alcon</td><td>9017036-0119</td><td></td></tr><tr><td>无菌注射器，1 ml和5 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>直头镊子</td><td>Katena K5</td><td>4550- Storz E1684</td><td></td></tr><tr><td>眼科手术棉签</td><td>American White 17240 Cross</td><td></td><td></td></tr><tr><td>手术显微镜</td><td>Zeiss S5 microscope</td><td></td><td></td></tr><tr><td>丁卡因眼科滴眼液</td><td>Alcon&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;NDC0065-0741-14</td><td></td></tr><tr><td>计时器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>三种抗生素眼科软膏</td><td>Bausch and Lomb</td><td></td><td></td></tr><tr><td>吐温X-100</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>50-295-34</td><td></td></tr><tr><td>双速旋转工具</td><td>200-1/15 Two Speed Rotary Toolkit</td><td></td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>AnaSed</td><td>NADA#139-236</td><td></td></tr></tbody></table>

采用打孔-角膜环钻技术在小鼠模型中诱导角膜和角缘碱烧伤损伤

Corneal and Limbal Alkali Injury Induction Using a Punch-Trephine Technique in a Mouse Model

角膜对视觉至关重要，外伤后角膜的愈合对于维持其透明性和功能具有重要意义。通过研究角膜损伤模型，研究人员旨在加深对角膜愈合机制的理解，并开发预防和治疗角膜混浊的策略。化学性损伤是最常被研究的损伤模型之一，已在小鼠中广泛开展。以往大多数研究者采用浸有氢氧化钠的平面滤纸片诱导角膜损伤。然而，由于小鼠角膜曲率较高，使用平面滤纸诱导角膜及角膜缘损伤并不可靠。本文介绍一种新型工具——改良的活检打孔器，可使研究人员在小鼠角膜和角膜缘上制造边界清晰、定位准确且分布均匀的碱性损伤。这种打孔-角膜环钻法可精确且可重复地在整个小鼠角膜和角膜缘诱导化学性灼伤，同时避免化学物质对眼睑等其他结构的影响。此外，本研究还介绍了一种眼球摘除技术，该技术保留内侧半月皱襞作为识别眼球鼻侧的解剖标志。采用该技术还可完整保留球结膜、睑结膜及泪腺。在损伤后第0、1、2、6、8和14天，通过裂隙灯生物显微镜检查和荧光素染色进行眼科检查。临床、组织学及免疫组织化学结果均证实，所有实验小鼠均出现角膜缘干细胞缺乏及眼表再生障碍。本研究所提出的碱烧伤角膜损伤模型非常适合用于研究角膜缘干细胞缺乏、角膜炎症及纤维化。该方法也适用于评估局部眼科药物在小鼠角膜表面的临床前及临床疗效。

