Name: 测量初始和效应 CD8 T 细胞的线粒体功能 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: 了解如何使用Mito Stress Test技术测量初始和效应CD8 T细胞的线粒体功能与生物能量代谢。本方法通过实时分析T细胞受体信号，揭示溶血磷脂酸对T细胞代谢灵活性的调控机制，为免疫耐受研究提供重要实验手段。

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赫兹基金会、艾米·戴维斯基金会、摩尔家族基金会和海蒂·霍纳基金会提供了宝贵的支持，我们对此深表感谢。本研究还部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）向 RMT 提供的资助（AI052157、AI136534），JAT 则获得了赫兹研究生奖学金的支持。

小鼠饲养于无病原体环境中，并根据机构动物护理和使用委员会的标准与规定进行管理。
1. 通过抗原特异性刺激生成和扩增CD8 T细胞
<ol>
	<li>第一天，分离来自OT-I小鼠的脾细胞；随后进行制备与激活 体外 与SIINFEKL（4）肽。
	<ol>
		<li>清洁超净台空间，准备试剂，并收集小鼠培养基。将小鼠培养基置于水浴或珠浴孵育器中预热。
		<ol>
			<li>在6孔板中，向一个孔加入7 mL小鼠培养基，再向另一个孔加入3 mL小鼠培养基。随后，将滤网插入含有7 mL培养基的孔中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>从动物房用转运笼将小鼠带入实验室，将小鼠转移至一个干净的空笼中，并放置好 CO2 顶部连接适配器。使用 CO2 最高流速达2.75。
		<ol>
			<li>仔细观察小鼠，留意任何痛苦的迹象。在最后一次呼吸后，至少继续观察1分钟，注意是否有呼吸或其他生命迹象。关闭CO₂气源。2 并采用颈椎脱位法作为安乐死的辅助方法。随后清洁工作台面、鼠笼及其他工作区域，将小鼠转移至解剖通风橱中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>从小鼠体内解剖出脾脏。
		<ol>
			<li>使用70%乙醇对解剖器械进行消毒，并将小鼠左侧朝下放置，喷洒小鼠左侧以消毒。</li>
			<li>使用洁净的器械解剖以去除皮肤并暴露腹膜。在腹膜上做一小切口，找到脾脏后将其切除。将脾脏置于置于滤网上的6孔板中。</li>
			<li>清洁操作区域，将小鼠尸体放入生物危害废弃物袋中，然后将袋子置于冷冻箱中等待处理。</li>
			<li>确保整个区域清洁，并将6孔板移至组织培养罩内以进行后续步骤。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在组织培养罩内，将脾脏匀浆并重悬细胞，制成无团块的单细胞悬液。
		<ol>
			<li>用5 mL注射器的推杆将脾脏通过滤网压入含有7 mL培养基的孔板中。</li>
			<li>用额外孔中的 3 mL 培养基冲洗滤网及任何残留组织。</li>
			<li>用血清移液管将细胞悬液转移至新的10 mL锥形管中。</li>
			<li>离心5分钟，500 × g g 使用玻璃移液管吸除上清液。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>裂解红细胞。
		<ol>
			<li>使用1 mL ACK裂解缓冲液开始红细胞裂解过程，将细胞重悬于ACK裂解缓冲液中，室温孵育1–5分钟。 
			注意：应根据特定批次的ACK裂解缓冲液优化孵育时间，以实现红细胞最大程度裂解的同时，使脾细胞死亡最少。</li>
			<li>向锥形管中加入 10 mL 培养基以中和，于 500 × g 离心 5 分钟 g.</li>
			<li>将细胞重悬于50 mL培养基中，转移至T75培养瓶。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>用SIINFEKL（N4）多肽刺激细胞。
