Name: 使用 Tile/SED/Array 接口在多路复用离子束成像显微镜上快速构建组织微阵列和平铺面积成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-15T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: 了解如何使用平铺SED阵列界面在多路复用离子束成像显微镜上快速构建组织微阵列和平铺面积成像。该方法通过直观的图形界面优化视野定位，提高成像效率并减少用户操作错误。

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H. Piyadasa 获得加拿大卫生研究院（CIHR）博士后奖学金（MFE-176490）的支持。B. Oberlton 获得美国国家科学基金会（NSF）奖学金（2020298220）的支持。A. Tsai 获得达蒙·鲁尼恩癌症研究基金会（DRCRF）奖学金（DRG-118-16）、斯坦福大学病理学系、Annelies Gramberg 基金以及美国国立卫生研究院（NIH）1U54HL165445-01 项目的支持。特别致谢 Avery Lam 博士、Davide Franchina 博士和 Mako Goldston 在程序测试与调试过程中提供的帮助。

1. TSAI 的加载
<ol>
	<li>运行 TSAI，方法是打开&#160;在MIBI用户控制计算机的网页浏览器中访问 https://tsai.stanford.edu/research/mibi_tsai。
	<ol>
		<li>此 TSAI 实例包含自定义预设，这些预设不适用于所有仪器。使用时，仅应根据生成的模板视野（FOV）构建图块&#160;在步骤2.6中如下所述。TSAI在网页浏览器中本地运行，所有图像、.json文件或文件名数据均不会发送至服务器，也不会在服务器上存储。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>或者，可在任意网站上使用自定义预设为任何仪器设置 TSAI。
	<ol>
		<li>访问 https://github.com/ag-tsai/mibi_tsai 并下载 mibi_tsai_standalone 目录。或者，下载&#160;补充编码文件 1 .zip 文件并将其内容解压到名为 mibi_tsai_standalone 的目录中。</li>
		<li>在任意文本编辑器中打开 mibi_tsai_standalone/_resources/index.js。</li>
		<li>如有必要，在 index.js 中编辑视场大小（FOV size）、停留时间/时序选择（dwell time/timing choice）、光栅大小（raster size）、视场 JSON（FOV JSON）以及推荐的预设设置，以匹配仪器的设置。这主要适用于定制仪器，但无论何种情况都应核对停留时间/时序选择的配对。保存 index.js。</li>
		<li>将 mibi_tsai_standalone 上传至可通过互联网访问的任何网络服务器，例如实验室网站或大学托管的网站。</li>
		<li>在中国台湾的 MIBI 用户控制计算机的网页浏览器中打开 mibi_tsai_standalone/index.html。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 加载MIBI切片并创建模板文件
<ol>
	<li>在网页浏览器中登录 MIBI 实验追踪系统（制造商提供的用于管理扫描相关元数据的网络界面）。</li>
	<li>在 切片 选项卡中，添加&#160;一张新的切片并添加一个新的区域（补充图 2A-B）。在 资源 选项卡中，选择或创建一个标记物面板（补充图 2C）。</li>
	<li>在 区域 选项卡中，将新区域添加到该面板中（补充图 2D）。</li>
	<li>在网页浏览器中登录 MIBI 用户控制界面。通过点击 更换样本 并选择新切片来加载 MIBI 切片（补充图 3A）。</li>
	<li>通过点击 添加视野（补充图 3B）并设置框架尺寸、视野大小、停留时间、成像模式和区域编号，创建一个模板视野。</li>
	<li>将视野列表导出（下载）为 .json 文件（补充图 3C）。将光学图像下载为 .png 文件（补充图 3D）。</li>
</ol>
3. 光学图像-载物台电机联合配准
<ol>
	<li>在网页浏览器中打开 TSAI 网络用户界面。如果尚未进行过共定位校准，光学共定位菜单应会自动打开。如果已完成且结果合适，则无需重复这些步骤。</li>
