Name: 3D生物打印光可调水凝胶研究成纤维细胞活化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T12:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: 了解利用光可调水凝胶进行三维生物打印的技术，用于研究细胞外基质硬化对肺成纤维细胞活化的影响。该方法为慢性肺部疾病机制研究提供了新平台。

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作者谨向 Adam Feinberg 博士（卡内基梅隆大学）以及举办 3D 生物打印开源研讨会的各方致以谢意。正是这些个人和机构使得作者能够学习 FRESH 生物打印技术，并搭建本研究所用的 3D 生物打印机。此外，作者谨向 Biorender.com 致谢，本文中的示意图由该平台绘制。本研究得到了多个团体或资助机构的支持，包括 Rose 社区基金会（DDH 和 CMM）、科罗拉多肺血管疾病研究奖（DDH 和 CMM）、美国国家科学基金会 Award 1941401 项目（CMM）、美国陆军部 Award W81XWH-20-1-0037 项目（CMM）、美国国立卫生研究院国家癌症研究所 Award R21 CA252172 项目（CMM）、科罗拉多大学安舒茨医学校区 Ludeman 女性健康研究中心（DDH 和 CMM），以及美国国立卫生研究院国家心肺血液研究所 Award R01 HL080396（CMM）、R01 HL153096（CMM）、F31 HL151122（DDH）和 T32 HL072738（DDH 和 AT）项目。