		<ol>
			<li>将SIINFEKL肽带入组织培养超净台。将SIINFEKL肽储存于-20 °C。</li>
			<li>将SIINFEKL直接加入培养基中，使其终浓度为2 µg/mL。向50 mL培养基中加入50 µL SIINFEKL（2 mg/mL），使其终浓度为2 µg/mL。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在37 °C下孵育细胞72小时。</li>
		<li>使用70%乙醇对组织培养罩进行消毒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第4天，洗涤细胞以去除多肽。用新鲜配制的含IL-2的培养基重悬细胞，然后将培养瓶放回培养箱中。
	<ol>
		<li>从T75培养瓶中收集细胞至50 mL锥形管中。离心并沉淀OT-I CD8 T细胞，随后用移液法吸除多余培养基。加入50 mL含有1,000 U/mL IL-2的新鲜小鼠培养基，重悬细胞后转移至新的T75培养瓶中。</li>
		<li>储存时，将IL-2储备液分装后置于-80 °C冰箱中保存。在-80 °C条件下储存可最大限度减少多肽降解。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为线粒体功能检测制备扩增的抗原特异性细胞毒性CD8 T细胞
	<ol>
		<li>第七天进行线粒体功能检测。准备用于检测的抗原特异性OT-I CD8 T细胞。</li>
		<li>收集活的CD8 T细胞。
		<ol>
			<li>将细胞从T-75培养瓶转移至一个新的50 mL锥形管中，随后以500 × g离心5分钟。 g.</li>
			<li>在细胞离心的同时，于一个新的50 mL离心管中加入20 mL密度梯度介质（密度 = 1.077 g/mL）。</li>
			<li>离心完成后，取出锥形管，加入10 mL培养基重悬细胞。然后缓慢用移液器将重悬的细胞液小心铺加到密度梯度液的上方。注意不要扰动密度梯度，将锥形管以1,300 × g 室温下以最大加速度、最小减速度设置振荡20分钟，不使用刹车。</li>
			<li>当离心完成后，使用 P1000 移液器收集中间的 T 细胞层。观察细胞层位置，确保移液器吸头保持在该层上方，避免扰动细胞层。将收集的细胞转移至含有 30 mL 完全小鼠培养基的新的 50 mL 锥形管中。随后，以 500 × g 离心5分钟。离心结束后，吸除OT-I CD8 T细胞中的多余上清液。用20 mL新鲜小鼠培养基重悬细胞。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用血细胞计数板计数活细胞的总数。取少量细胞与台盼蓝按1:4比例稀释染色，以鉴别死细胞。 
		注意：大约 40-60 × 106 一只OT-I小鼠可预期获得的细胞数量。</li>
		<li>通过额外的离心步骤，用20 mL新鲜小鼠培养基洗涤剩余细胞。然后使用微孔板，将细胞以每孔200,000个细胞接种于完全小鼠培养基中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 通过抗 CD3/抗 CD28 刺激生成和扩增多特异性 CD8 T 细胞
<ol>
	<li>第0天，用CD3包被24孔板。将1 mL浓度为5 µg/mL的抗CD3-生物素（用PBS稀释）加入24孔板的每个孔中。将该板置于湿润、含5% CO₂的培养箱中2 过夜孵育。</li>
	<li>第二天，处死小鼠并收集脾细胞。激活脾细胞 体外 使用抗CD3/抗CD28，按照步骤1.1.1–1.1.5.3进行。</li>
	<li>使用磁珠分离方案分离CD8 T细胞。 
	注意：确保细胞保持低温。在预冷条件下快速操作。
	<ol>
		<li>用40 µL MACS缓冲液重悬细胞，使细胞浓度为每40 µL MACS缓冲液含10,000,000个细胞。向细胞悬液中加入10 µL生物素标记抗体混合物，充分混匀后于4 °C孵育5分钟。</li>
