Name: 一种简单、快速、部分自动化的方案，用于从冷冻哺乳动物组织中分离单细胞核，用于单细胞核测序 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-28T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: 了解从冷冻哺乳动物组织中分离高质量细胞核的部分自动化方案，用于单细胞核RNA测序。该方法利用机器人解离器减少非生物学变异，为药物发现研究提供一致可靠的结果。

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作者感谢Filip Bochner、Marion Richardson、Petra Staeuble和Matthias Selhausen提供了本论文中所分析的动物组织。同时还要感谢Petra Schwalie、Klas Hatje、Roland Schmucki和Martin Ebeling在生物信息学方面提供的支持。

所有动物实验均经巴塞尔城市州州立兽医管理局批准，并严格遵守瑞士联邦动物保护条例；或经机构动物护理和使用委员会批准，并符合德国动物福利法。
1. 组织与试剂/仪器准备
<ol>
	<li>清洁与仪器准备
	<ol>
		<li>使用 70% 乙醇和 RNase 去污染溶液清洁台面和镊子。将离心机预冷至 4 °C。</li>
		<li>将细胞核分离柱置于 4 °C 冰箱中至少预冷 30 分钟。</li>
		<li>启动自动组织解离仪，并通过点击屏幕右上角的滑块将其设置为冷却模式以开始制冷，此时滑块应显示为橙色。检查连接的细胞核保存试剂（NSR）瓶和细胞核分离缓冲液（NIB）瓶中是否有足够液体，并确认其已适当冷却。</li>
		<li>准备一个装有干冰的聚苯乙烯泡沫箱，并将培养皿和手术刀片预冷于干冰上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>缓冲液配制
	<ol>
		<li>按照 表 1 所示配制 1.5 M 蔗糖垫层溶液（SCS）。将 SCS 分装至 2 mL DNase/RNase 管中，每管 500 µL，每样本准备四份 500 µL 的 SCS 分装液。分装后置于冰上，待后续使用。</li>
		<li>若处理脑组织，则按 表 2 所述方法配制 18% 二氧化硅胶体溶液，即将二氧化硅胶体储备液用 NSR 稀释并加入 RNase 抑制剂。每样本配制 3 mL 18% 二氧化硅胶体溶液，并置于冰上保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 组织匀浆与细胞核分离
<ol>
	<li>从 -80 °C 冰箱中取出样本，并立即置于干冰上。</li>
	<li>在干冰上的预冷培养皿或金属板上，使用预冷的解剖刀将样本切割成 15–50 mg 的组织块（如果尚未达到合适大小）。务必沿正确方向切割，以确保样本仍能代表目标器官的结构特征。 
	注意：本方案中，15–50 mg 为核提取的最佳样本量。为在纯化后获得良好的得率，建议样本量至少为 25 mg。对于较小样本，可使用专为小量输入优化的小量输入核分离柱配合自动化解离仪进行处理。小量输入核分离柱可用于解离低至 4 mg 的组织样本，并获得足以进行下游单核 RNA 测序的核得率。使用小量输入分离柱从大鼠肝组织获得核得率的示例如 表 3 所示。</li>
	<li>从冰箱中取出核分离柱，拆包装，取出研磨器，并用移液器向分离柱底部加入 15 µL RNase 抑制剂（40 U/µL）。 
	注意：在核提取过程中，自动化解离仪将向分离柱中加入 NIB 和 NSR，总体积达 3 mL（采用低体积核提取方案）。在提取前向分离柱中加入 15 µL RNase 抑制剂（40 U/µL），可使悬液中 RNase 抑制剂终浓度达到 0.2 U/µL。</li>
	<li>使用镊子将组织样本放置于分离柱底部。为获得最佳解离效率，请勿将样本恰好置于分离柱中心位置。</li>
	<li>在仪器上选择 运行方案，然后点击左上角的 核 选项。
	<ol>
		<li>从菜单中选择 低体积核分离 方案，并通过点击 修改 确认解离速度已设置为“快速”。打开仪器门，提起红色旋钮滑出载台，将分离柱装入仪器。</li>
		<li>将分离柱插入指定位置，旋转分离柱锁扣，推回载台直至红色旋钮卡入到位。关闭门，点击 下一步 开始核提取程序。运行时间约为 7 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>程序结束后，提起红色旋钮并拉出载台，从仪器中取出分离柱，并立即置于冰上。</li>
	<li>除脑组织外的所有组织样本，请进入步骤 3.1；脑组织样本请直接进入步骤 3.2。</li>
</ol>
3. 细胞核纯化
<ol>
	<li>蔗糖梯度纯化 
	注意：对于脑组织，跳过此步骤，直接进入步骤 3.2。所有纯化步骤均需在冰上进行，以尽量减少 RNA 降解。缓冲液、离心管以及离心机均需预先冷却。所有重悬和混匀步骤仅通过小心移液完成，避免涡旋，以免影响细胞核的质量和完整性。
	<ol>
		<li>用移液器吸头小心刺穿解离卡盒上的圆形铝箔。 
		注意：&#160;解离后，所得细胞核悬液的体积约为 2 mL。为便于蔗糖梯度纯化，将细胞核悬液分为两份各 900 µL 的等分试样，纯化过程中共使用 1.8 mL 的细胞核悬液。</li>
		<li>从卡盒中取出第一份 900 µL 的细胞核悬液，加入到已预先在 2 mL 管中准备好的 500 µL SCS 等分试样中。通过移液充分混匀，直至混合物均匀。</li>
		<li>取出 1400 µL 的细胞核悬液-SCS 混合物，将管子倾斜持握，逐滴加入新的 500 µL SCS 等分试样中，形成清晰可见的相分离（见 图 1A）。</li>
		<li>小心盖紧管盖，放回冰上，避免扰动相分离层。</li>
		<li>对第二份 900 µL 悬液和新的 SCS 等分试样重复步骤 3.1.2–3.1.4，使每个样本获得两个 2 mL 管，均具有清晰可见的相分离，用于梯度离心。</li>
		<li>小心将管子放入预冷的离心机中，在 4 °C 条件下以 13,000 × g 离心 15 分钟。</li>
		<li>在此期间，按照 表 4 所述，通过向 NSR 等分试样中加入 RNase 抑制剂来配制 NSR。每个样本准备 1 mL NSR。 