通过评估角膜缘干细胞缺乏症（LSCD）的临床和组织学特征，来判断该方法诱导LSCD的有效性。临床评估采用裂隙灯显微镜和眼前节光学相干断层扫描（AS-OCT）成像（图3 和 图4）。
上皮再生以向心性方式进行，且角膜颞侧的再生速度较鼻侧更快。化学损伤后，受伤的眼睛立即出现2+-3+级角膜浑浊（图3）。角膜缘损伤后，结膜上皮细胞迁移至角膜表面。大面积角膜上皮缺损在伤后第12至14天完全完成再上皮化，所需时间较具有完整基底膜和基质、同等大小的角膜上皮损伤更长，后者通常在损伤后5天内愈合8,9。由于角膜缘干细胞缺乏（LSCD），50%的受伤眼睛在第二周结束时出现持续性上皮缺损（图3）。角膜水肿在最初几天更为明显（图3、图4），而角膜纤维化在第二周显著加重，导致100%的受伤眼睛出现4+级角膜不透明。
在化学损伤诱导后24小时，临床上和组织学上均观察到新生血管形成（NV）的早期迹象，如图5所示，这与Kvanta等人的研究中所确定的NV时间线一致，该研究显示损伤后24小时出现角膜缘新生血管的迹象22。在愈合过程中，新生血管逐渐成熟，至损伤后第14天，新生血管已越过角膜缘并延伸至角膜中央区域。作为结膜与角膜分界的角膜缘结构遭到破坏。
通过观察到PAS阳性杯状细胞和基质血管的存在，可发现角膜缘干细胞缺乏和结膜化的组织学证据23,24,25,26。在本损伤模型中观察到了杯状细胞，如图6中箭头所示。
结膜和角膜上皮主要分别表达独特的角蛋白K13和K1227。在角膜缘损伤后，来源于结膜的新上皮细胞覆盖了裸露的角膜，且在损伤后2周内，所有受伤动物的角膜表面均未检测到K12的表达。该结果与其他研究一致28，表明完全的角膜缘干细胞缺乏（LSCD）以及角膜表面缺乏角膜上皮细胞。然而，在Park等人的研究中29，他们在损伤后20周和32周检测到了K12的表达，提示上皮细胞可能发生转分化。
因此，我们观察到化学损伤破坏了角膜缘及其角膜缘干细胞，导致结膜上皮细胞向角膜中央迁移，以覆盖裸露的角膜表面。这一点进一步得到了结膜上皮细胞标志物K13的验证，K13在全部结膜和角膜表面均有表达，如图7所示。
<img alt="光学实验中眼部植入物的手术过程和材料；显微视图，标尺刻度。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65609/65609fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：正常小鼠右眼及用于诱导角膜和角膜缘损伤的打孔刀具。（A）侧视图显示小鼠眼睛具有高度弯曲的角膜（箭头指示角膜缘）。（B）图像显示即使较大的滤纸也无法充分覆盖角膜缘区域。小鼠眼球从角膜缘到角膜缘的直径约为4 mm，而外径为4.5 mm、内径为3.5 mm的穿孔活检工具（见图D和H）可适当地覆盖角膜和角膜缘表面，如图（C）和（E）所示。（F）穿孔刀具被正确地放置在眼球周围角膜缘区域上方。（G）为确保穿孔刀具边缘无渗漏，在将穿孔刀具沿与眼球平行的轴向准确定位后，向孔内注入亚甲蓝。未检测到亚甲蓝渗漏。比例尺 = 1 mm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65609/65609fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="胚胎发育阶段；显微镜图像；胚胎学；解剖特征。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65609/65609fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：摘除的眼球。（A）摘除眼球时保留了球结膜和睑结膜、泪腺（箭头所示）以及视神经（箭头所示）。正常（B）和损伤后（C）的眼球用30%蔗糖溶液浸泡，以防止冰晶形成。通过鼻侧泪阜（标为N）可识别眼球的鼻侧部分。比例尺 = 1 mm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65609/65609fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="角膜伤口愈合；0-14天时间序列；宏观与荧光显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65609/65609fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：左眼伤口愈合情况。 本图展示了小鼠模型中左眼在角膜和角缘碱烧伤后2周内的伤口愈合过程（A-F）。为裂隙灯检查眼部图像。角膜水肿在第0天和第2天更为明显（A，B），而纤维化则在伤后第二周更为显著（E-F）。A.f-F.f 显示了同一只眼的再上皮化过程。损伤后立即出现全角膜及角缘上皮缺损，如A.f所示。上皮缺损通过结膜上皮细胞向心性迁移，在12-14天内逐渐愈合（A.f-F.f）。然而，如F和F.f图像中箭头所示，50%的受伤眼睛在第二周结束时仍存在持续性上皮缺损。比例尺 = 1 mm（C图）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65609/65609fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="角膜愈合超声：正常、受伤后、两周后；愈合过程进展。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65609/65609fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