		<li>在细胞于冰箱中孵育的同时，准备阳性筛选柱。用 3 mL 缓冲液洗涤柱子，弃去流出的废液。</li>
		<li>5分钟后，从冰箱中取出细胞-抗体溶液，每10,000,000个细胞加入30 µL MACS缓冲液和20 µL抗生物素抗体，于4 °C再孵育10分钟。</li>
		<li>在阳性分选柱下方放置一个新的收集管，使用新的15 mL圆底离心管。10分钟孵育结束后，将细胞悬液转移至阳性分选柱中。用新的15 mL圆底离心管收集流穿液。使用3 mL MACS缓冲液洗涤柱子，以收集残留细胞。 
		注意：确保细胞悬液的体积至少为 0.5 mL。</li>
		<li>将经阳性筛选的CD8 T细胞重新接种至24孔板中，用于抗CD3/抗CD28刺激。
		<ol>
			<li>以 500 × g 离心流穿部分 g 4 °C 条件下离心 5 分钟。吸除多余上清液，用移液器将细胞重悬于溶液中。使用血细胞计数板和台盼蓝对细胞进行计数。 
			注意：预计产量约为 8-10 × 106 每只小鼠脾脏中待计数的活细胞。</li>
			<li>计数细胞后，将CD8 T细胞重悬于500,000个细胞/mL的浓度。随后，小心吸去24孔板中1 mL PBS，将计数后的细胞重新接种至24孔板中，并加入106 每孔细胞数</li>
			<li>用移液器将抗CD28加入24孔板中，使抗CD28的终浓度为2 µg/mL，以刺激细胞。轻轻敲击培养板以混匀细胞。将细胞置于37 °C培养箱中继续培养72 h。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用70%乙醇清洁组织培养操作台。</li>
	<li>第4天（72小时后），去除抗CD3/抗CD28刺激，离心洗涤多克隆CD8 T细胞。吸除多余上清液，用含1,000单位/mL IL-2的新鲜小鼠培养基重悬细胞，培养基体积为10 mL。将重悬的细胞转移至新的6孔板中，放入培养箱继续培养。 
	注意：1.2.2. 对于储存，IL-2 原液的分装样品可保存在 -80 °C 超低温冰箱中。在 -80 °C 条件下储存可最大限度减少多肽降解。</li>
	<li>为线粒体功能检测准备扩增的多克隆效应CD8 T细胞。
	<ol>
		<li>第七天，准备并处理多克隆CD8 T细胞用于检测。</li>
		<li>分离活的CD8 T细胞。
		<ol>
			<li>将细胞从6孔板中用移液器转移至洁净的锥形管中，随后在500 × g条件下离心5分钟 g.</li>
			<li>按照步骤 1.3.3.2–1.3.4 进行操作。 
			注意：一只 C57BL/6 小鼠通常可获得约 1000 万至 3000 万个活 CD8 T 细胞。</li>
			<li>保存一份细胞等分试样用于流式细胞术检测CD8纯度。进行流式细胞术时，将细胞与所选的活力染料在冰上避光孵育20分钟。9.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 分离初始型CD8 T细胞
<ol>
	<li>第7天，按照步骤1.1.1-1.1.5.3从一只小鼠中收获脾细胞。</li>
	<li>使用步骤2.3-2.3.5.1中所述的基于磁珠的方法进行CD8 T细胞分离。</li>
	<li>将CD8 T细胞以每孔200,000个细胞的密度接种于微孔板中，使用完全培养基。</li>
</ol>
4. 进行线粒体功能检测
<ol>
	<li>在进行线粒体功能检测的前一天准备好材料。
	<ol>
		<li>水合传感器板。
		<ol>
			<li>用移液器将 200 µL 去离子水加入校准板的每个孔中。将传感器板置于校准板上方，检查传感器板两端是否浸入水中以确保充分水合。将传感器板和校准板一起放入无 CO2 培养箱中，37 °C 至少孵育 10 小时。</li>
			<li>准备一个 50 mL 锥形管，加入 50 mL 校准液（Calbrant），放入无 CO2 培养箱中过夜孵育。</li>
			<li>在检测前一天，配制用于检测的新鲜完全培养基。总共 50 mL，配制含 1 mM 丙酮酸钠、2 mM 谷氨酰胺和 10 mM 葡萄糖的检测培养基溶液。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第二天进行线粒体功能检测。