	<li>打开光学共定位菜单，点击复制自动共定位代码到剪贴板（补充图 4A）。</li>
	<li>在网页浏览器中打开 MIBI 用户控制界面。按下Ctrl+Shift+J以打开浏览器控制台，或在页面上右键单击并选择检查，然后打开控制台选项卡（补充图 4B）。</li>
	<li>将代码粘贴到控制台中并按下Enter键。点击控制台中生成的链接（补充图 4C）。此操作会将共定位信息加载到 TSAI 网络用户界面中，并作为 Cookie 保存，以便持久保留；除非仪器硬件发生变更，否则无需重复此步骤。</li>
</ol>
4. 拼接式 SED 扫描
<ol>
	<li>将步骤&#160;2.6&#160;中的光学图像 .png 和 .json 文件通过拖放方式加载到 TSAI 网页用户界面中。</li>
	<li>打开 SED Tiler 菜单，点击顶部一行中的文本框（补充图 5A）。</li>
	<li>点击 （± 拖动）光学图像以选择 SED 扫描的左上角（补充图 5B）。</li>
	<li>按下 D 键，或点击 SED Tiler 菜单中第二行的文本框。</li>
	<li>点击 （± 拖动）光学图像以选择 SED 扫描的右下角。</li>
	<li>在 SED Tiler 菜单中，点击 复制 SED 扫描和偏移校正代码到剪贴板（补充图 5C）。</li>
	<li>在网页浏览器中打开 MIBI 用户控制界面。将代码粘贴到控制台并按下 Enter （补充图 5D）。</li>
	<li>将 MIBI 设置为 QC 模式下的 SED 模式（300 µm 设置），移动至不进行采集的区域，并调节增益、聚焦和像散。
	<ol>
		<li>在不改变增益的情况下调节 SED 图像的亮度和对比度。按下 B 键可增加亮度，按下 Shift+B 可降低亮度；按下 C 键可增加对比度，按下 Shift+C 可降低对比度；按下 Shift+V 可重置亮度和对比度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按下 Shift+T 开始拼接 SED 扫描。</li>
	<li>完成后，系统应自动保存一张新的拼接 SED 图像 .png 文件（图 3）。可在文件名开头添加字符，但不得修改文件名的其他部分。</li>
	<li>若某些图块失焦或扫描异常，需重新扫描。
	<ol>
		<li>按下 Shift+R 将图块添加至重扫队列。此时将弹出对话框，提示用户输入图块的行和列。编号为零起始，因此输入 8,0 表示第九行第一列。</li>
		<li>将所有相关图块添加至队列后，按下 Shift+T 进行重扫。完成后，系统应自动保存一张新的拼接 SED 图像 .png 文件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>关键步骤：检查拼接 SED 扫描图像是否存在严重错位（图 3C-D）。若存在错位，请联系设备制造商技术支持以调整电机和成像束，或尝试使用步骤 4.12.1 至 4.12.9 中的键盘控制进行手动软件校正（补充图 6A）。
	<ol>
		<li>为检查 SED-载物台电机对准情况，将视野移至载玻片无组织区域。按下 Shift+5 在棋盘格模式下烧蚀五个 400 µm 视场（FOV）（补充图 6B-C），或按下 Shift+9 烧蚀 3 × 3 排列的 400 µm FOV（补充图 6D-E）。</li>
		<li>若 FOV 列间距过大，按下 1 并将 x f(x) 值设为负小数，通常在 -0.0025 至 -0.1 之间。</li>
		<li>若第三行 FOV 相对于第一行 FOV 向左偏移，按下 2 并将 x f(y) 值设为正小数，通常在 0.0025 至 0.1 之间。</li>
		<li>若第三列 FOV 相对于第一列 FOV 向下偏移，按下 3 并将 y f(x) 值设为负小数，通常在 -0.0025 至 -0.1 之间。</li>
		<li>若 FOV 行间距过大，按下 4 并将 y f(y) 值设为负小数，通常在 -0.0025 至 -0.1 之间。</li>
		<li>重复执行步骤 4.12.1 至 4.12.5，直至棋盘格和 3 × 3 模式形成大致笔直的网格（补充图 6C, E）。</li>
		<li>按下 S 保存包含校正参数的图案 .png 图像，参数值将包含在文件名中。</li>
		<li>将此 .png 文件拖放到 TSAI 网页用户界面，以加载参数并保存至浏览器 Cookie。</li>