图4：小鼠眼前节光学相干断层扫描（OCT）。（A）前节OCT显示正常角膜曲率和前房结构。虹膜结构清晰可辨，中周部虹膜未见虹膜角膜粘连。（B）损伤后即刻，由于水肿形成，角膜厚度增加，并在虹膜中周部出现虹膜角膜粘连。（C）损伤后两周，角膜曲率发生改变，可见完全性虹膜角膜粘连及前房结构破坏。比例尺 = 1 mm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65609/65609fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="角膜愈合过程（14天）；组织学分析；显微镜图像；组织再生。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65609/65609fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5"> 
图5：角膜新生血管形成。 在氢氧化钠（NaOH）损伤后的伤口愈合过程中，可观察到角膜新生血管形成的临床和组织学征象。(A) 损伤后第1天即可检测到新生血管形成的早期征象，表现为角膜出现红色变色（白色箭头所示）。这种变色是由于红细胞在基质层中聚集所致，如相应的组织学图像(D)所示（黄色箭头所示）。(B) 在再生的第一周内，新生血管逐渐增多并扩散至整个角膜。(C) 到第2周结束时，角膜缘区域遭到破坏，新生血管持续发展。(E) 角膜的组织学切片进一步显示了深层基质层存在新生血管（箭头所示）。裂隙灯图像比例尺 = 1 mm，组织学图像比例尺 = 50 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65609/65609fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="组织学与免疫荧光：角膜组织，K12/K13 染色，上皮细胞分化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65609/65609fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 6"> 
图 6：角膜的过碘酸-希夫染色与免疫组织化学（IHC）染色。在损伤后2周对正常和受损角膜进行过碘酸-希夫染色与免疫组织化学染色。正常小鼠角膜上皮由4-5层细胞组成（A）。角膜和角膜缘的碱烧伤导致结膜化，角膜表面出现杯状细胞，如（D）中黑色箭头所示。正常角膜上皮细胞表达K12（B），而覆盖受损角膜的结膜细胞不表达K12（E）。K13是结膜上皮细胞的特征性标志物，在正常角膜上皮细胞中不表达（C）；然而，在氢氧化钠（NaOH）损伤后的角膜表面可检测到K13，提示角膜发生结膜化（F）。组织学图像比例尺 = 50 µm，IHC染色图像比例尺 = 20 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65609/65609fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="正常和氢氧化钠损伤的角膜缘显微图像、K12/K13标记物、DAPI染色、组织学比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65609/65609fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图7"> 
图7：苏木精-伊红染色与免疫组织化学染色。 对正常及损伤的角膜缘组织进行了苏木精-伊红（H&amp;E）染色和免疫组织化学染色。(A) 正常角膜缘标志着巩膜末端与角膜起始处之间的过渡区域。该区域通常被一层或两层结膜上皮细胞覆盖（箭头所示）。在健康的眼部，一种称为K12的特异性角膜上皮标记物的表达始于角膜缘，并延伸至角膜表面（见图像B）。而另一种称为K13的结膜标记物的表达则局限于角膜缘，不会超出该区域（图像C中的白色箭头所示）。在氢氧化钠（NaOH）损伤的眼部，角膜缘的边界遭到破坏，导致结膜细胞向受损的角膜迁移。(D) NaOH损伤的角膜缘图像显示，在上皮层下方及基质组织中均出现新生血管。损伤后，受损的角膜表面缺乏K12的表达（E），而K13则在角膜表面大量表达（F）。组织学图像比例尺 = 50 µm，免疫组化染色图像比例尺 = 100 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65609/65609fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
补充文件 1：染色方案。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65609/Staining%20Protocol_%20RE.docx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
视频 1：使用打孔器在小鼠模型中制造氢氧化钠角膜和角缘损伤。 本视频展示了在小鼠模型中使用打孔器制造氢氧化钠角膜和角缘损伤的操作过程。操作时必须将打孔器保持与眼球平行的方向，并对角缘施加最小压力。正确的技术对于防止渗漏并获得理想结果至关重要。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65609/Video%201%20_4.2.23.zip" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
视频 2：保留球结膜的摘除术技术示意图。 为了区分眼球的鼻侧与颞侧，鼻部泪阜随眼球一并保留。从结膜与睑板交界处开始，完整分离结膜组织。施加轻微压力后，眶内容物向外突出。将镊子引导至眼球后方，夹住视神经并取出组织。所摘除的组织包括眼球、眶内脂肪及眶部泪腺。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65609/Video%202_%204.2.23.zip" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>