	<ol>
		<li>通过快速翻转的方式将校准板中的去离子水甩去。用 200 µL 校准液重新水合。使用前一晚保存在无 CO2 培养箱中的校准液。将传感器板重新放回校准板上后，将整套装置放回无 CO2 培养箱中。 
		注意：甩板时，应在水槽上方迅速而流畅地将板翻转一次，使去离子水快速从板中流出。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照上述第 1–3 节所述方法准备 CD8 T 细胞。
	<ol>
		<li>使用多通道移液器，将 10 × 106 个细胞重悬于 4.5 mL 完全培养基中，每孔加入 90 µL，使每孔细胞数为 200,000。随后在预处理阶段每孔再加入 90 µL 指定的培养基。 
		注意：若无预处理步骤，则每孔直接加入 180 µL 完全培养基，最终每孔细胞数为 200,000。从本步骤开始，实验过程中微孔板应保持在室温或无 CO2 培养箱中，切勿放入 5% CO2 培养箱。注意，微孔板每孔最终体积为 180 µL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备预处理（包括脂质或其他代谢物补充）。
	<ol>
		<li>通过快速离心冷冻保存的冻干脂质来制备脂质预处理液。确定预处理所需的浓度，并按该浓度配制脂质预处理液。使用前立即对稀释后的脂质进行 30 分钟超声处理。</li>
		<li>配制脂质混合物。
		<ol>
			<li>确定线粒体功能检测中拟使用的脂质浓度。</li>
			<li>将脂质配制成目标浓度 2 倍的储备液，然后将脂质溶液加入微孔板现有体积中，实现 1:2 稀释。具体操作为：将 90 µL 脂质溶液直接加入已有的 90 µL 培养基中，使每孔最终体积为 180 µL（1:2 稀释）。 
			注意：表 1 详细列出了一个可能的板布局和设计示例。建议进行 5–6 次技术重复，同时包含未经处理和抗原特异性的效应 CD8 T 细胞，并设置加与不加脂质添加剂的组别。值得注意的是，本方案设计避免离心步骤，以尽量减少细胞损伤。由于线粒体功能检测对细胞数量高度敏感，减少细胞损失至关重要。因此，不采用离心，而是通过轻甩方式处理细胞以保持其完整性。</li>
			<li>向微孔板的每个角落孔中加入 180 µL 完全培养基。将含有 CD8 T 细胞的微孔板放入无 CO2 培养箱中。 
			注意：孵育时间根据预处理所需时长而定。为减少细胞死亡，建议 CD8 T 细胞的预处理时间最长不超过 4 小时。过长的预处理时间可能导致大量细胞死亡，影响结果的准确性。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备用于急性注射的毒剂和溶液。
	<ol>
		<li>使用储备液配制寡霉素的稀释液。将寡霉素用 3 mL 完全培养基稀释。在 15 mL 锥形管中谨慎配制毒剂和急性注射液。由于这些毒剂对光敏感，应使用锡箔包裹的试管以避光。
		<ol>
			<li>在一个用锡箔包裹的 15 mL 锥形管中，将寡霉素用 3 mL 完全培养基稀释，使注射后终浓度为 2.5 µM。</li>
			<li>在第二个用锡箔包裹的 15 mL 锥形管中，将 FCCP 用 3 mL 完全培养基稀释，使注射后终浓度为 2.0 µM。</li>
			<li>在第三个用锡箔包裹的 15 mL 锥形管中，将鱼藤酮和抗霉素 A 用 3 mL 完全培养基配制成溶液，使注射后两者的终浓度均为 0.5 µM。</li>
			<li>若实验中还需加入其他代谢调节剂、药物或刺激物，则将其用完全培养基稀释。若计划使用依托莫司（etomoxir）或其他代谢调节剂和药物，应先进行滴定实验以确定最佳使用浓度。若通过急性注射进行 TCR 刺激，可使用抗 CD3/抗 CD28 磁珠，或使用包被的抗 CD3-生物素联合抗 CD28-链霉亲和素。 