Phototunable Bioprinted Hydrogels to Probe Cellular Responses to ECM Stiffening

<ol><li>Ahrens, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+cellular+alignment+in+engineered+cardiac+tissue+via+bioprinting+anisotropic+organ+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Programming cellular alignment in engineered cardiac tissue via bioprinting anisotropic organ building blocks.</a> Advanced Materials. 34 (26), e2200217(2022).</li>
<li>Lin, N. Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+reabsorption+in+3D+vascularized+proximal+tubule+models%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Renal reabsorption in 3D vascularized proximal tubule models.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (12), 5399-5404 (2019).</li>
<li>Grigoryan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivascular+networks+and+functional+intravascular+topologies+within+biocompatible+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multivascular networks and functional intravascular topologies within biocompatible hydrogels.</a> Science. 364 (6439), 458-464 (2019).</li>
<li>Kang, Y., Datta, P., Shanmughapriya, S., Ozbolat, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+bioprinting+of+tumor+models+for+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">3D bioprinting of tumor models for cancer research.</a> ACS Applied Biomaterials. 3 (9), 5552-5573 (2020).</li>
<li>Davis-Hall, D., Thomas, E., Pena, B., Magin, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D-bioprinted%2C+phototunable+hydrogel+models+for+studying+adventitial+fibroblast+activation+in+pulmonary+arterial+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">3D-bioprinted, phototunable hydrogel models for studying adventitial fibroblast activation in pulmonary arterial hypertension.</a> Biofabrication. 15 (1), (2022).</li>
<li>Mirdamadi, E., Tashman, J. W., Shiwarski, D. J., Palchesko, R. N., Feinberg, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRESH+3D+bioprinting+of+a+full-size+model+of+the+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">FRESH 3D bioprinting of a full-size model of the human heart.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 6 (11), 6453-6459 (2020).</li>
<li>Shiwarski, D. J., Hudson, A. R., Tashman, J. W., Feinberg, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+FRESH+3D+printing+as+a+platform+for+advanced+tissue+biofabrication%5BTitle%5D)+AND+%22APL+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Emergence of FRESH 3D printing as a platform for advanced tissue biofabrication.</a> APL Bioengineering. 5 (1), 010904(2021).</li>
<li>Petrou, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clickable+decellularized+extracellular+matrix+as+a+new+tool+for+building+hybrid+hydrogels+to+model+chronic+fibrotic+diseases+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Clickable decellularized extracellular matrix as a new tool for building hybrid hydrogels to model chronic fibrotic diseases in vitro.</a> Journal of Materials Chemistry B. 8 (31), 6814-6826 (2020).</li>
<li>Hewawasam, R. S., Blomberg, R., Serbedzija, P., Magin, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+modification+of+human+decellularized+extracellular+matrix+for+incorporation+into+phototunable+hybrid+hydrogel+models+of+tissue+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Chemical modification of human decellularized extracellular matrix for incorporation into phototunable hybrid hydrogel models of tissue fibrosis.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 15 (12), 15071-15083 (2023).</li>
<li>Saleh, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+hybrid+hydrogels+comprised+healthy+or+diseased+decellularized+extracellular+matrix+to+study+pulmonary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Engineering hybrid hydrogels comprised healthy or diseased decellularized extracellular matrix to study pulmonary fibrosis.</a> Cellular and Molecular Bioengineering. 15 (5), 505-519 (2022).</li>
<li>Guvendiren, M., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stiffening+hydrogels+to+probe+short-+and+long-term+cellular+responses+to+dynamic+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Stiffening hydrogels to probe short- and long-term cellular responses to dynamic mechanics.</a> Nature Communications. 3, 792(2012).</li>
<li>Rosales, A. M., Vega, S. L., DelRio, F. W., Burdick, J. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+with+reversible+mechanics+to+probe+dynamic+cell+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition+English%22%5BJournal%5D)">Hydrogels with reversible mechanics to probe dynamic cell microenvironments.</a> Angewandte Chemie International Edition English. 56 (40), 12132-12136 (2017).</li>
<li>Wynn, T. A., Ramalingam, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+fibrosis%3A+therapeutic+translation+for+fibrotic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease.</a> Nature Medicine. 18 (7), 1028-1040 (2012).</li>
<li>Huertas, A., Tu, L., Humbert, M., Guignabert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+inflammation+within+the+vascular+wall+in+pulmonary+arterial+hypertension%3A+more+than+a+spectator%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Chronic inflammation within the vascular wall in pulmonary arterial hypertension: more than a spectator.</a> Cardiovascular Research. 116 (5), 885-893 (2020).</li>
<li>Kendall, R. T., Feghali-Bostwick, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+in+fibrosis%3A+novel+roles+and+mediators%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts in fibrosis: novel roles and mediators.</a> Frontiers in Pharmacology. 5, 123(2014).</li>
<li>Parker, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrotic+extracellular+matrix+activates+a+profibrotic+positive+feedback+loop%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Fibrotic extracellular matrix activates a profibrotic positive feedback loop.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (4), 1622-1635 (2014).</li>
<li>Habiel, D. M., Hogaboam, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+fibroblast+proliferation+and+survival+in+idiopathic+pulmonary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in fibroblast proliferation and survival in idiopathic pulmonary fibrosis.</a> Frontiers in Pharmacology. 5, 2(2014).</li>