本方案描述了一种在小鼠模型中诱导精确且可重复的角膜和角膜缘碱烧伤的方法。该方案的优点在于能够使损伤均匀地分布于曲率较高的小鼠角膜和角膜缘区域。

角膜对视力至关重要，外伤后角膜的愈合对于维持其透明性和功能具有重要意义。通过研究……

我们的目标是在小鼠模型中对角膜及角膜缘区域诱导出精确且局限的碱性损伤。我们开发了一种新型的打孔-环钻法，并研究了该方法在建立角膜和角膜缘干细胞缺乏模型方面的有效性。角膜混浊治疗与角膜再生领域的先进技术，包括角膜缘干细胞移植、外泌体移植以及线粒体移植，均基于对角膜对不同类型损伤及治疗反应的研究。因此，研究人员之间建立一种标准、准确且可靠的损伤模型至关重要。目前已提出多种技术和动物模型，用于诱导不同类型的角膜损伤，并研究角膜伤口愈合过程的各个方面。碱烧伤模型是一种成熟的损伤模型，通过将氢氧化钠直接施加于角膜表面或使用浸有碱液的滤纸来实现。我们开发了一种新型的打孔-环钻法，可相应且可靠地建立小鼠角膜缘干细胞缺乏模型，克服了以往技术的局限性，并最大限度地减少了对角膜缘区域损伤不足，或对穹隆部和结膜造成额外损伤的风险。该技术具有多项优势：可实现对小鼠整个角膜表面及角膜缘的有效化学损伤，对角膜造成局部且边界清晰的损伤，能够将任意液体作用于角膜表面并精确控制作用时间，利用合适的活检打孔器可诱导产生不同大小的角膜损伤。该方法同样适用于大鼠和兔的损伤模型。首先准备一个直径为3.5毫米的皮肤活检打孔器。在打孔器杆部距离边缘远端5毫米处做一标记。固定打孔器，使用双速旋转工具切断标记处的远端杆部。在3.5毫米深度处切割轴，保留末端最后1.5毫米不切断，并将尖端弯曲至90度。接着，将PBS溶于900毫升蒸馏水中，并调节pH至7.4。然后通过加入蒸馏水定容至最终体积1升。在通风橱中，将两克多聚甲醛溶解于45毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制4%多聚甲醛溶液，并加热至65摄氏度，同时调节pH至7.4。待多聚甲醛完全溶解后，将溶液定容至50毫升。称量小鼠体重，以确定注射用麻醉剂混合液的正确给药体积。麻醉给药后，将小鼠置于手术台上，遵循标准的啮齿类动物手术原则。然后，将小鼠头部置于侧卧位，并在其头下放置一个5毫米高的垫枕。使用手术眼刺彻底干燥眼表，并整齐地修剪睫毛。调整手术显微镜以获得麻醉小鼠眼部的最佳视野，并将计时器设定为30秒。随后，在用拇指和食指保持小鼠眼睑充分张开的同时，使用手术显微镜检查角膜缘区域的周长。现在，将灭菌的 Punch-Trephine 器具小心地平行于眼球轴线持握，避免施加向下的压力。避免旋转仪器，并保持角膜环钻的轴线与眼球轴线平行。请手术助手将三滴氢氧化钠溶液滴入角膜环钻的孔中。30 秒后，用 5 毫升磷酸盐缓冲液冲洗角膜和穹隆部。然后，使用通用pH试纸确保受伤眼睛角膜表面的pH值在7至7.5之间。操作完成后，用70%乙醇清洗、干燥并消毒 Punch-Trephine 和手术台。在裂隙灯生物显微镜下检查麻醉小鼠的眼睛，并使用相机拍摄图像。然后，滴入0.1%荧光素钠眼药水，并用棉签吸除多余的荧光液体。使用钴蓝滤光片评估角膜上皮缺损的可能情况，并进行拍照记录。随后，在受损的眼表涂抹三种抗生素眼膏。摘除眼球时保留内眦和完整的睑结膜。在手术显微镜下，精细分离泪阜与皮肤之间的连接处。使用牙科镊子牵拉泪阜，并协助将手术剪导入睑结膜下方，朝向其与睑板的连接处。沿粘连线剪开结膜至外眦。然后，在结膜下平面将手术剪转向结膜与下睑板的连接处。现在，用拇指和食指从鼻侧拉开上眼睑和下眼睑。在拉开的同时，将弯头镊子的尖端引导至突出的泪腺后方，并向视神经方向移动。牢固夹住视神经，取出眼球。随后，用 PBS 冲洗眼球，并将其转移至固定液中。图示为小鼠模型中角膜和角膜缘碱烧伤后小鼠眼部的伤口愈合过程。角膜水肿在损伤后第 0 天和第 2 天较为明显，而纤维化则在损伤后第二周更为显著。上皮缺损在12至14天内通过结膜上皮细胞向心性迁移而愈合。然而，50%的受伤眼在第二周结束时出现持续性上皮缺损。

corneal-limbal-alkali-injury-induction-using-punch-trephine-technique

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

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