		<li>执行拼接 SED 扫描以验证系数。根据步骤 4.12.2 至 4.12.5 的相同原理，进一步调整系数以校正拼接 SED 图像中的任何错位。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>若拼接 SED 图像质量合格，按下 Escape 键退出。返回 TSAI 网页用户界面。</li>
	<li>将拼接 SED 的 .png 文件拖放到 TSAI 网页用户界面中（补充图 5E）。</li>
	<li>点击 SED 标签页并调整缩放比例（补充图 5F）。</li>
	<li>如需调节图像亮度和对比度，或绘图选项（如线条粗细和光标大小），请使用 SED 图像上方的滑块选项菜单。</li>
	<li>可使用键盘快捷键，大多数快捷键显示在图像控制按钮旁：按下 Z 放大，按下 Shift+Z 缩小；按下 B 增加亮度，按下 Shift+B 降低亮度；按下 C 增加对比度，按下 Shift+C 降低对比度；按下 Shift+V 重置亮度和对比度；按下 L 切换图块上方的标签显示；按下 O 切换围绕对焦位点绘制的 5 mm 半径圆。</li>
</ol>
5. 组织微阵列（TMA）
<ol>
	<li>若要为组织芯片（TMA）点阵设置视野（FOV），首先设置需复制的FOV模式。在“Tiles”列的相关图块中，调整列数和行数（图4A），并在地图中勾选/取消勾选相应方框（图4B），同时根据需要调整其他FOV设置。</li>
	<li>在相关图块中，点击 TMA 以打开TMA选项菜单（图4C）。设置TMA点阵的行数和列数（图4D）。如有需要，添加命名前缀（图4E），并编辑起始行和列的编号（图4F）。</li>
	<li>在载玻片图像上，点击TMA的四个角（图4G-J）。点击并拖动带圆圈的角点，调整十字线位置，使其与TMA点阵最佳匹配。</li>
	<li>从TMA选项菜单中点击 Build TMA（构建TMA）（图4K）。</li>
	<li>将鼠标悬停在“Tiles”列的每个图块上，以检查其位置。如需调整，点击 Move （移动）（图4L），然后在载玻片图像上点击并拖动，或使用键盘方向键进行移动。
	<ol>
		<li>按方向键时，同时按住 Shift 键可进行更远距离的移动；按住 Alt （Windows）或 Opt （Mac）键可进行更短距离的移动。</li>
		<li>当选择“移动”时，按下 T 可取消图块名称旁的复选框，将其从视图中隐藏，并从后续生成的任何 .json 文件中排除。或者，可直接用鼠标取消复选框（图4M），或点击 Delete 将其完全删除。</li>
		<li>当选择“移动”时，按下 2、4 或 8 可将FOV大小分别设置为 200 µm、400 µm 或 800 µm，光栅尺寸将按比例缩放，以保持成像分辨率不变。</li>
		<li>当选择“移动”时，按下 A 可跳转到前一个图块，或&#160;按下 D 跳转到下一个图块。</li>
		<li>如需调整其他图块设置，若设置菜单未显示，请点击&#160;≡ 按钮以展开设置菜单。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 区域/多边形瓦片
<ol>
	<li>若要设置视野（FOV）以覆盖组织的连续区域，首先在 Tiles 模块的相关图块中根据需要调整 FOV 参数&#160;柱</li>
	<li>在相关图块中，单击 多边形 (图5A）。单击幻灯片图像以设置待拼接区域的顶点/角点（图5B- C）。双击以闭合多边形，并用视野（FOVs）覆盖该区域（图 5D).</li>
	<li>滚动至磁贴底部&#160;柱并单击 ≡ 按钮（^ 展开时 图5E在新多边形瓦片中查看瓦片地图。</li>
	<li>通过点击图块地图来开启或关闭单个图块图5F），或通过点击 点击器 (图 5G）并点击幻灯片图像中平铺的视野区域（FOVs）。</li>
	<li>要关闭多个视野，请单击 橡皮擦 然后在切片图像的平铺视野（FOVs）上单击并拖动图 5H).</li>
	<li>要开启多个视野区域，请点击 点击器 (图 5G）然后点击并拖动平铺图覆盖的幻灯片图像中的空白区域。</li>
	<li>要插入上方的行，请点击 ▲ 按钮（图 5I）。若要在左侧插入列，请单击 ◄ 按钮（图5J).</li>
	<li>要调整拼贴位置，请单击 移动 (图 5K）。然后在幻灯片图像上单击并拖动，同时按下键盘 方向键，或使用步骤5.5.1至5.5.5中描述的其他对照。</li>
</ol>
7. 视野导航与调整
<ol>
	<li>如果 SED 拼接图像未对齐或光学图像十字线未能反映实际的载物台电机位置，可借助以下键盘控制，在 MIBI 用户控制界面的 SED 模式下调整视场位置。</li>
	<li>在载玻片（光学或SED）图像下方打开视野导航/调整菜单。点击 复制视野导航代码到剪贴板.</li>