			注意：更多描述请参见第 5 节，其中详细说明了通过急性抗 CD3/CD28 注射进行 TCR 刺激的实验方案。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>从无 CO2 培养箱中取出传感器板。使用板适配器，将毒剂加入传感器板中。放置板适配器，使每个腔室可分别加载毒剂或其他急性注射液。 
		注意：加入毒剂时需格外小心。
		<ol>
			<li>将毒剂加入传感器板的加样孔中。若无其他额外注射，则 A–C 孔将用于加载毒剂。向 A 孔加入 20 µL 寡霉素，B 孔加入 22 µL FCCP，C 孔加入 25 µL 鱼藤酮和 25 µL 抗霉素 A。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在仪器开始检测前 1 小时，将微孔板放入无 CO2 培养箱中。</li>
	<li>在启动仪器前，打开软件并校准仪器。应在将微孔板装入仪器前 30 分钟完成此操作，以确保有充足的校准时间。
	<ol>
		<li>在软件系统中对各孔进行标记，并检查注射方案。</li>
		<li>校准过程中，将传感器板装入仪器。软件将提示您完成初始化和质量检查。校准将评估每个孔的 pH 和 O2 水平，结果将显示为通过或失败，并在屏幕上以对勾或“X”标示。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 在另一次实验中，通过急性抗 CD3/CD28 注射，对线粒体功能检测进行改良，加入 TCR 刺激
注意：线粒体功能检测可通过两种不同的方法进行急性TCR刺激：1）使用第5.2步中所述的生物素化抗CD3抗体、抗CD28抗体和链霉亲和素，或2）使用第5.3步中所述的抗CD3/CD28磁珠。这两种独立实验均可在检测过程中通过急性刺激激活TCR。
<ol>
	<li>若需进行额外注射，请按照前述第4节所述准备检测。使用额外的注射腔室调整注射方案。在本方案中，将抗CD3/抗CD28加入传感器微孔板的A孔，然后将寡霉素加入B孔，FCCP加入C孔，鱼藤酮和抗霉素A加入D孔，其余各孔依此类推。</li>
	<li>准备并加载生物素化抗CD3、抗CD28及链霉亲和素组分。
	<ol>
		<li>将20 µL浓度为10 µg/mL的生物素化抗CD3移液至传感器微孔板的指定孔中。</li>
		<li>将20 µL浓度为2 µg/mL的抗CD28与20 µg/mL的链霉亲和素混合液移液至传感器微孔板的指定孔中。</li>
		<li>将20 µL含10 µg/mL生物素化抗CD3、2 µg/mL抗CD28及20 µg/mL链霉亲和素的混合液移液至传感器微孔板的指定孔中。</li>
		<li>确保对照孔已正确设置。应包含仅加入培养基、仅加入生物素化抗CD3、抗CD28加链霉亲和素、以及生物素化抗CD3加抗CD28加链霉亲和素的指定对照孔。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按1:1的磁珠-细胞比例，准备并加载抗CD3/CD28磁珠。
	<ol>
		<li>在每孔含200,000个细胞的培养板中，向传感器微孔板的指定孔中加入5 µL磁珠。</li>
		<li>为对照孔准备仅含培养基的注射液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>调整毒剂的加入体积，使注射后的终浓度分别为：寡霉素2.5 µM，FCCP 2.0 µM，鱼藤酮和抗霉素A均为0.5 µM。</li>
	<li>在将微孔板装入仪器前，确保已修改注射方案以反映更新后的时间点。</li>
	<li>设置软件程序，使急性TCR刺激实验总时长为140分钟。在此期间，调整方案，使寡霉素注射前完成10个时间点的检测。</li>
</ol>

作者无任何竞争利益需要披露。