		注意：此时可将单细胞基因表达试剂凝胶微珠从 -80 °C 冰箱中取出，使其平衡至室温（RT），同时可将模板转换寡核苷酸（template switch oligo）重悬于低 TE 缓冲液中。</li>
		<li>离心结束后，小心弃去两个管中的上清液，避免扰动沉淀，然后按照制造商建议，用 50 µL 冰冷的 NSR 小心重悬沉淀。将同一样本的两个沉淀合并至一个新的 1.5 mL 管中，并加入 900 µL 冰冷的 NSR，总体积达到 1 mL。通过移液充分混匀。</li>
		<li>使用水平转子离心机，在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 5 分钟。 
		注意：强烈建议使用水平转子以尽量减少细胞核损失，尤其是在预期细胞核得率较低或起始组织量较少的情况下。</li>
		<li>在此期间，按照 表 5 所述，为每个样本准备 500 µL 含 0.04% 牛血清白蛋白（BSA）和 0.2 U/µL RNase 抑制剂的 1× PBS（不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺）。</li>
		<li>小心弃去上清液，避免丢失沉淀，并将沉淀重悬于 100 µL 上述配制的 PBS 溶液中（1× PBS + 0.04% BSA + 0.2 U/µL RNase 抑制剂）。 
		注意：对于小量组织样本，细胞核浓度可能较低，因此建议仅用 50 µL PBS 溶液重悬沉淀，以确保单细胞核 RNA 测序所需的足够高浓度。</li>
		<li>直接进入步骤 4。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>二氧化硅胶体梯度纯化 
	注意：对于脑组织，使用二氧化硅胶体梯度比蔗糖梯度更适用于从细胞核悬液中去除髓鞘和碎片。所有纯化步骤均需在冰上进行，以尽量减少 RNA 降解。缓冲液、离心管以及离心机均需预先冷却。所有重悬和混匀步骤仅通过小心移液完成，避免涡旋，以免影响细胞核的质量和完整性。
	<ol>
		<li>用移液器吸头小心刺穿解离卡盒上的圆形铝箔。</li>
		<li>从卡盒中取出细胞核悬液，加入 5 mL 管中。</li>
		<li>在预冷的离心机中，于 4 °C 条件下以 500 × g 离心 5 分钟。</li>
		<li>小心弃去上清液，避免扰动沉淀，并用 1 mL 冰冷的 18% 二氧化硅胶体溶液重悬沉淀。</li>
		<li>再加入 2 mL 18% 二氧化硅胶体溶液，使总体积达到 3 mL，并通过移液充分混匀。</li>
		<li>在水平转子离心机中，关闭刹车，在 4 °C 条件下以 700 × g 离心 5 分钟。</li>
		<li>在此期间，按照 表 4 所述，通过向 NSR 等分试样中加入 RNase 抑制剂来配制 NSR。每个样本准备 1 mL NSR。 
		注意：此时可将单细胞基因表达试剂凝胶微珠从 -80 °C 冰箱中取出，使其平衡至室温（RT），同时可将模板转换寡核苷酸（template switch oligo）重悬于低 TE 缓冲液中。</li>
		<li>小心从离心机中取出样本，避免扰动浮于上层的髓鞘层。</li>
		<li>首先移除上层的髓鞘层并弃去；然后小心弃去全部上清液，避免扰动沉淀。 
		注意：可通过将无菌无尘擦拭纸包裹在 1 mL 移液器吸头周围，吸除髓鞘层及其上方 1–2 mL 上清液，从而轻松去除髓鞘层。</li>
		<li>按照制造商建议，用 1 mL 冰冷的 NSR 重悬沉淀。</li>
		<li>在配备水平转子的离心机中，于 4 °C 条件下以 500 × g 离心 5 分钟。 
		注意：强烈建议使用水平转子以尽量减少细胞核损失，尤其是在预期细胞核得率较低或起始组织量较少的情况下。</li>
		<li>在此期间，按照 表 5 所述，为每个样本准备 500 µL 含 0.04% 牛血清白蛋白（BSA）和 0.2 U/µL RNase 抑制剂的 1× PBS（不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺）。</li>
		<li>小心弃去上清液，避免扰动沉淀，并将样本重悬于 100 µL 上述配制的 PBS 溶液中（1× PBS + 0.04% BSA + RNase 抑制剂 0.2 U/µL）。 
		&#8203;注意：对于小量组织样本，细胞核浓度可能较低，因此建议仅用 50 µL PBS 溶液重悬沉淀，以确保单细胞核 RNA 测序所需的足够高浓度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 计数
<ol>
	<li>对于每个待计数的样本，将10 µL细胞核悬液加入20 µL PBS溶液中，得到1:3的稀释比例。</li>
	<li>进行计数时，向荧光计数板的混样孔中加入25 µL碘化丙啶（PI）染色液，再加入25 µL稀释后的细胞核悬液，并用移液器充分混匀。将混样孔中50 µL染色后的样本转移至加样孔中。</li>
	<li>将计数板放入细胞计数仪中并开始计数。 
	注意：细胞核计数采用红色荧光通道，曝光时间为700 ms。该通道经过与显微镜下使用Neubauer计数板和台盼蓝染色的手动计数结果对比优化，可获得准确的细胞核计数。在高浓度情况下，细胞核彼此紧密聚集，软件难以分辨。此时建议将样本进一步稀释后重新计数。细胞核的完整性以及清洁程度可通过明场图像或显微镜观察进行评估。</li>
	<li>用PBS（1× PBS + 0.04% BSA + RNase抑制剂，终浓度0.2 U/µL）将样本稀释至单细胞核RNA测序所需的目标浓度。 
	&#8203;注意：单细胞核RNA测序的最佳细胞核浓度范围为700–1,200个核/µL。较低的细胞浓度（如700个核/µL）可能有助于降低环境RNA带来的背景污染。</li>
</ol>
5. 文库制备
<ol>
	<li>使用单细胞基因表达试剂，按照制造商的说明书进行单核RNA测序，目标为每份样本回收8000-10,000个细胞核。</li>
</ol>
6. 测序
<ol>
	<li>使用双端测序、双索引及以下测序读长，以所需的测序深度对文库进行测序：读长1（Read 1）：28个循环，i7索引：10个循环，i5索引：10个循环，读长2（Read 2）：90个循环。</li>
</ol>