<li>Hu, C. J., Zhang, H., Laux, A., Pullamsetti, S. S., Stenmark, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+contributing+to+persistently+activated+cell+phenotypes+in+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms contributing to persistently activated cell phenotypes in pulmonary hypertension.</a> The Journal of Physiology. 597 (4), 1103-1119 (2019).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+fibroblasts+with+a+proinflammatory+epigenetically+altered+phenotype+in+severe+hypoxic+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Emergence of fibroblasts with a proinflammatory epigenetically altered phenotype in severe hypoxic pulmonary hypertension.</a> The Journal of Immunology. 187 (5), 2711-2722 (2011).</li>
<li>Hinton, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+printing+of+complex+biological+structures+by+freeform-reversible+embedding+of+suspended+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform-reversible embedding of suspended hydrogels.</a> Science Advances. 1 (9), e1500758(2015).</li>
<li>Brown, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+photocrosslinking+of+click+hydrogels+to+probe+myoblast+mechanotransduction+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Secondary photocrosslinking of click hydrogels to probe myoblast mechanotransduction in three dimensions.</a> Journal of the American Chemical Society. 140 (37), 11585-11588 (2018).</li>
<li>Ondeck, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamically+stiffened+matrix+promotes+malignant+transformation+of+mammary+epithelial+cells+via+collective+mechanical+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dynamically stiffened matrix promotes malignant transformation of mammary epithelial cells via collective mechanical signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3502-3507 (2019).</li>
<li>Caliari, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stiffening+hydrogels+for+investigating+the+dynamics+of+hepatic+stellate+cell+mechanotransduction+during+myofibroblast+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Stiffening hydrogels for investigating the dynamics of hepatic stellate cell mechanotransduction during myofibroblast activation.</a> Scientific Reports. 6, 21387(2016).</li>
<li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+amplification+of+fibrosis+through+matrix+stiffening+and+COX-2+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Feedback amplification of fibrosis through matrix stiffening and COX-2 suppression.</a> Journal of Cell Biology. 190 (4), 693-706 (2010).</li>
<li>Tschumperlin, D. J., Ligresti, G., Hilscher, M. B., Shah, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensing+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mechanosensing and fibrosis.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (1), 74-84 (2018).</li>
<li>Chelladurai, P., Seeger, W., Pullamsetti, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinases+and+their+inhibitors+in+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinases and their inhibitors in pulmonary hypertension.</a> European Respiratory Journal. 40 (3), 766-782 (2012).</li>
<li>Caracena, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+epithelial+cells+and+microenvironmental+stiffness+synergistically+drive+fibroblast+activation+in+three-dimensional+hydrogel+lung+models%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials+Science%22%5BJournal%5D)">Alveolar epithelial cells and microenvironmental stiffness synergistically drive fibroblast activation in three-dimensional hydrogel lung models.</a> Biomaterials Science. 10 (24), 7133-7148 (2022).</li>
<li>Ruskowitz, E. R., DeForest, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome-wide+analysis+of+cellular+response+to+ultraviolet+light+for+biomaterial+synthesis+and+modification%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Proteome-wide analysis of cellular response to ultraviolet light for biomaterial synthesis and modification.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (5), 2111-2116 (2019).</li>
<li>Kruse, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+pH+on+cell+viability%2C+cell+migration%2C+cell+proliferation%2C+wound+closure%2C+and+wound+reepithelialization%3A+In+vitro+and+in+vivo+study%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">The effect of pH on cell viability, cell migration, cell proliferation, wound closure, and wound reepithelialization: In vitro and in vivo study.</a> Wound Repair and Regeneration. 25 (2), 260-269 (2017).</li>
<li>Filippi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusable+biohybrid+designs+for+bioprinted+skeletal+muscle+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Perfusable biohybrid designs for bioprinted skeletal muscle tissue.</a> Advanced Healthcare Materials. , e1500758(2023).</li>
<li>Matthiesen, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+3D+culture+and+bioprinting+using+peptide-functionalized+hyaluronan+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Science+and+Technology+of+Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Astrocyte 3D culture and bioprinting using peptide-functionalized hyaluronan hydrogels.</a> Science and Technology of Advanced Materials. 24 (1), 2165871(2023).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprinting+a+skin+patch+with+dual-crosslinked+gelatin+%28GelMA%29+and+silk+fibroin+%28SilMA%29%3A+An+approach+to+accelerating+cutaneous+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Today+Bio%22%5BJournal%5D)">Bioprinting a skin patch with dual-crosslinked gelatin (GelMA) and silk fibroin (SilMA): An approach to accelerating cutaneous wound healing.</a> Materials Today Bio. 18, 100550(2023).</li>
<li>Bliley, J. M., Shiwarski, D. J., Feinberg, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D-bioprinted+human+tissue+and+the+path+toward+clinical+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">3D-bioprinted human tissue and the path toward clinical translation.</a> Science Translational Medicine. 14 (666), eabo7047(2022).</li>
</ol>