	<li>在网页浏览器中打开 MIBI 用户控制界面。将 MIBI 置于 SED 模式，并调节增益、聚焦和消像散。</li>
	<li>按压 Ctrl+Shift+J 打开浏览器控制台，或右键点击页面并选择 检查，然后打开控制台标签页。</li>
	<li>将代码粘贴到控制台中并按下 进入代码将自动导航至第一个视野（FOV），并精确定位到MIBI用户控制界面中SED图像所显示的FOV位置。</li>
	<li>调整SED图像的亮度和对比度，但不改变增益。按下 B 以增强亮度或 Shift+B 以降低。按下 C 以增强对比度或 Shift+C 以降低。按下 Shift+V 重置亮度和对比度。</li>
	<li>要调整SED放大倍数，请按下 M （200 µm）， , (400 µm) . （800 µm），或 / （最大）键</li>
	<li>要移动视野（FOV），请按下键盘 箭头 按键。通过按下保存位置 W. 保持 移位 按住箭头键的同时按下该键可移动更远距离。按住 替代 （Windows）或 Opt （Mac）按住箭头键的同时按下 键可移动更短的距离。注意，任何给定图块中只有 R1C1 可以移动。</li>
	<li>要打开或关闭视野（FOV），请按 T要更改视场大小，请按下 2 （200 µm）， 4 （400 µm），或 8 （800 µm）。光栅尺寸将按比例缩放，以保持成像分辨率不变。</li>
	<li>要保存 SED 图像及叠加十字准线的图像文件，请按 S 键。要将调整的草稿保存为 .txt 文件，请按 X.</li>
	<li>当满意时，按下 D 前往下一个视野区域，或 A 返回上一个视野。重复步骤 7.6&#160;至 7.11&#160;对于所有视野。</li>
	<li>完成所有视野（FOVs）后，按下 X 或 逃逸调整将保存到 .txt 文件中，并复制到剪贴板。</li>
	<li>返回 TSAI 网络界面。将 .txt 文件拖放到 TSAI 网络界面中，或将其调整内容粘贴至视野导航/调整菜单的文本框内。</li>
	<li>点击 调节 对 Tiles 中的图块应用调整&#160;柱</li>
</ol>
8. 生成和导入 JSON 文件
<ol>
	<li>在“Tiles”&#160;列下方的“Output”部分，查看图块列表及预计运行时间（补充图 7A）。</li>
	<li>在“Group”部分，选择视野（FOV）分组选项（补充图 7B）。分组不会影响按顺序排列的 .json 文件。
	<ol>
		<li>对于随机化的 .json 文件，按图块对 FOV 进行分组将使同一图块内的所有 FOV 保持连续，即使图块本身为随机顺序。</li>
		<li>对于随机化的 .json 文件，不进行 FOV 分组将使来自不同图块的 FOV 随机混合排列。</li>
		<li>如果已设定运行中自动对焦，则 FOV 将自动按最邻近的自动对焦位点进行分组。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在“split”部分，选择将数据拆分为多个 .json 文件的选项（补充图 7C）。
	<ol>
		<li>不拆分将所有 FOV 保留在单个 .json 文件中。</li>
		<li>按每 # 个 FOV 拆分会将 FOV 分布到多个 .json 文件中，每个文件包含指定数量的 FOV。</li>
		<li>按每 # 小时 # 分钟拆分会将 FOV 分布到多个 .json 文件中，每个文件的预计运行时间大致为指定时长。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过打开“Rearrange”菜单查看并重新排列 .json 文件中 FOV 的顺序（补充图 7D）。要移动某个 FOV，请点击并将其拖动至目标位置，其余 FOV 将动态重新排列以适应拖动操作。</li>
	<li>要保存 .json 文件，请点击“Rearrange”菜单下方的 FOVs 按钮。顺序 .json 文件将按图块、行、列的顺序排列 FOV（补充图 7E）。随机 .json 文件则根据步骤 8.2 中选定的分组方式对 FOV 进行随机化（补充图 7F）。</li>
	<li>要保存包含 FOV 及应用显示选项（图块标签、亮度、对比度等）的组织图像，请点击 Save Tiled Image（补充图 7G）。此图像常用于记录保存及与合作者共享。</li>
	<li>返回 MIBI 用户控制界面，点击 Import FOVs 并选择生成的 .json 文件。根据需要调整焦距、像散和电流，然后点击 Start Run。</li>
</ol>