Isolation and Profiling of Single Nuclei from Frozen Mammalian Tissues

<ol><li>Burja, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Optimized+Tissue+Dissociation+Protocol+for+Single-Cell+RNA+Sequencing+Analysis+of+Fresh+and+Cultured+Human+Skin+Biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">An Optimized Tissue Dissociation Protocol for Single-Cell RNA Sequencing Analysis of Fresh and Cultured Human Skin Biopsies.</a> Front Cell Dev Biol. 10, 872688(2022).</li>
<li>Kimbley, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+optimized+methodologies+for+isolating+nuclei+from+esophageal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Comparison of optimized methodologies for isolating nuclei from esophageal tissue.</a> Biotechniques. 72 (3), 104-109 (2022).</li>
<li>Maitra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+nuclei+from+archived+postmortem+tissues+for+single-nucleus+sequencing+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Extraction of nuclei from archived postmortem tissues for single-nucleus sequencing applications.</a> Nature Protocols. 16 (6), 2788-2801 (2021).</li>
<li>Nadelmann, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+nuclei+from+mammalian+cells+and+tissues+for+single-nucleus+molecular+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of nuclei from mammalian cells and tissues for single-nucleus molecular profiling.</a> Current Protocols. 1 (5), e132(2021).</li>
<li>Rousselle, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+protocol+for+single+nuclei+isolation+from+clinical+biopsies+for+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An optimized protocol for single nuclei isolation from clinical biopsies for RNA-seq.</a> Scientific Reports. 12, 9851(2022).</li>
<li>Slyper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+and+single-nucleus+RNA-Seq+toolbox+for+fresh+and+frozen+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors.</a> Nature Medicine. 26 (5), 792-802 (2020).</li>
<li>Leiz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+isolation+from+adult+mouse+kidney+for+single-nucleus+RNA-sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Nuclei isolation from adult mouse kidney for single-nucleus RNA-sequencing.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (175), 62901(2021).</li>
<li>Alvarez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+nuclei+from+human+snap-frozen+liver+tissue+for+single-nucleus+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Isolation of nuclei from human snap-frozen liver tissue for single-nucleus RNA sequencing.</a> Bio-Protocol. 13 (3), e4601(2023).</li>
<li>Ayhan, F., Douglas, C., Lega, B. C., Konopka, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+isolation+from+surgically+resected+human+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Nuclei isolation from surgically resected human hippocampus.</a> STAR Protocols. 2 (4), 100844(2021).</li>
<li>Joshi, N., Misharin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+isolation+from+frozen+human+lung+tissue+for+single-nucleus+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Protocols.io%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus isolation from frozen human lung tissue for single-nucleus RNA-seq.</a> Protocols.io. , https://dx.doi.org/10.17504/protocols.io.zu8f6zw (2019).</li>
<li>Martelotto, L. G., Luciano Martelotto, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%27Frankenstein%27+protocol+for+nuclei+isolation+from+fresh+and+frozen+tissue+for+snRNAseq%5BTitle%5D)+AND+%22Protocols.io%22%5BJournal%5D)">'Frankenstein' protocol for nuclei isolation from fresh and frozen tissue for snRNAseq.</a> Protocols.io. , https://dx.doi.org/10.17504/protocols.io.3fkgjkw (2020).</li>
<li>Masilionis, I., Chaudhary, O., Chaligne, R., Mazutis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+extraction+for+single-cell+RNAseq+from+frozen+tissue+using+Singulator%E2%84%A2+100%5BTitle%5D)+AND+%22Protocols.io%22%5BJournal%5D)">Nuclei extraction for single-cell RNAseq from frozen tissue using Singulator™ 100.</a> Protocols.io. , https://www.protocols.io/view/nuclei-extraction-for-single-cell-rnaseq-from-froz-q26g74xzqgwz/v1 (2022).</li>
<li>Matson, K. J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+adult+spinal+cord+nuclei+for+massively+parallel+single-nucleus+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation of adult spinal cord nuclei for massively parallel single-nucleus RNA sequencing.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), 58413(2018).</li>
<li>Mendelev, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-omics+profiling+of+single+nuclei+from+frozen+archived+postmortem+human+pituitary+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multi-omics profiling of single nuclei from frozen archived postmortem human pituitary tissue.</a> STAR Protocols. 3 (2), 101446(2022).</li>
<li>Soule, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+single+nucleus+RNA-seq+from+frozen+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Science+Alliance%22%5BJournal%5D)">A protocol for single nucleus RNA-seq from frozen skeletal muscle.</a> Life Science Alliance. 6 (5), e202201806(2023).</li>
<li>Bakken, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+compared+in+matched+cortical+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types.</a> PLoS One. 13 (12), e0209648(2018).</li>
<li>Ding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+comparison+of+single-cell+and+single-nucleus+RNA-sequencing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Systematic comparison of single-cell and single-nucleus RNA-sequencing methods.</a> Nature Biotechnology. 38, 737-746 (2020).</li>
<li>Hu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+transcriptomic+survey+of+cell+diversity+and+functional+maturation+in+postnatal+mammalian+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus transcriptomic survey of cell diversity and functional maturation in postnatal mammalian hearts.</a> Genes & Development. 32 (19-20), 1344-1357 (2018).</li>
<li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+strategy+for+single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+confirms+accuracy+in+predicted+cell-type+expression+from+nuclear+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA.</a> Scientific Reports. 7, 6031(2017).</li>
<li>Narayanan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+Isolation+from+Fresh+Frozen+Brain+Tumors+for+Single-Nucleus+RNA-seq+and+ATAC-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Nuclei Isolation from Fresh Frozen Brain Tumors for Single-Nucleus RNA-seq and ATAC-seq.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), 61542(2020).</li>
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<li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decontamination+of+ambient+RNA+in+single-cell+RNA-seq+with+DecontX%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Decontamination of ambient RNA in single-cell RNA-seq with DecontX.</a> Genome Biology. 21 (1), 57(2020).</li>
<li>Young, M. D., Behjati, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SoupX+removes+ambient+RNA+contamination+from+droplet-based+single-cell+RNA+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Gigascience%22%5BJournal%5D)">SoupX removes ambient RNA contamination from droplet-based single-cell RNA sequencing data.</a> Gigascience. 9 (12), giaa151(2020).</li>
</ol>