通过控制光照条件引发的双阶段聚合反应可实现对生物材料刚度的时空调控。已有多个研究利用该技术在不同平台上评估细胞-基质相互作用。5,8,9,10,11,21,22,23更具体而言，可采用光掩模或双光子激发方法对3D生物打印结构的特定区域进行刚性化，以研究细胞在受限区域或界面处对局部动态刚性变化的响应，如我们先前发表的研究所述。5,8选择有意义的时间点以评估细胞反应至关重要。在此，允许成纤维细胞在...

3D 生物打印是一项变革性技术，使研究人员能够在三维空间内精确地沉积细胞和生物材料，重建生物组织复杂的层级结构。在过去十年中，3D 生物打印技术的进步已成功构建出跳动的人类心肌组织1、功能性肾组织模型2、肺部气体交换模型3以及用于癌症研究的肿瘤模型4。嵌入式 3D 生物打印技术（如悬浮水凝胶自由成型可逆嵌入，FRESH 生物打印）的发明，使得在三维空间中复制复杂的软组织结构（例如肺部血管5甚至人类心脏6）成为可能。FRESH 3D 生物打印通过将软质、低粘度的生物墨水挤出至剪切稀化支撑浴中，实现逐层打印。该支撑浴由紧密堆积的明胶微颗粒等材料构成，具有宾汉塑性体特性，可在打印后维持生物墨水预期的形状和结构。当打印结构固化后，可通过升温至 37 °C 溶解去除支撑浴7。
最近的一篇综述文章总结了使用FRESH技术在不同出版物中进行3D生物打印的各种材料。这些天然来源的材料包括从I型胶原到甲基丙烯酰化透明质酸，并代表了多种不同的凝胶化机制7。大多数采用该3D生物打印技术开展的研究使用的是静态生物材料，其不会对外部刺激产生响应。动态光可调水凝胶生物材料已被本实验室及其他研究团队8,9,10,11,12用于模拟多种纤维化疾病。与静态生物材料不同，光可调生物墨水允许先构建一个弹性模量较低的软化模型，随后通过硬化来研究细胞对微环境刚度增加的响应。
纤维化疾病的特点是细胞外基质的产生增加，可能导致组织瘢痕化和僵硬13。组织僵硬可引发进一步损伤并破坏受累组织，导致永久性器官损害甚至死亡；纤维化疾病占全球死亡人数的三分之一。在此类疾病状态下，成纤维细胞产生过量且异常的细胞外基质14,15。&#160;成纤维细胞增殖增加以及细胞外基质沉积加剧了组织僵硬，并激活促纤维化的正反馈环路16,17,18,19。&#160;研究成纤维细胞的活化对于理解纤维化疾病至关重要。本文以人类肺动脉高压（PAH）为例，介绍一种重要的纤维化疾病，其中利用3D生物打印技术模拟血管的三维几何结构，并引入光可调水凝胶的动态刚化能力具有重要意义。肺动脉高压是一种主肺动脉压力超过正常水平的病症，会对心脏造成负担，增加人肺动脉外膜成纤维细胞（HPAAF）的活化，并使血管组织僵硬16,17,18,19。一种光可调聚乙二醇-α-甲基丙烯酸酯（PEGαMA）生物墨水配方可在构建体中实现时间可控的刚化，有助于模拟健康组织&#160;以及疾病进展过程5,8,9,10。利用这一独特特性，可&#160;在三维环境中量化HPAAF对微环境刚化响应的活化与增殖情况，可能为该疾病相关的细胞机制提供有价值的见解。本文所述方案将使研究人员能够构建三维模型，以重现疾病进展或组织修复过程中细胞外微环境的变化，并研究成纤维细胞的活化。