本文概述了一种评估初始态和效应态CD8 T细胞线粒体功能的实验方案。我们详细描述并比较了使用OT-I和C57BL/6小鼠制备抗原特异性及多克隆CD8 T细胞的方法。结果显示，尽管CD8 T细胞的激活方式和预处理方法不同，其代谢特征仍表现出相似的趋势。数据表明，与经抗CD3和抗CD28抗体刺激的C57BL/6野生型细胞相比，抗原特异性激活可产生代谢活性更高的OT-I CD8 T细胞。本文所述方案表明，线粒体功能检测（即线粒体应激测试）是一种极为敏感且可重复性良好的检测方法，可在多种不同条件和细胞类型下获得可靠结果。我们的研究结果及详细的实验流程进一步确立了该检测方法作为分析CD8 T细胞代谢和生物能量学基础技术的重要地位。
随着免疫疗法和各种细胞治疗的不断进步，T细胞靶向治疗的重要性也日益增加41。免疫疗法的应答及抗肿瘤免疫反应依赖于T细胞介导的代谢、钙信号传导以及由上游TCR激活引发的氧化通量42。最佳的CD8 T细胞反应需要代谢效率和代谢灵活性5</...

免疫细胞的命运和功能受到代谢、氧化消耗和无氧呼吸的显著影响1,2,3,4。近年来，通过靶向调控代谢以重编程或恢复CD8 T细胞的命运和效应功能，并提高病毒清除能力或增强内源性抗肿瘤免疫，正受到越来越多的关注5,6,7,8,9。值得注意的是，T细胞受体（TCR）介导的抗原受体信号传导是CD8 T细胞分化的关键条件，可引发下游信号转导和激活10,11,12（图1）。长期暴露于免疫损伤会导致TCR持续的抗原特异性刺激，最终引发慢性炎症状态、T细胞耗竭、免疫微环境重塑以及免疫逃逸11,13,14,15,16,17,18,19。
耗竭型CD8 T细胞的代谢特征与功能性效应CD8 T细胞存在根本性差异2,3,14,15,18,20T细胞分化、干扰素γ（IFNγ）分泌以及记忆能力在一定程度上由线粒体功能和β-氧化分解产物决定。IFNγ+ CD8 T细胞是抗肿瘤和抗病毒免疫反应的关键组分21,22,23糖酵解和电子传递链的特定代谢通量对CD8 T细胞的活化、细胞因子分泌及记忆应答具有重要作用4,11,13,15,18,24,25,26,27,28最佳的免疫应答，包括T细胞活化和效应分化，需要线粒体产生协调且特异性的反应；而线粒体功能缺陷和活性氧（ROS）过度积累则是耗竭或功能失调T细胞的特征9,29最近，对CD8 T细胞的持续性TCR刺激 体外 通过诱导氧化应激并重编程T细胞增殖所需的氧化代谢及代谢能力，部分促进了CD8 T细胞的耗竭性分化1,2,13,20,24,29总之，代谢调控轴在指导CD8 T细胞分化及其向效应、记忆或耗竭/功能障碍表型的进展过程中起着关键作用。
代谢物还通过作为自分泌或旁分泌信号分子来调控免疫细胞的反应9,30,31,32,33,34,35。鞘氨醇-1-磷酸（S1P）和溶血磷脂酸（LPA）是具有生物活性的促炎性脂质，可通过G蛋白偶联受体（GPCRs）传递信号，调节CD8 T细胞的淋巴细胞迁移和细胞毒性功能36。CD8 T细胞上的GPCR LPA受体介导的LPA信号可重编程其代谢，促进脂解作用、脂肪酸氧化以及质子泄漏9。总体而言，CD8 T细胞的生物能量学和代谢主要由底物可利用性、环境信号以及能量需求所驱动。
研究CD8 T细胞代谢的方法学正变得愈发重要。细胞线粒体应激测试（Cell Mito Stress Test）可对生物能量学进行系统性评估，现已被公认为免疫代谢及CD8 T细胞能量代谢研究领域的标志性技术9,37。过去，贴壁细胞常用于线粒体应激测试分析38；然而，目前越来越多的研究关注将该检测方法应用于悬浮培养的细胞，特别是将免疫细胞用于细胞线粒体应激测试分析。本文中，我们基于近期发表的研究9，提供了一套用于测定CD8 T细胞代谢活性的详细实验方案。我们详细阐述了CD8 T细胞的扩增、初始CD8 T细胞的分离、检测前的准备，以及在细胞线粒体应激测试中进行预处理和急性注射处理的具体操作步骤。尤为重要的是，我们比较并分析了多种T细胞受体（TCR）刺激及CD8 T细胞活化的方法，包括多克隆刺激和抗原特异性TCR刺激。