所有作者在研究进行期间均为/曾是罗氏公司（F. Hoffmann-La Roche）的员工。

我们开发了一种多功能且部分自动化的方案，用于从冷冻的哺乳动物组织中获取高质量的单细胞核，并已在以下样本中验证了该方案的可行性&#160;小鼠脑、大鼠肾以及食蟹猴肝和脾组织。
在将本方案的性能与已发表的其他针对脑、肾、脾和肝组织的单细胞核RNA测序方案进行比较时6,7,20,24,25,26，我们发现本方案能够检测到每个细胞核中相似数量的基因和UMI计数，并能够成功回收预期的细胞类型。与现有方法相比，本方案具有多个优势。第一，本研究中的方案实现了组织&#160;匀浆化及单细胞核分离的自动化，这是通过使用机器人组织破碎仪21实现的。在大多数方案中，组织通常使用Dounce匀浆器进行匀浆以释放单个细胞核3,20。然而，我们注意到，这一手动步骤可能因匀浆过程中施加的力道不同而导致细胞核得率和完整性的实验间变异，从而影响实验的可重复性。本方案通过使用设定固定参数的自动化组织研磨仪，在不同实验中获得了更一致的高质量和高得率的细胞核。此外，该步骤的自动化也减少了实验操作时间（组织破碎步骤约需7分钟），使操作者可同时准备后续步骤。第二，本研究中描述的方案具有良好的通用性，即可适用于不同物种的多种组织类型，从而避免了繁琐的方案优化过程，例如为不同组织寻找合适的匀浆缓冲液或去污剂2,5,6。第三，本方案无需依赖流式分选仪即可获得高纯度的细胞核，因此对于缺乏流式分选设备或相关技术专长的实验室更具可及性。取而代之的是，我们优化了基于蔗糖梯度的过滤方法以去除大部分碎片。然而，对于脑组织，建议使用硅胶胶体梯度代替蔗糖梯度，以实现更高效的髓鞘去除。我们还发现，在蔗糖/硅胶胶体梯度离心步骤的最后使用摆动桶转子可最大程度减少细胞核损失，因此强烈推荐使用此类转子。第四，经过对多种细胞核计数方法（显微镜下手动计数、多种自动计数仪）的测试，推荐使用自动荧光细胞计数仪22。使用如碘化丙啶（propidium iodide）等DNA嵌入染料可提高细胞核计数的准确性。第五，本方案从开始到加载微流控芯片共需约75分钟，有助于在处理多个样本时保持较高的细胞核完整性。最后，我们发现本方案同样适用于最佳切割温度（OCT）包埋的组织。若使用此类材料，可在匀浆前用手术刀将组织从OCT包埋块中取出。
单核RNA测序数据集中一个常见的挑战是存在环境RNA（ambient RNA），其来源既可以是非核的（例如线粒体RNA），也可以是核来源的27,28。在我们的实验方案中，即使在过滤前，线粒体RNA（作为非核环境RNA的替代指标）的水平也很低（所示组织为0.1%-1.6%）。然而，与其他方案和数据集类似，来自高表达基因的丰度较高的细胞类型细胞核（例如肝脏中的肝细胞、脑组织中的神经元等）的环境RNA污染仍然存在27。目前已有一些生物信息学工具，如CellBender、SoupX等，可在细胞核注释前去除此类环境RNA污染29,30,31。本方案的另一个局限性在于，尽管组织解离和细胞核分离步骤已实现自动化，但该步骤的通量仍受限，因为每次只能处理一个样本。然而，由于每份组织的处理时间仅需约7分钟，因此仍可在同一批次中处理多个样本。我们通常每批次处理四个样本，但在实践中已成功实现每批次处理多达六个样本，并获得良好结果。近期，机器人解离仪的改进使得可同时平行处理两个样本，这将使每批次的处理能力提升至8–12个样本，与用于单核封装的微流控芯片的通量相匹配。
尽管我们尚未将本方案分离的细胞核用于其他平台的ATAC-seq或snRNA-seq等下游应用，但基于此处所用基因表达试剂获得的数据质量，我们认为本方案应可兼容其他下游应用。然而，未来的工作将包括测试本方案在ATAC-seq等其他下游应用中的适用性。
综上所述，我们开发了一种快速、简单且部分自动化的细胞核分离方案，可用于下游的单细胞核RNA测序，并已证明该方法适用于多种类型的冷冻哺乳动物组织。

单细胞（sc）和单核（sn）RNA测序由于相较于批量RNA测序具有更高的基因表达分辨率，已成为分子与细胞生物学中常用的实验方案。然而，从固体组织中分离出高质量的单细胞和单核悬液仍具挑战性，通常是sc/sn-RNAseq实验中的限速步骤。事实上，已有大量方案被开发出来，采用不同的化学和机械方法以获得细胞/核悬液1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15。此外，去除此类制备物中碎片、团块等杂质的策略包括流式分选、过滤和洗涤等。这些方案通常依赖人工操作（导致操作者间差异），可能耗时较长（导致细胞/核活力下降），和/或需要使用流式细胞仪进行细胞/核分选。本&#160;研究旨在建立一种简单、快速且部分自动化的从冷冻哺乳动物组织中提取单核的方案，用于后续RNA测序应用。我们特别聚焦于单核分离而非单细胞分离，因为前者适用于冷冻组织，使样本采集和处理更加便捷，并有利于样本的无偏分批，尤其适用于时间序列实验。此外，尽管核转录组不能完全代表细胞转录组，但已有多个研究表明，单核RNA测序数据在细胞类型鉴定方面与单细胞RNA测序数据具有可比性，尽管不同细胞类型的比例可能存在差异6,16,17,18,19。
细胞核分离包括以下几个步骤：1）通过机械或化学方法破碎组织以释放细胞核，2）清除碎片和团块，3）对细胞核进行准确计数，以便进行后续实验操作。在许多实验方案中，第1步通常使用Dounce匀浆器来破碎组织3,20。也可采用化学方法，但这些方法通常需要根据不同组织进行优化2,5,6。我们发现，手动组织破碎过程容易受到操作者个体差异的影响，导致细胞核的质量和得率不稳定。为了最大限度地减少技术性变异，并建立一种在不同组织间更一致且可重复的实验流程，我们开发了一种使用 commercially available 机器人组织解离仪的方案21。对于第2步，尽管缓冲液置换通常是清洗细胞核最简单的方法，但我们采用了相对较短的蔗糖梯度离心步骤，以更彻底地去除碎片。针对脑组织，我们使用二氧化硅胶体梯度代替蔗糖梯度&#160;，以更有效地去除髓鞘。最后，在细胞核计数方面，血细胞计数板是计数和显微观察细胞核的金标准。在本方案中，该步骤可使用 commercially available 自动荧光细胞计数仪可靠地实现自动化22。本方案已在多种哺乳动物的冷冻组织（包括脑、肾、脾和肝）上经过测试验证，适用于不同哺乳动物物种（大鼠、小鼠和非人灵长类动物），可为基于液滴的商业化单细胞核RNA测序平台提供高质量的细胞核。从组织准备到启动单细胞核RNA测序流程，整个过程约需75分钟。