Accelerating MIBI Run Setup Using TSAI for Tissue Microarray Imaging

<ol><li>Liu, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+Ion+Beam+Imaging%3A+Insights+into+Pathobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">Multiplexed Ion Beam Imaging: Insights into Pathobiology.</a> Annu Rev Pathol. 17, 403-423 (2022).</li>
<li>Keren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MIBI-TOF%3A+A+multiplexed+imaging+platform+relates+cellular+phenotypes+and+tissue+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">MIBI-TOF: A multiplexed imaging platform relates cellular phenotypes and tissue structure.</a> Sci Adv. 5 (10), 1-16 (2019).</li>
<li>Elhanani, O., Keren, L., Angelo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Dimensional+Tissue+Profiling+by+Multiplexed+Ion+Beam+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">High-Dimensional Tissue Profiling by Multiplexed Ion Beam Imaging.</a> Methods Mol Biol. 2386, 147-156 (2022).</li>
<li>Greenwald, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+segmentation+of+tissue+images+with+human-level+performance+using+large-scale+data+annotation+and+deep+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Whole-cell segmentation of tissue images with human-level performance using large-scale data annotation and deep learning.</a> Nat Biotechnol. 40 (4), 555-565 (2022).</li>
<li>Risom, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transition+to+invasive+breast+cancer+is+associated+with+progressive+changes+in+the+structure+and+composition+of+tumor+stroma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transition to invasive breast cancer is associated with progressive changes in the structure and composition of tumor stroma.</a> Cell. 185 (2), 299.e18-310.e18 (2022).</li>
<li>McCaffrey, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunoregulatory+landscape+of+human+tuberculosis+granulomas%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The immunoregulatory landscape of human tuberculosis granulomas.</a> Nat. Immunol. 23 (2), 318-329 (2022).</li>
<li>Greenbaum, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spatially+resolved+timeline+of+the+human+maternal%E2%80%93fetal+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A spatially resolved timeline of the human maternal–fetal interface.</a> Nature. 619 (7970), 595-605 (2023).</li>
<li>Hartmann, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+metabolic+profiling+of+human+cytotoxic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Single-cell metabolic profiling of human cytotoxic T cells.</a> Nat Biotechnol. 39 (2), 186-197 (2021).</li>
<li>Patwa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+imaging+analysis+of+the+tumor-immune+microenvironment+reveals+predictors+of+outcome+in+triple-negative+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiplexed imaging analysis of the tumor-immune microenvironment reveals predictors of outcome in triple-negative breast cancer.</a> Commun Biol. 4 (1), 852(2021).</li>
<li>Keren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Structured+Tumor-Immune+Microenvironment+in+Triple+Negative+Breast+Cancer+Revealed+by+Multiplexed+Ion+Beam+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Structured Tumor-Immune Microenvironment in Triple Negative Breast Cancer Revealed by Multiplexed Ion Beam Imaging.</a> Cell. 174 (6), 1373.e19-1387.e19 (2018).</li>
<li>Vijayaragavan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+spatial+proteomic+imaging+for+human+neuropathology%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol.+Commun%22%5BJournal%5D)">Single-cell spatial proteomic imaging for human neuropathology.</a> Acta Neuropathol. Commun. 10 (1), 158(2022).</li>
<li>GitHub - angelolab/toffy: Scripts for interacting with and generating data from the commercial MIBIScope. (n.d.). , https://github.com/angelolab/toffy (2023).</li>
<li>Web Hypertext Application Technology Working Group (WHATWG). (n.d.). HTML Living Standard. , from https://html.spec.whatwg.org/multipage (2023).</li>
<li>ECMA International. (n.d.). ECMAScript 2022 Language Specification. , https://www.ecma-international.org/publications-and-standards/standards/ecma-262 (2023).</li>
<li>World Wide Web Consortium (W3C). (n.d.). Cascading Style Sheets (CSS). , from https://www.w3.org/Style/CSS/Overview.en.html (2023).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

多重离子束成像（MIBI）是一种强大的技术，可用于解析详细的细胞表型和组织形态结构5,6,7,8,9,10,11。目前针对MIBI的计算工作主要集中于成像后的数据处理，而在提升仪器软件在大组织微阵列（TMA）和拼接组织区域等常见应用中的可用性方面，进展甚少。随着MIBI实验在规模和复杂性上的不断增加，制造商提供的仪器界面及第三方工具在执行这些任务时已变得愈发笨拙12。因此，开发了拼接/SED/阵列界面（TSAI），使用户能够通过直观、可交互的图形界面快速定位大量视野（FOV）。
<p class="jove_content...