本方案详细描述了使用OT-I转基因小鼠（一种经典的转基因小鼠模型）进行抗原特异性刺激的方法，该模型中所有小鼠T细胞均表达相同的Vα2和Vβ5基因39。OT-I小鼠的CD8 T细胞均携带相同的T细胞受体（TCR），该受体特异性识别卵清蛋白八肽（OVA257-264，也可写作氨基酸序列SIINFEKL或N4），这是一个被广泛研究的表位，当其由主要组织相容性复合体（MHC）I类分子呈递时，可激活细胞毒性CD8 T细胞39（图1A）。总体而言，OT-I转基因小鼠模型被免疫学家广泛用于研究TCR信号传导及抗原特异性T细胞效应功能。与OT-I小鼠模型中的单克隆激活相对，多克隆CD8 T细胞可通过抗CD3/CD28抗体激活，这些抗体分别靶向TCR的CD3亚基和共刺激分子CD2840（图1B）。抗CD3/CD28抗体绕过TCR信号传导中的抗原特异性组分，从而激活一群多克隆T细胞40。最终，本报告所述结果比较了多种利用Cell Mito Stress Test定量CD8 T细胞中动态代谢通量的方法。

<table><tbody><tr><td>抗霉素 A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>抗-CD28</td><td>Biolegend</td><td>102116</td><td></td></tr><tr><td>抗-CD3/CD28 Dynabeads</td><td>ThermoFisher</td><td>11456D</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记抗-CD3</td><td>Biolegend</td><td>317320</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108321-42-2</td><td></td></tr><tr><td>CD8a+ T细胞分离试剂盒</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-075</td><td></td></tr><tr><td>细胞筛（100 &amp;micro;m）</td><td>CELL TREAT</td><td>229485</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8008</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>26873-85-8</td><td>密度梯度介质&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>FCCP（(4-(三氟甲氧基)苯基)碳酰肼二氰）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-6152</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>LS 柱</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>正向选择柱</td></tr><tr><td>磁性细胞分离柱</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-301</td><td></td></tr><tr><td>微孔板</td><td>Agilent</td><td>102601-100</td><td></td></tr><tr><td>寡霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>113-24-6</td><td></td></tr><tr><td>重组 IL-2</td><td>PeproTech</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>鱼藤酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse 培养基</td><td>Agilent</td><td>103576-100</td><td></td></tr><tr><td>传感器微孔板</td><td>Agilent</td><td>102601-100</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9275</td><td></td></tr><tr><td>无菌6孔板</td><td>CELL TREAT</td><td>230601</td><td></td></tr><tr><td>无菌24孔板</td><td>CELL TREAT</td><td>229524</td><td></td></tr><tr><td>XF 校准液</td><td>Agilent</td><td>102601-100</td><td></td></tr></tbody></table>

