一种简单、快速且部分自动化的从冷冻哺乳动物组织中分离单核用于单核测序的方案

本研究旨在利用单细胞核RNA测序技术，支持药物发现研究，以评估潜在治疗方法的有效性和安全性。因此，我们正在为来自不同器官的新鲜冷冻组织样本开发标准化的细胞核提取方案。我们的目标是实现细胞核提取的自动化和标准化，通过减少非生物学变异，获得一致且可靠的结果。

其优势在于通过使用机器人解离仪实现部分自动化，以及流程简单快捷，可应用于不同物种的多种组织样本。采用标准化方案有助于我们回答有关药物生物分布的问题，并探索可能观察到的任何安全性信号背后的机制。未来，我们将测试本方案在其他下游应用中的适用性，例如ATAC-seq或多组学分析。

我们还将尝试建立在单个细胞核中检测病毒表达的转基因的方案。首先，启动机器人解离仪。通过将屏幕右侧顶部的滑块设置为“冷却”并点击以开始冷却，使滑块显示为橙色。

接下来，检查连接的 NSR 和 NIB 瓶中的液体是否充足，并确认已适当冷却。将组织样本从负80摄氏度冰箱中取出，并立即置于干冰上。使用预冷的解剖刀，在置于干冰上的预冷培养皿或金属板上，将组织切成15至15毫克大小的组织块。

从冰箱中取出细胞核分离柱并拆开包装。取出研磨器，并用移液器向柱底部加入15微升RNA酶抑制剂。使用镊子将组织样本放置在柱底部。

接下来，在仪器上选择运行一个方案，然后点击左上角的细胞核选项。在菜单中选择低体积细胞核分离方案，然后点击“修改”，确认破碎速度已设置为最快。接着打开仪器门，将试剂盒插入指定位置，旋转试剂盒锁扣，并将试剂盒推入载台，直到红色旋钮发出咔嗒声并卡入到位。

关闭门并点击下一步以开始细胞核提取运行。运行完成后，通过提起红色旋钮并拉出载台，将 cartridge 从仪器中取出。立即将 cartridge 置于冰上。

从冷冻的哺乳动物组织中分离出单个细胞核后，使用移液枪头小心刺穿解离柱上圆形的铝箔。为了便于蔗糖梯度纯化，从解离柱中取出900微升细胞核悬液，加入到已准备好的2毫升离心管中的500微升蔗糖缓冲液（SCS）中。通过移液充分混匀，直至混合物均匀一致。

接下来，将离心管倾斜，小心地将1,400微升细胞核悬液-SCS混合物逐滴加入含有500微升SCS的新离心管中，形成清晰可见的相分离。小心盖紧管盖，将离心管放回冰上，避免扰动相分离界面。在预冷的离心机中，于4°C条件下以13,000 G离心15分钟。

小心移除上清液，不要扰动沉淀，然后在50微升冰浴的NSR中轻轻重悬沉淀。将同一样品的两份沉淀合并至一个新的1.5毫升离心管中。加入900微升冰浴的NSR，使总体积达到1毫升，用移液器充分混匀。

使用水平转子离心机，在 4 摄氏度条件下以 500 ×g 离心样品 5 分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于 100 µL 的 PBS 中。计数时，取 10 µL 细胞核悬液与 20 µL PBS 混合稀释。

向荧光计数板的混样孔中加入 25 微升碘化丙啶染色液。然后加入 25 微升稀释的细胞核悬液，通过移液充分混匀。将 50 微升染色后的样品从混样孔转移至加样孔中。

将计数板加载到细胞计数仪上并开始计数。计数完成后，用 PBS 将样品稀释至单核 RNA 测序所需的浓度。采用部分自动化的细胞核分离方案，获得了高质量的细胞核，无破裂、碎片或聚团现象。

展示了每个样本中基因计数、UMI计数和线粒体含量分布的 violin 图。鉴定了每种组织来源的预期细胞类型，且所有动物均贡献于所有细胞簇，表明该实验方案引入的技术变异度较低。此外，每种组织类型的三个样本之间，细胞比例、UMI计数和基因计数均具有可比性。