<table><tbody><tr><td>1 M 二硫苏糖醇</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>P2325</td><td></td></tr><tr><td>10% Tween 20</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>1662404</td><td></td></tr><tr><td>10x 磁力分离器</td><td>10x Genomics</td><td>PN-120250</td><td></td></tr><tr><td>10x 涡旋振荡适配器</td><td>10x Genomics</td><td>PN-120251</td><td></td></tr><tr><td>1× DPBS（10×），无钙，无镁</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>14190144</td><td>4 ℃ 保存&amp;deg;C</td></tr><tr><td>30% 牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9576_50ML</td><td></td></tr><tr><td>400 mM Tris-HCl，pH 8.0</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15568025</td><td></td></tr><tr><td>40U/&amp;mu;l RNaseOUT 重组核糖核酸酶抑制剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10777019</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>安捷伦高灵敏度DNA试剂盒</td><td>安捷伦</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Cellaca MX 高通量全自动细胞计数仪</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>CELMXSYSF2</td><td>自动荧光细胞计数仪</td></tr><tr><td>Chromium Next GEM Chip G 单细胞试剂盒，16 次反应</td><td>10x Genomics</td><td>PN-1000127</td><td>单细胞基因表达试剂，室温保存</td></tr><tr><td>Chromium Next GEM 二级支架</td><td>10x Genomics</td><td>PN-1000195</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Next GEM 单细胞 3' 凝胶珠试剂盒 v3.1，4 次反应</td><td>10x Genomics</td><td>PN-1000129</td><td>单细胞基因表达试剂，-80℃保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Chromium Next GEM 单细胞 3' GEM，文库 &amp;amp; 凝胶微珠试剂盒 v3.1，4 次反应</td><td>10x Genomics</td><td>PN-1000128</td><td>单细胞基因表达试剂</td></tr><tr><td>Chromium Next GEM 单细胞 3' 文库构建试剂盒 v3.1，4 次反应</td><td>10x Genomics</td><td>PN-1000158</td><td>单细胞基因表达试剂，-20储存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Chromium Next GEM 单细胞 3'GEM 试剂盒 v3.1，4 次反应</td><td>10x genomics</td><td>PN-1000130</td><td>单细胞基因表达试剂，储存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>分隔式聚苯乙烯储液槽</td><td>VWR</td><td>41428-958</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind 离心管 1.5 ml Eppendorf</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EP0030108051</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind 离心管 2 ml Eppendorf</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EP0030108078</td><td></td></tr><tr><td>干冰</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne SILANE</td><td>10x Genomics</td><td>PN-2000048</td><td>单细胞基因表达试剂，4℃保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>乙醇 纯品</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>甘油（丙三醇），50%（v/v）</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3290-16</td><td></td></tr><tr><td>加热块</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>高通量 Nexcelom 计数板</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>CHM24-A100-001</td><td>细胞计数板计数</td></tr><tr><td>低TE缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8.0，0.1 mM EDTA）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12090015</td><td></td></tr><tr><td>迷你离心机</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>NovaSeq 6000 SP 试剂盒 v1.5（100 个循环）</td><td>Illumina</td><td>2002840</td><td></td></tr><tr><td>细胞核分离缓冲液</td><td>S2基因组学</td><td>100-063-396</td><td>4 ℃下保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>细胞核分离柱</td><td>S2 Genomics</td><td>100-063-287</td><td>4 ℃预冷 &amp;deg;使用前置于 C</td></tr><tr><td>Nuclei PURE 2 M 蔗糖垫溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NUC201-1KT</td><td>蔗糖垫溶液&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>细胞核PURE蔗糖垫缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NUC201-1KT</td><td></td></tr><tr><td>细胞核储存试剂</td><td>S2基因组学</td><td>100-063-405</td><td>4 ℃ 保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>0.2 ml 8联管 PCR管</td><td>Eppendorf</td><td>30124359</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-02</td><td>二氧化硅胶体溶液</td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen Buffer EB</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS 检测试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>冷冻离心机（Eppendorf 5804R）</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td>5805000010</td><td></td></tr><tr><td>带摆动桶转子的冷冻离心机（Eppendorf 5810R）</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td>5811000015</td><td></td></tr><tr><td>RNAseZap</td><td>Ambion</td><td>AM9780</td><td>RNA酶去污染溶液</td></tr><tr><td>圆形细胞培养培养皿</td><td>SPL</td><td>330005</td><td></td></tr><tr><td>一次性手术刀</td><td>Aesculap AG</td><td>BA210</td><td>使用前在干冰上预冷</td></tr><tr><td>单端索引试剂盒 T 型 A 组，96 次反应</td><td>10x Genomics</td><td>PN-1000213</td><td>单细胞基因表达试剂，-20℃保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Singulator 100 系统</td><td>S2 Genomics</td><td>-</td><td>市售的组织解离用机器人设备</td></tr><tr><td>1 M 氢氧化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>SPRIselect 试剂盒</td><td>贝克曼库尔特</td><td>b23318</td><td></td></tr><tr><td>无菌镊子</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 无 DNase/RNase 灭菌蒸馏水</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10977049</td><td></td></tr><tr><td>ViaStain PI 染色液</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>CS1-0109-5mL</td><td>碘化丙啶染色液</td></tr><tr><td>涡旋混合器+A2:D44</td><td>VWR</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