<table><tbody><tr><td>AccuMax 辐射计/光度计套装</td><td>Spectronics Corporation</td><td>XPR-3000</td><td>用于测量光强度，适用于光致硬化</td></tr><tr><td>乙酸&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2401-500</td><td>用于 PEGaMA 合成过程</td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Fisher Scientific</td><td>A184</td><td>与冷冻切片一起使用</td></tr><tr><td>ActinGreen 488 ReadyProbes</td><td>Fisher Scientific</td><td>R37110</td><td>用于染色</td></tr><tr><td>铝箔</td><td>Reynolds</td><td>F28028</td><td></td></tr><tr><td>无水四氢呋喃（THF）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>401757-1L</td><td>用于 PEGaMA 合成过程</td></tr><tr><td>压缩氩气</td><td>Airgas</td><td>AR R300</td><td>用于 PEGaMA 合成过程</td></tr><tr><td>8 臂聚乙二醇-羟基（PEG-OH）</td><td>JenKem Technology</td><td>8ARM-PEG-10K</td><td>用于 PEGaMA 合成过程</td></tr><tr><td>365 nm 带通滤光片</td><td>Edmund Optics</td><td>65-191</td><td>用于光致硬化</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9700-100</td><td>用于染色过程</td></tr><tr><td>布氏漏斗</td><td>Quark Glass</td><td>QFN-8-14</td><td>用于 PEGaMA 合成过程</td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Invitrogen</td><td>65-0853-39</td><td>用于染色过程</td></tr><tr><td>Celite 545（助滤剂）</td><td>EMD Millipore</td><td>CX0574-1</td><td>用于 PEGaMA 合成过程</td></tr><tr><td>带电荷显微镜载玻片</td><td>Globe Scientific</td><td>1358W</td><td></td></tr><tr><td>氘代氯仿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>151823-10X0.75ML</td><td>用于表征 PEGaMA</td></tr><tr><td>Click-iT Plus EdU 细胞增殖检测试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>C10637</td><td>用于染色</td></tr><tr><td>50 mL 锥形管</td><td>CELLTREAT</td><td>667050B</td><td></td></tr><tr><td>低温安全防护套装</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-25000-85</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Leica</td><td>CM 1850-3-1</td><td></td></tr><tr><td>透析管</td><td>Repligen</td><td>132105</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;rsquo;,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-1MG</td><td>用于染色</td></tr><tr><td>乙醚</td><td>Fisher Scientific</td><td>E1384</td><td>用于 PEGaMA 合成过程</td></tr><tr><td>1,4-二硫苏糖醇（DTT）&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10197777001</td><td>生物墨水组分</td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Cytiva</td><td>SH30271.FS</td><td></td></tr><tr><td>滤纸</td><td>Whatman</td><td>1001-090</td><td>用于 PEGaMA 合成过程</td></tr><tr><td>Freezone 2.5L 冷冻干燥系统</td><td>Labconco</td><td>LA-2.5LR</td><td>冻干机</td></tr><tr><td>Fusion 360</td><td>Autodesk</td><td>N/A</td><td>软件下载</td></tr><tr><td>2.5 mL 气密注射器</td><td>Hamilton</td><td>81420</td><td>用于生物打印</td></tr><tr><td>15 号 1.5&quot; IT 系列喷嘴</td><td>Jensen Global</td><td>JG15-1.5X</td><td>用于生物打印</td></tr><tr><td>30 号 0.5&quot; HP 系列喷嘴</td><td>Jensen Global</td><td>JG30-0.5HPX</td><td>用于生物打印</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 Alexa Fluor 555 抗体</td><td>Fisher Scientific</td><td>A21422</td><td>用于染色</td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>C2H5NO2</td><td>用于染色过程</td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Fisher Scientific</td><td>1461</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td>用于染色过程</td></tr><tr><td>人肺动脉外膜成纤维细胞（HPAAFs）</td><td>AcceGen</td><td>ABC-TC3773&amp;nbsp;</td><td>来源于一名 2 岁男性患者</td></tr><tr><td>盐酸（HCl）</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-500</td><td>用于调节溶液 pH 值</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>美国国立卫生研究院（NIH）</td><td>N/A</td><td>免费软件下载</td></tr><tr><td>ImmEdge&amp;reg; 笔</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td>用于染色过程</td></tr><tr><td>培养箱</td><td>VWR</td><td>VWR51014991</td><td></td></tr><tr><td>LifeSupport 明胶微粒悬浮液（明胶悬浮液）</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5244-10GM</td><td>用于生物打印</td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>Olympus</td><td>CKX53</td><td>倒置光学显微镜</td></tr><tr><td>二苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次磷酸锂（LAP）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>900889-5G</td><td>用于光致硬化的光引发剂</td></tr><tr><td>液氮</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>LulzBot Mini 2&amp;nbsp;</td><td>LulzBot</td><td>N/A</td><td>经改造的生物打印机</td></tr><tr><td>甲基丙烯酰氧乙基硫代氨基甲酰罗丹明 B&amp;nbsp;</td><td>Polysciences Inc.</td><td>669775-30-8</td><td></td></tr><tr><td>2-甲基丁烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M32631-4L</td><td></td></tr><tr><td>Microman 毛细管活塞 CP1000</td><td>VWR</td><td>76178-166</td><td>正向置换移液器吸头</td></tr><tr><td>MMP2 可降解交联剂（KCGGPQGIWGQGCK）</td><td>GL Biochem</td><td>N/A</td><td>生物墨水组分</td></tr><tr><td>小鼠抗人 &amp;alpha;SMA 单克隆抗体</td><td>Fisher Scientific</td><td>MA5-11547</td><td>用于染色</td></tr><tr><td>OmniCure 系列 2000</td><td>&amp;nbsp;Lumen Dynamics</td><td>S2000-XLA</td><td>用于光致硬化的紫外光源</td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>用于固定样品</td></tr><tr><td>pH 计</td><td>Mettler Toledo&amp;nbsp;</td><td>FP20&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>pH 试纸</td><td>Cytiva</td><td>10362010</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Hyclone Laboratories, Inc.</td><td>Cytiva SH30256.FS</td><td></td></tr><tr><td>移液器套装</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-388-100</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;micro;L 移液器吸头</td><td>USA Scientific</td><td>1120-3710</td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;micro;L 移液器吸头</td><td>USA Scientific</td><td>1183-1510</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;L 移液器吸头</td><td>USA Scientific</td><td>1111-0700</td><td></td></tr><tr><td>1000 &amp;micro;L 移液器吸头</td><td>USA Scientific</td><td>1111-2721</td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇-α-甲基丙烯酸酯（PEG&amp;alpha;MA）</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>合成步骤请参见论文</td></tr><tr><td>聚环氧乙烷（PEO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>372773-250G</td><td>生物墨水组分</td></tr><tr><td>正向置换移液器</td><td>Fisher Scientific</td><td>FD10004G</td><td>100–1000 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>氢氧化钾（KOH）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221473-500G</td><td>用于调节溶液 pH 值</td></tr><tr><td>ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td>用于染色过程</td></tr><tr><td>Pronterface</td><td>All3DP</td><td>N/A</td><td>软件下载</td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864-10ML</td><td>用于染色</td></tr><tr><td>RGD 肽（CGRGDS）</td><td>GL Biochem</td><td>N/A</td><td>生物墨水组分</td></tr><tr><td>摇床</td><td>VWR</td><td>10127-876</td><td></td></tr><tr><td>旋转蒸发仪&amp;nbsp;</td><td>Thomas Scientific</td><td>11100V2022</td><td>用于 PEGaMA 合成过程</td></tr><tr><td>橡胶圈</td><td>Staples</td><td>808659</td><td></td></tr><tr><td>施伦克烧瓶&amp;nbsp;</td><td>Kemtech America</td><td>F902450</td><td>用于 PEGaMA 合成过程</td></tr><tr><td>Slic3r</td><td>Slic3r</td><td>N/A</td><td>软件下载</td></tr><tr><td>平滑肌细胞生长培养基-2（SmGM-2）BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3182</td><td>试剂盒包含 CC-3181 和 CC-4149 组分</td></tr><tr><td>氢化钠&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223441-50G</td><td>用于 PEGaMA 合成过程</td></tr><tr><td>Sorvall ST 40R 离心机</td><td>Fisher Scientific</td><td>75-004-525</td><td></td></tr><tr><td>搅拌子</td><td>VWR</td><td>58948-091</td><td></td></tr><tr><td>注射器滤器</td><td>VWR</td><td>28145-483</td><td>用于溶液的无菌过滤</td></tr><tr><td>T-75 组织培养处理烧瓶</td><td>VWR</td><td>82050-856</td><td>用于细胞培养操作</td></tr><tr><td>Tissue-Tek 冷冻模具</td><td>Sakura</td><td>4557</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂（OCT）</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>三(2-羧乙基)膦（TCEP）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706-2G</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>C34H622O11</td><td>用于染色过程</td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-20ML</td><td>用于细胞培养操作</td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25-300-062</td><td>用于细胞培养操作</td></tr><tr><td>吐温 20</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>C58H114O26</td><td>用于染色过程</td></tr><tr><td>直立式显微镜</td><td>Olympus</td><td>BX63F</td><td>具备荧光显微镜功能</td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>PolyScience</td><td>WBE20A11B</td><td></td></tr><tr><td>24 孔组织培养板</td><td>Corning</td><td>3527</td><td></td></tr></tbody></table>