多重离子束成像（Multiplexed ion beam imaging, MIBI）是一种可在组织学组织切片上以高达250 nm分辨率同时成像40种以上蛋白质的技术1,2,3。在使用同位素纯的金属元素标记抗体对组织切片进行染色后，MIBI仪器通过二次离子质谱法同时定量组织上各个位点的所有同位素——从而反映40种以上抗原的表达水平。通过对数百万个位点组成的网格进行扫描，所获得的40重以上的蛋白表达图像能够在保留空间信息的前提下，实现细胞边界的界定和特定细胞类型的识别1,2,3,4。该技术已在约20个研究机构被数百名研究人员用于研究数十种组织类型的细胞组成、代谢特征和/或组织结构，相关研究涵盖肿瘤免疫应答、感染因子引发的组织炎症、痴呆的神经病理学以及妊娠期间的免疫耐受等课题5,6,7,8,9,10,11。
MIBI 仪器操作中的一个关键瓶颈是设置视野（FOV）——即用于成像的 200&#160;x 200 µm2 至 800&#160;x 800 µm2 的组织区域。MIBI 每次仅成像一个 FOV，最大为 800&#160;x 800 µm2，因此对更大区域成像需要将多个 FOV 拼接在一起。对组织微阵列（例如 图 1A 中的八个圆形组织）进行成像时，需放置多个相互间隔的 FOV。为设置 FOV，制造商提供的界面包含两项功能：1）载玻片的光学相机图像，其上带有十字准线，大致对应指定的成像坐标（图 1A）；2）二次电子探测器（SED）图像，可显示该坐标处的精确区域，据称定位精度在 0.1 µm 以内（图 1B）。首先，用户通过光学图像粗略定位单个 FOV。由于图像分辨率仅为每像素约 60 µm，若定位偏差达两个像素（2 像素&#160;x 60 µm/像素），标准的 400 µm FOV 将偏差 30%。因此，用户必须使用 SED 图像进行精细调整——这一过程繁琐，包含十余个步骤，涉及多个弹出窗口、在文本框中输入坐标、使用方向控制按钮缓慢移动 SED，甚至经常需要将坐标手写记录在纸上（补充图 1）。对于包含 100 个以上组织核心的组织微阵列（TMA），该过程必须重复多次。一些第三方工具可辅助初始粗略定位12，但这些工具仍需要一定的编程知识，且最终定位仍需通过上述十余步流程完成。此外，对相邻 FOV 构成的网格进行定位也极为麻烦，而这些 FOV 后续需拼接成一幅平铺的全景图像。
因此，开发了切片/SED/阵列界面（TSAI），旨在通过直观、可交互的图形界面，使用户能够快速定位大量视野（FOV）。TSAI 包含两个主要组成部分：1）基于网页的图形用户界面（web UI），用于快速放置TMA点和组织切片区域；2）与MIBI用户控制界面的集成，用于生成拼接的SED图像并调整FOV位置。如果仅使用光学图像，可先对多个FOV进行粗略定位，然后利用FOV导航/调整工具快速修正（图2，TSAI，左分支）。然而，若执行SED拼接，则可在拼接后的SED图像上精确地定位FOV，无需在SED模式下进一步调整（图2，TSAI，右分支）。这些工具对当前数百名MIBI用户具有普遍意义，即使初学者也能轻松完成拼接和TMA定位操作，并将原本复杂的MIBI运行设置时间从数小时缩短至几十分钟。