一种简单、快速且部分自动化的从冷冻哺乳动物组织中分离单核用于单核测序的方案

A Simple, Quick, and Partially Automated Protocol for the Isolation of Single Nuclei from Frozen Mammalian Tissues for Single Nucleus Sequencing

单细胞和单细胞核RNA测序由于能够提供丰富的转录组信息，已成为常见的实验室应用。特别是单细胞核RNA测序，适用于研究难以解离组织中的基因表达。此外，该方法还可与冷冻（存档）样本兼容。本文介绍一种利用商业化仪器和试剂，以部分自动化方式从冷冻哺乳动物组织中分离高质量单细胞核，用于后续单细胞核RNA测序的实验方案。具体而言，使用 robotic 解离仪自动化并标准化组织匀浆过程，随后采用优化的化学梯度法过滤细胞核。最后，利用自动化荧光细胞计数仪对细胞核进行精确且自动的计数。本方案已在小鼠脑、大鼠肾脏以及食蟹猴肝脏和脾脏组织中得到验证。该方案操作简便、快速，可轻松适用于多种哺乳动物组织，无需大量优化，即可为后续单细胞核RNA测序提供高质量的细胞核。

本方案的性能和通用性通过以下样本的单细胞核RNA测序实验得以验证：来自三只B6小鼠的新鲜冷冻枕叶皮层脑组织、来自三只Wistar大鼠的新鲜冷冻横向切取的肾脏组织，以及来自三只毛里求斯恒河猴的存档（11年）肝脏和脾脏组织。所有动物均未进行灌流处理。
如图所示 图1B,C，获得了高质量的细胞核，无出芽、碎片和聚集现象。通过测试不同密度、离心速度和时间，并在显微镜下评估细胞核纯度/完整性以及细胞核大小分布和得率，优化了基于蔗糖梯度的过滤方法以去除大部分碎片（图1D）。这使我们能够选择1.5 M的蔗糖梯度密度，并采用15分钟的短时间离心。接下来，为进一步评估细胞核的质量，使用10X Cell Ranger对数据进行预处理，并利用Besca进行后续的下游数据分析。23. 具有细胞核的 &gt;过滤掉线粒体含量达5%的细胞核（因这类细胞核通常受损或处于应激状态），保留含有500至7,000个基因的细胞核（以最大限度减少空液滴和多重体的干扰）。仅纳入在至少30个细胞核中出现的基因。每份脑皮层样本目标获取8,000个细胞核，每份肾脏、肝脏和脾脏样本目标获取10,000个细胞核。经过过滤后，从三份脑组织样本中获得10,644个高质量细胞核，从三份肾脏样本中获得14,960个高质量细胞核，从三份肝脏样本中获得18,795个高质量细胞核，从三份脾脏样本中获得13,882个高质量细胞核。 图2A,D,G,J 显示各样本中UMI计数、基因计数和线粒体含量分布的小提琴图。所有脑组织样本的中位计数为7,563 UMI/核和3,208 基因/核；所有肾组织样本的中位计数为3,841 UMI/核和1,915 基因/核；所有肝组织样本的中位计数为2,649 UMI/核和1,676 基因/核；所有脾组织样本的中位计数为1,609 UMI/核和1,138 基因/核。随后，我们利用高变基因进行聚类分析，并通过已知的标记基因对聚类结果进行注释。17,24,25,26如图所示 图 2B,E,H,K，我们能够从每种组织中鉴定出预期的细胞类型。此外，如图中所示 图2B,E,H,K所有动物均对各个聚类有所贡献，表明该实验方案引入的技术变异性总体较低。此外，每种组织类型的三个样本之间的细胞比例相近，UMI 数量和基因计数也相似。图2A,C,D,F,G,I,J,L）。一个显著的例外是肝脏，三个肝脏样本中的肝细胞群体在比例和特征上均有所不同，这很可能归因于动物之间的生物学差异（如性别、年龄、代谢状态）。
<img alt="蔗糖密度梯度相分离；显微镜图像；细胞核得率和大小分布图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65611/65611fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：细胞核质量评估与蔗糖梯度优化。（A）蔗糖梯度离心中预期的相分离情况以箭头标示。（B）采用本方案获得的大鼠肾脏（上）和食蟹猴脾脏（下）细胞核的代表性碘化丙啶染色荧光图像。（C）从小鼠肝脏（上）和小鼠脑组织（下）分离的细胞核的代表性明场显微图像，比例尺为500 µm。注意细胞核表面规则光滑，表明细胞核质量良好。（D）蔗糖梯度优化。测试了多种蔗糖密度、离心转速和离心时间。针对每种条件展示了细胞核的明场显微图像、细胞核大小分布及细胞核得率。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65611/65611fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="小提琴图、UMAP 图、柱状图。单细胞 RNA 测序数据分析、基因表达水平。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65611/65611fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：小鼠脑枕叶皮层、大鼠肾脏（皮质和髓质）以及食蟹猴肝脏和脾脏的单核 RNA 测序（snRNA-seq）代表性数据。（A）小提琴图，显示每份脑组织样本中每个细胞核的基因数、UMI 数及线粒体内容物百分比的分布情况。（B）左图：UMAP 图显示每份样本对脑组织中鉴定出的细胞簇的贡献。右图：基于标记基因对脑组织中细胞簇进行注释后的细胞簇身份识别 UMAP 图。（C）在 3 份脑组织样本中观察到的细胞比例。（D）小提琴图，显示每份肾脏样本中每个细胞核的基因数、UMI 数及线粒体内容物百分比的分布情况。（E）左图：UMAP 图显示每份样本对肾脏中鉴定出的细胞簇的贡献。右图：基于标记基因对肾脏组织中细胞簇进行注释后的细胞簇身份识别 UMAP 图。（F）在 3 份肾脏样本中观察到的细胞比例。（G）小提琴图，显示每份肝脏样本中每个细胞核的基因数、UMI 数及线粒体内容物百分比的分布情况。（H）左图：UMAP 图显示每份样本对肝脏中鉴定出的细胞簇的贡献。右图：基于标记基因对肝脏组织中细胞簇进行注释后的细胞簇身份识别 UMAP 图。（I）在 3 份肝脏样本中观察到的细胞比例。（J）小提琴图，显示每份脾脏样本中每个细胞核的基因数、UMI 数及线粒体内容物百分比的分布情况。（K）左图：UMAP 图显示每份样本对脾脏中鉴定出的细胞簇的贡献。右图：基于标记基因对脾脏组织中细胞簇进行注释后的细胞簇身份识别 UMAP 图。（L）在 3 份脾脏样本中观察到的细胞比例。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65611/65611fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>储存浓度</td>
			<td>每样品体积</td>
			<td>终浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>蔗糖垫溶液</td>
			<td>2 M</td>