3d生物打印光可调水凝胶以研究成纤维细胞活化

3D Bioprinting Phototunable Hydrogels to Study Fibroblast Activation

光可调水凝胶可在光照下发生空间和时间上的转变。将此类生物材料整合到细胞培养平台中，并动态触发其变化（例如增加微环境刚度），可使研究人员模拟纤维化疾病进展过程中细胞外基质（ECM）发生的变化。本文介绍了一种在明胶支撑浴中进行两次连续聚合反应的光可调水凝胶生物材料的3D生物打印方法。通过调节支撑浴的pH值以促进迈克尔加成反应，对自由形式悬浮水凝胶可逆嵌入（FRESH）生物打印技术进行了改进。首先，将含有聚乙二醇-α-甲基丙烯酸酯（PEGαMA）的生物墨水与可细胞降解的交联剂以非化学计量比反应，形成柔软的水凝胶。随后，将这些柔软水凝胶暴露于光引发剂和光照下，诱导未反应基团的均聚反应，从而使水凝胶硬化。本方案涵盖了水凝胶合成、3D生物打印、光致硬化以及终点表征，用于评估成纤维细胞在3D结构中的活化状态。本文所述方法使研究人员能够3D生物打印经历pH催化聚合反应的多种材料，并可用于构建组织稳态、疾病及修复的多种模型。