<table><tbody><tr><td>MIBI 计算机</td><td>Ionpath</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MIBIcontrol（软件）</td><td>Ionpath</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MIBIscope</td><td>Ionpath</td><td></td><td>多重离子束成像（MIBI）显微镜</td></tr><tr><td>MIBIslide</td><td>Ionpath</td><td>567001</td><td>MIBI 用导电载玻片</td></tr><tr><td>Tile/SED/Array Interface (TSAI)（软件）</td><td></td><td>https://github.com/ag-tsai/mibi_tsai/</td><td></td></tr></tbody></table>

使用tile/sed/array界面在多重离子束成像显微镜上快速建立组织微阵列与拼接区域成像

Rapid Setup of Tissue Microarray and Tiled Area Imaging on the Multiplexed Ion Beam Imaging Microscope Using the Tile/SED/Array Interface

多重离子束成像（Multiplexed ion beam imaging, MIBI）是一种基于质谱技术的下一代显微成像方法&#160;可生成组织样本中40余种蛋白质表达的多重图像，实现对细胞表型及组织架构的精细解析。当前一个关键瓶颈在于&#160;当用户选择组织上的物理位置进行成像时，操作即开始。随着MIBI实验在规模和复杂性上的增加，制造商提供的界面及第三方工具在处理大型组织微阵列和拼接组织区域成像时变得愈发笨拙。因此，开发了一种基于网页的、交互式的、所见即所得（WYSIWYG）图形界面层——拼接/SED/阵列界面（TSAI），使用户能够通过熟悉的直观鼠标操作（如拖放、点击拖动和多边形绘制）来设定成像位置。该界面依据现代网页浏览器中已内置的网页标准编写，无需安装任何外部程序、插件或编译器。对于目前全球数百名MIBI用户而言，该界面显著简化并加速了大规模、复杂MIBI实验的设置过程。

TSAI 提供了两种设置视野（FOV）的方法（图2）。一种仅使用光学图像（图2，TSAI，左分支），类似于其他现有方法；另一种方法——生成拼接的 SED 图像——是 TSAI 独有的（图2，TSAI，右分支）。TSAI 可将 FOV 精确地绘制到该图像上，从而无需在制造商提供的界面 SED 模式下花费数小时手动调整 FOV 位置。然而，必须正确设置 SED 拼接的校正系数，否则可能导致 FOV 位置不准确。
可通过检查大面积组织切片（至少 1.5 cm 大小）的拼接 SED 扫描图像来评估 SED 拼接系数（步骤 4.1 至 4.11）。正确设置下的预期结果是相邻图块之间的组织错位极小的图像（图 3A-B）。如果 SED 成像方块相对于载物台电机存在角度偏差，或存在步进电机校准错误（例如，指令移动 400 µm，...

多重离子束成像（MIBI）常用于成像组织微阵列以及拼接的连续组织区域，但目前用于设置此类实验的软件操作繁琐。拼接/SED/阵列界面是一种直观、交互式的图形化工具，旨在显著简化并加速MIBI实验的运行设置。

使用Tile/SED/Array界面在多重离子束成像显微镜上快速建立组织微阵列与拼接区域成像

多重离子束成像（Multiplexed ion beam imaging, MIBI）是一种基于质谱技术的下一代显微成像方法，可生成包含40种以上蛋白质的多重图像……