			<td>1500 µL</td>
			<td>1.5 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>蔗糖垫缓冲液</td>
			<td>-</td>
			<td>500 µL</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>二硫苏糖醇（DTT）</td>
			<td>1 M</td>
			<td>2 µL</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase抑制剂</td>
			<td>40 U/µL</td>
			<td>10 µL</td>
			<td>0.2 U/µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：1.5 M蔗糖垫层溶液（SCS）的配制。 该溶液用于步骤3.1纯化过程中的蔗糖梯度离心，每次开始实验前均需新鲜配制。在整个实验过程中，SCS必须始终置于冰上。本表中提到的溶液在材料表中均有引用。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>储存浓度</td>
			<td>每样本体积</td>
			<td>终浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>二氧化硅胶体储存液</td>
			<td>90%</td>
			<td>600 µL</td>
			<td>18%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei Storage Reagent (S2 Genomics)</td>
			<td>-</td>
			<td>2400 µL</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase抑制剂</td>
			<td>40 U/µL</td>
			<td>15 µL</td>
			<td>0.2 U/µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：18%二氧化硅胶体溶液的制备。 该溶液用于步骤3.2纯化过程中的二氧化硅胶体梯度离心，每次开始实验前均需新鲜配制。在实验过程中，始终将18%二氧化硅胶体溶液置于冰上保存。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组织</td>
			<td>样本重量</td>
			<td>试剂盒</td>
			<td>得率</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>大鼠肝脏</td>
			<td>25 mg</td>
			<td>Nuclei Isolation Cartridge</td>
			<td>每毫克组织 65,000 个细胞核</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>大鼠肝脏</td>
			<td>4 mg</td>
			<td>Small Input Nuclei Isolation Cartridge</td>
			<td>每毫克组织 32,000 个细胞核</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：低输入量细胞核分离柱与经蔗糖梯度纯化后细胞核分离柱的细胞核得率比较。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>储存浓度</td>
			<td>每样本体积</td>
			<td>终浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei Storage Reagent</td>
			<td>-</td>
			<td>1000 µL</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse inhibitor </td>
			<td>40 U/µL</td>
			<td>5 µL</td>
			<td>0.2 U/µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表4：细胞核储存试剂（NSR）的配制。 该溶液在细胞核分离步骤3-5以及纯化步骤3.1.8中使用。可在4 °C下保存最多4个月。在纯化步骤6的离心过程中，需加入RNase抑制剂配制新鲜的分装溶液。本表中提到的溶液均在材料表中有所引用。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">1x PBS + 0.04% BSA 储存液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>储存液浓度</td>
			<td>配制储存液所需体积</td>
			<td>终浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (无 Ca2+, 无 Mg2+)</td>
			<td>1x</td>
			<td>30 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>牛血清白蛋白 (BSA)</td>
			<td>30%</td>
			<td>40 µL</td>
			<td>0.04%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">1x PBS + 0.04% BSA + 0.2 U/µL RNA酶抑制剂</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>储存液浓度</td>
			<td>每样本所需体积</td>
			<td>终浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS + 0.04% BSA 储存液</td>
			<td>-</td>
			<td>500 µL</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA酶抑制剂</td>
			<td>40 U/µL</td>
			<td>2.5 µL</td>
			<td>0.2 U/µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表5：含0.04% BSA的PBS溶液的配制。 该溶液用于步骤3.1.10纯化结束时，以及计数后用于将细胞核悬液稀释至10X单细胞核RNA测序所需的浓度（计数步骤4.4）。该储存液可在4 °C保存最多1个月。在纯化步骤6的离心过程中，需加入RNase抑制剂，新鲜分装使用。