本方案描述了如何在支撑浴中对光可调水凝胶进行三维生物打印，以构建能够动态且随时间硬化、并模拟人体组织几何结构的支架，用于研究成纤维细胞的活化。首先，本方案介绍了如何合成该光可调聚合物体系的骨架材料PEGαMA。核磁共振（NMR）波谱分析显示PEGαMA的功能化率达到96.5%（图1）。功能化率在90%或以上均适用于本实验。接下来，详细说明了如何创建中空圆柱体的三维CAD模型，以模拟肺部血管结构。补充文件1中提供了可下载的三维CAD模型，而该设计对应的G代码可在补充文件2中获取。该CAD模型所生成的结构具有以下尺寸：高度4 mm，内径4 mm，壁厚300 µm。
生物打印机设置说明如下所示（图2将打印头牢固组装并固定，使玻璃注射器和针头能够将生物墨水直接挤出到下方含有支撑浴的孔板中，是至关重要的一步（图2 和 <strong class="...

本文介绍了如何使用3D生物打印光可调水凝胶来研究细胞外基质硬化和成纤维细胞活化。

3D生物打印光可调水凝胶以研究成纤维细胞活化

光可调谐水凝胶可在光照下发生空间和时间上的转变。将此类生物材料引入细胞培养……

我们设计了肺组织的三维模型，以帮助世界更轻松地呼吸。我们的使命是利用3D生物材料和3D打印等技术，构建有助于理解慢性肺部疾病成因以及改善这些疾病治疗方法的研究平台。我们研究中的一项实验挑战在于难以将柔软材料3D打印成复杂形状。我们通过将生物墨水打印到一种剪切稀化支撑浴中，从而精确地沉积细胞，该支撑浴有助于在打印过程中维持细胞的形态。我们的生物材料可在整个实验过程中调控样品的力学性能。该配方使研究人员能够在与健康和病变肺组织刚度相匹配的水凝胶中培养细胞。用户可自主决定何时对样品进行硬化，并测量细胞的响应。本方案中使用的光可调生物材料能够构建一种初始处于软化状态的模型，随后可通过硬化来研究细胞对微环境硬度增加的响应。相比之下，若采用静态生物材料而非光可调生物材料的类似技术，则所构建的模型在打印完成后无法再进行硬化。本实验室其他研究的结果表明，性别和年龄在肺部疾病进展中起着关键作用。未来的模型将研究这些变量，并包含更多复杂性，例如增加细胞特异性层次。结合这些努力将产生更逼真的生物打印组织，并为治疗纤维化疾病提供新方法。在生物安全柜内无菌条件下开始水凝胶生物墨水的制备，首先在不含FBS的无菌细胞培养基中配制浓度为0.25毫克/毫升的PEG alpha甲基丙烯酸酯储备液。同时，使用20毫摩尔的无菌TCEP，分别配制250毫摩尔的DTT MMP2可降解交联剂和RGD肽的储备液。最后，使用蒸馏水配制15%（重量/体积）的PEO储备液。将所需量的预配置试剂储备液和低血清细胞培养基与成纤维细胞在15毫升锥形管中混合。使用正向置换移液器充分混匀所得的生物墨水，以确保细胞呈单细胞状态。验证最终前体溶液的pH值为6.2。从生物打印机上取下打印头以接触玻璃注射器。将生物墨装入玻璃注射器时，先移除注射器活塞，然后使用另一支连接1.5英寸长15号钝头针头的注射器从离心管中吸取生物墨。将15号针头更换为30号0.5英寸长钝头针头，并将生物墨转移至玻璃注射器中，注意避免产生气泡。最后，将玻璃注射器放入打印头中，并安装打印头组件，确保组装牢固以进行打印。开始光可调水凝胶结构的3D打印时，将装有含成纤维细胞水凝胶生物墨水的玻璃注射器放入打印头中，并安装打印头组件，确保组装牢固以进行打印。然后，使用Pronterface软件中的方向箭头，手动并小心地调整挤出针在孔板孔中心支撑浴浆液中的位置。针尖下方至少保留一毫米的浆料。针尖位置正确后，按下 Pronterface 软件中的打印按钮，等待打印完成。重复前述步骤，直至获得所需数量的生物打印结构。打印完成后，将含有构建物的孔板在生物安全柜中室温下静置一小时，并保持覆盖状态。此步骤可使光可调水凝胶生物墨水发生碱催化聚合反应。随后，将含有3D生物打印构建物的孔板置于37摄氏度的无菌培养箱中孵育12至18小时，以融化支撑浴浆料。接下来，在生物安全柜内更换生物