多重离子束成像（Multiplexed ion beam imaging，简称 MIBI）是一种可同时对数十种蛋白质进行成像，以检测组织学组织中蛋白质表达水平的技术。利用 MIBI，研究人员能够在组织原位环境中识别、定位并表征细胞。MIBI 仪器操作中的一个关键瓶颈是为成像设置视野（fields of view，简称 FOVs）。视野（FOV）是载玻片上200 × 200微米至800 × 800微米的区域，用户可将其定位以覆盖感兴趣的组织区域。使用制造商提供的界面来定位大面积连续组织区域或大型组织微阵列的视野时，操作十分不便。我们开发了拼接式SED阵列界面，以帮助用户通过直观的交互式图形界面快速定位大量视野。首先，在网页浏览器中打开 TSAI 网页用户界面。然后打开光学共定位菜单，点击“复制自动共定位代码到剪贴板”。在网页浏览器中打开 MIBI 用户控制界面，按下 Ctrl+Shift+J 以打开浏览器控制台。将代码粘贴到控制台中并按 Enter 键。单击控制台中生成的链接，将共配准结果加载到 TSAI 网络用户界面中，并将其保存为 cookie。将光学图像的 png 和 json 文件拖放到 TSAI 网络用户界面中。打开 SED Tiler 菜单，点击顶行中的一个文本框。在光学图像上点击并拖动，选择 SED 扫描的左上角。按下 D 键，然后在光学图像上点击并拖动，选择 SED 扫描的右下角。在 SED Tiler 菜单中，单击“复制 SED 扫描和偏移校正代码到剪贴板”。接着，在网页浏览器中打开 MIBI 用户控制界面。将代码粘贴到控制台中并按 Enter 键。将MIBI置于QC 300设置下的SED模式，并移动至不进行成像的区域。然后调节增益、聚焦和消像散。按下Shift+T以启动拼接SED扫描。完成后，系统将自动保存一幅拼接式 SED 图像的新 png 文件。接下来，检查拼接式 SED 扫描图像是否存在较大的错位。当拼接式 SED 图像质量满足要求时，按 Esc 键并返回 TSAI 网络用户界面。将分块的 SED png 文件拖放到 TSAI 网络用户界面中。点击 SED 选项卡并调整缩放比例。使用 SED 图像上方的滑块选项菜单来调节线条粗细以及光标的大小、亮度和对比度。一张拼接良好的SED图像应显示SED图块之间极小的错位。相反，次优设置会导致SED图块之间出现较大错位。为组织微阵列（TMA点阵）网格设置视野（FOVs），请打开一张拼接的SED图像。在图块列的相关图块中，调整列和行。然后在地图中勾选或取消勾选相应的复选框。在相关图块中，单击 TMA 以打开 TMA 选项菜单。设置组织芯片（TMA）点阵的行数和列数。如有需要，添加命名前缀，并编辑起始行和列的编号。在载玻片图像上，点击组织芯片（TMA）的四个角。然后单击并拖动圆圈标记的角点，调整十字准线的位置，使其与TMA点阵的最佳匹配。在TMA选项菜单中，单击“构建TMA”。要检查图块的定位情况，请将鼠标悬停在图块列中的每个图块上。单击“移动”以调整图块的位置。然后在载玻片图像上单击并拖动。为设置覆盖组织连续区域的视野，请首先在图块所在列的相关图块中调整视野参数。在相关图块中，单击“多边形”以覆盖连续的组织区域。然后单击载玻片图像以设置待铺满区域的顶点和角点。双击以闭合多边形，并用视野（FOVs）覆盖该区域。滚动到图块列的底部，点击新多边形图块中的三条横线按钮以查看图块地图。点击橡皮擦以关闭多个视野区域。然后在载玻片图像中的拼接视野区域上点击并拖动。要启用多个视野，请点击点击器。然后在切片图像中被平铺图覆盖的空白区域上点击并拖动。如需在上方插入行，请点击上箭头按钮。单击左侧箭头按钮可在左侧插入列。如需调整瓦片位置，请单击“移动”，然后在幻灯片图像上单击并拖动。

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使用 Tile/SED/Array 接口在多路复用离子束成像显微镜上快速构建组织微阵列和平铺面积成像 

本研究优化并实施了一种六重标志物多重免疫荧光检测方案，采用自动化染色仪以获得更一致的结果并缩短操作时间。该方法可被任何实验室直接应用于免疫肿瘤学研究。...

用于福尔马林固定癌组织样本免疫肿瘤学研究的自动化多重免疫荧光检测 panel

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多重免疫荧光结合空间图像分析用于肿瘤微环境的临床与生物学评估

本方案展示了在显微镜引导下分离小鼠肺静脉并进行免疫荧光染色的方法。我们制备包含左心房、肺静脉及相应肺组织的样本，并对心肌肌钙蛋白T和连接蛋白43进行染色。...

小鼠肺静脉心肌袖的显微解剖与免疫荧光染色

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采用迭代漂白扩展多重性方法对荷瘤组织进行三维成像

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本方案详细介绍了在福尔马林固定石蜡包埋组织切片中进行多重 mRNA...

双模态分子图谱：整合多重mRNA检测与蛋白质成像质谱流式技术

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利用光谱共聚焦显微镜进行高重成像以最小化非特异性组织自发荧光

了解如何使用平铺SED阵列界面在多路复用离子束成像显微镜上快速构建组织微阵列和平铺面积成像。该方法通过直观的图形界面优化视野定位，提高成像效率并减少用户操作错误。

使用Tile/SED/Array界面在多重离子束成像显微镜上快速建立组织微阵列与拼接区域成像

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