本研究介绍了一种简单、快速且部分自动化的方案，用于从冷冻的哺乳动物组织中分离高质量的细胞核，以用于后续的单细胞核RNA测序。

单细胞和单核RNA测序由于能够提供丰富的转录组信息，已成为常见的实验室应用……

本研究旨在利用单细胞核RNA测序技术，支持药物发现研究，以评估潜在治疗方法的有效性和安全性。因此，我们正在为来自不同器官的新鲜冷冻组织样本开发标准化的细胞核提取方案。我们的目标是实现细胞核提取的自动化和标准化，通过减少非生物学变异，获得一致且可靠的结果。其优势在于通过使用机器人解离仪实现部分自动化，以及流程简单快捷，可应用于不同物种的多种组织样本。采用标准化方案有助于我们回答有关药物生物分布的问题，并探索可能观察到的任何安全性信号背后的机制。未来，我们将测试本方案在其他下游应用中的适用性，例如ATAC-seq或多组学分析。我们还将尝试建立在单个细胞核中检测病毒表达的转基因的方案。首先，启动机器人解离仪。通过将屏幕右侧顶部的滑块设置为“冷却”并点击以开始冷却，使滑块显示为橙色。接下来，检查连接的 NSR 和 NIB 瓶中的液体是否充足，并确认已适当冷却。将组织样本从负80摄氏度冰箱中取出，并立即置于干冰上。使用预冷的解剖刀，在置于干冰上的预冷培养皿或金属板上，将组织切成15至15毫克大小的组织块。从冰箱中取出细胞核分离柱并拆开包装。取出研磨器，并用移液器向柱底部加入15微升RNA酶抑制剂。使用镊子将组织样本放置在柱底部。接下来，在仪器上选择运行一个方案，然后点击左上角的细胞核选项。在菜单中选择低体积细胞核分离方案，然后点击“修改”，确认破碎速度已设置为最快。接着打开仪器门，将试剂盒插入指定位置，旋转试剂盒锁扣，并将试剂盒推入载台，直到红色旋钮发出咔嗒声并卡入到位。关闭门并点击下一步以开始细胞核提取运行。运行完成后，通过提起红色旋钮并拉出载台，将 cartridge 从仪器中取出。立即将 cartridge 置于冰上。从冷冻的哺乳动物组织中分离出单个细胞核后，使用移液枪头小心刺穿解离柱上圆形的铝箔。为了便于蔗糖梯度纯化，从解离柱中取出900微升细胞核悬液，加入到已准备好的2毫升离心管中的500微升蔗糖缓冲液（SCS）中。通过移液充分混匀，直至混合物均匀一致。接下来，将离心管倾斜，小心地将1,400微升细胞核悬液-SCS混合物逐滴加入含有500微升SCS的新离心管中，形成清晰可见的相分离。小心盖紧管盖，将离心管放回冰上，避免扰动相分离界面。在预冷的离心机中，于4°C条件下以13,000 G离心15分钟。小心移除上清液，不要扰动沉淀，然后在50微升冰浴的NSR中轻轻重悬沉淀。将同一样品的两份沉淀合并至一个新的1.5毫升离心管中。加入900微升冰浴的NSR，使总体积达到1毫升，用移液器充分混匀。使用水平转子离心机，在 4 摄氏度条件下以 500 ×g 离心样品 5 分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于 100 µL 的 PBS 中。计数时，取 10 µL 细胞核悬液与 20 µL PBS 混合稀释。向荧光计数板的混样孔中加入 25 微升碘化丙啶染色液。然后加入 25 微升稀释的细胞核悬液，通过移液充分混匀。将 50 微升染色后的样品从混样孔转移至加样孔中。将计数板加载到细胞计数仪上并开始计数。计数完成后，用 PBS 将样品稀释至单核 RNA 测序所需的浓度。采用部分自动化的细胞核分离方案，获得了高质量的细胞核，无破裂、碎片或聚团现象。展示了每个样本中基因计数、UMI计数和线粒体含量分布的 violin 图。鉴定了每种组织来源的预期细胞类型，且所有动物均贡献于所有细胞簇，表明该实验方案引入的技术变异度较低。此外，每种组织类型的三个样本之间，细胞比例、UMI计数和基因计数均具有可比性。

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一种简单、快速、部分自动化的方案，用于从冷冻哺乳动物组织中分离单细胞核，用于单细胞核测序

本文介绍一种从新鲜或冷冻组织中快速分离高质量细胞核的方案，适用于后续的大规模平行RNA测序。方案中包括去污剂-机械法和低渗-机械法两种组织破碎与细胞裂解方法，均可用于细胞核的分离。...

用于大规模并行单核RNA测序的成年脊髓核的分离

本文介绍了一种从成熟脂肪细胞中分离细胞核、通过荧光激活分选进行纯化以及在单细胞水平上进行转录组学分析的实验方案。...

用于单细胞基因组学应用的脂肪组织细胞核分离

单个细胞核的分离依赖于细胞膜的解离和基于去垢剂的透化处理，这些步骤需要优化，且容易引入技术性假象。我们展示了一种无需去垢剂和酶的快速分离完整细胞核的方案，可直接从完整组织中获取适用于单细胞核RNA测序（snRNA-Seq）或ATAC-seq的细胞核。...

使用去污剂和酶解-free方法从完整组织中分离细胞核

肿瘤内异质性是包括胶质瘤在内的各种肿瘤的固有特征。我们开发了一种简单高效的实验方案，通过结合使用多种缓冲液和梯度离心方法，从新鲜冷冻的胶质瘤组织中分离单个细胞核，用于单细胞核RNA测序和ATAC测序研究。...

从新鲜冷冻脑肿瘤组织中分离细胞核用于单核RNA测序和ATAC测序

本文介绍一种从冻存小鼠肾脏中分离高质量细胞核的实验方案，该方法可提高肾髓质细胞类型的代表性，并避免酶解组织解离导致的基因表达异常。...

从成年小鼠肾脏中分离细胞核用于单细胞核RNA测序

本方案详细描述了单细胞核测序的低起始量样本制备流程，包括小鼠颈上神经节和星状神经节的解剖、细胞解离、冷冻保存、细胞核分离以及标签条形码标记。...

低输入量细胞核分离及条形码抗体多重检测小鼠交感神经节用于单细胞核RNA测序

本文介绍一种从速冻保存的存档肝组织中分离细胞核的方案，用于单细胞核RNA测序（RNA-seq）、ATAC-seq以及联合多组学分析（RNA-seq和ATAC-seq）。...

从速冻肝组织中分离细胞核用于单细胞多组学分析

本文介绍了一种细胞核制备的实验方案。在将心脏组织经显微解剖和酶解离为单个细胞后，祖细胞被冷冻保存，随后分离出纯度高且具有活性的细胞，用于单核RNA测序以及基于高通量测序的单核转座酶可及性染色质分析。...

从小鼠心脏前体细胞中分离细胞核用于单细胞分辨率下的表观基因组和基因表达谱分析

本方案提供了一种可靠且经过优化的方法，用于从实体瘤样本中分离细胞核，以进行基于10x...

优化从新鲜及冷冻实体瘤标本中分离细胞核以进行多组学测序

我们描述了一种从冻存的诱导多能干细胞来源的基质/内皮细胞和血细胞类型中提取高质量细胞核的方案，以支持单细胞核下一代测序分析。获得高质量且完整的细胞核对于多组学实验至关重要，但对部分实验室而言，这可能构成进入该领域的技术障碍。...

从冷冻保存的体外衍生血细胞中分离细胞核

由于人体组织获取受限，肌间脂肪组织（IMAT）的生物学特性在很大程度上尚未被探索。本文介绍了一种从冷冻的人类IMAT样本中分离细胞核并构建文库的详细方案，用于单细胞核RNA测序，以鉴定这一独特脂肪储存库的细胞组成。...

从人间质脂肪组织中分离细胞核及后续单细胞核RNA测序

了解从冷冻哺乳动物组织中分离高质量细胞核的部分自动化方案，用于单细胞核RNA测序。该方法利用机器人解离器减少非生物学变异，为药物发现研究提供一致可靠的结果。

一种简单、快速且部分自动化的从冷冻哺乳动物组织中分离单核用于单核测序的方案

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