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科研

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Bioengineering

生物工程

3D生物打印光可调水凝胶研究成纤维细胞活化

采用生物打印机基于可牺牲模具制备出具有特定图案的水凝胶。首先用第二种水凝胶填充泊洛沙姆模具，随后将其洗脱，形成可被第三种水凝胶填充的孔隙结构。该方法利用泊洛沙姆快速洗脱和良好可打印性的特点，实现由生物聚合物构建复杂结构。...

打印热响应性反向模具以制备用于三维细胞培养的图案化双组分水凝胶

我们描述了一组联合使用的方案，可共同制备出具有组织模拟特性的水凝胶生物墨水，用于生物打印功能完整且存活的三维组织结构 体外...

使用组织特异性水凝胶生物墨水打印细胞化结构

荧光共振能量转移（FRET）成像是一种用于实时细胞生物学研究的有力工具。本文介绍了一种利用常规落射荧光显微镜在生理性的三维（3D）水凝胶微环境中进行FRET成像细胞的方法。同时描述了一种针对比率型FRET探针的分析方法，该方法在激活范围内可产生线性比率结果。...

三维水凝胶中的FRET成像

使用基于纳米纤维素-海藻酸盐的生物墨水对软骨和皮肤类似物进行生物打印。打印前通过单步被动混合装置对生物墨水进行细胞接种。结果显示，所构建的组织结构细胞分布均匀，细胞活力高，并表现出良好的分化标志物。...

利用新型被动混合单元技术实现生物墨水预细胞化的软骨与皮肤组织类似物生物打印

我们开发了一种异质性乳腺癌模型，该模型由永生化的肿瘤细胞和成纤维细胞嵌入可生物打印的海藻酸盐/明胶生物墨水中构成。该模型可重现 体内...

可生物打印的海藻酸盐/明胶水凝胶3D 体外 模型系统诱导细胞球体形成

本文介绍了一种明胶甲基丙烯酰胺的3D生物打印方法。...

基于明胶甲基丙烯酰胺水凝胶生物墨水的3D生物打印方案

本研究中，我们开发了一种新型的多层改性策略，用于低黏度类液体生物墨水（甲基丙烯酰化明胶），以防止包封细胞发生沉降。...

使用多层水凝胶生物墨水进行三维生物打印以实现均匀的细胞分布

本方法涉及在允许活细胞共聚焦显微镜观察的同时，对嵌入硅橡胶中的三维软水凝胶进行单轴拉伸。文中展示了对外部和内部水凝胶应变以及纤维取向的表征。所开发的装置与实验方案可用于评估细胞对不同应变条件的响应。...

活体显微成像下三维水凝胶的可控应变

水凝胶形成过程中的剪切处理可产生微凝胶悬浮液，该悬浮液具有剪切变稀特性，但在去除剪切力后能迅速重构。此类材料已被用作生物打印复杂、含细胞结构的支撑基质。本文描述了用于制备支撑床及相容性生物墨水的方法。...

通过凝胶化过程中剪切处理形成琼脂糖流体凝胶用于悬浮3D生物打印

利用κ-卡拉胶亚微凝胶介质嵌入式生物打印类组织结构

了解利用光可调水凝胶进行三维生物打印的技术，用于研究细胞外基质硬化对肺成纤维细胞活化的影响。该方法为慢性肺部疾病机制研究提供了新平台。

3D生物打印光可调水凝胶以研究成纤维细胞活化

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