测量初始和效应cd8 t细胞的线粒体功能

Measuring Mitochondrial Function of Na&#239;ve and Effector CD8 T Cells

了解免疫代谢如何影响淋巴细胞的功能、分化和命运已引起广泛关注。淋巴细胞生物学的研究已采用生物能量分析，并且该方法现已成为该领域中至关重要的工具。因此，我们致力于优化一种生物能量分析检测方法，使其可结合预处理和受体刺激所需的急性给药步骤。本文中，我们评估了CD8 T细胞 离体 使用细胞线粒体应激测试（Cell Mito Stress Test）检测初始和效应CD8 T细胞的氧气消耗率和细胞外酸化率，以评估其代谢情况。抗原特异性效应CD8 T细胞通过以下方法获得： 离体 刺激，并从脾细胞中收获初始CD8 T细胞，通过磁珠柱分离法进行分离。 
预处理在微孔板中进行，我们将详细介绍如何制备传感器 cartridge。我们展示了如何通过加样口加入药物以间接测量代谢能力，以及加入代谢调节剂；该方案可用于研究特定酶的活性。利用加样口进行抗 CD3/CD28 的急性注射和刺激，可实时研究 T 细胞受体的激活。使用仪器分析仪进行测量和数据采集，并通过软件程序进行数据可视化，以解析细胞代谢情况。该策略可产生大量关于免疫细胞生物学和线粒体生物能量学的数据，研究人员可根据需要对方案进行多种定制，以深入探究 CD8 T 细胞的代谢特性。

糖酵解和氧化代谢能力可通过线粒体功能检测进行测量，该检测通过在特定时间点靶向电子传递链的组分来评估其能力（图2A）。可通过将不同的注射方案加载到传感器微孔板的加样口，对传统检测方法进行改良，以评估T细胞受体（TCR）的急性刺激效应（图2B，C）。在解读结果之前，应针对不同细胞类型优化细胞数量和药物浓度。本文报告了已针对CD8 T细胞优化的实验条件（图3A，B），其中电子传递链抑制剂的浓度已优化，可用于测量初始态和效应态T细胞的代谢能力（图4A，B）。重要的是，该检测方法可进一步修改，用于研究由抗原特异性刺激或抗CD3/CD28刺激产生的效应CD8 T细胞在TCR刺激下的反应。我们还进一步分析了CD8 T细胞对生物活性脂质信号的响应，特别是溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid，LPA）...

CD8 T细胞的生物能量学可通过线粒体应激测试（Mito Stress Test）进行检测。该方法可用于研究急性和慢性的代谢编程。本方案描述了探讨T细胞受体生物学与生物能量学分析之间关系的研究方法。

测量初始和效应CD8 T细胞的线粒体功能

了解免疫代谢如何影响淋巴细胞的功能、分化和命运已引起广泛关注和兴趣。

我们的实验室研究淋巴细胞的免疫耐受、免疫监视以及抗原受体信号传导。我们发现溶血磷脂酸通过降低效应细胞的代谢灵活性，破坏CD8 T细胞的细胞毒性，从而促进外周耐受。我们采用多种技术来检测CD8 T细胞中线粒体代谢及能量产能能力。我们的实验室已证明溶血磷脂酸可调节CD8 T细胞的代谢适应性，可能是T细胞表型的重要决定因素。本文所述方案可实时评估T细胞受体信号转导的功能性代谢与生物能量学。首先，向工具板的每个孔中加入200微升蒸馏水。将传感器 cartridge 置于工具板上方，确保传感器 cartridge 的两端浸入液体中，以实现充分水合。将带有传感器 cartridge 的工具板置于 37 摄氏度的无二氧化碳培养箱中，孵育至少 10 小时。随后，取一支 50 毫升锥形管，加入 50 毫升校准液，并进行孵育。第二天，轻弹培养板以去除蒸馏水。用 200 微升校准液重新水化培养板。将传感器盒重新安装到工具板上方，并将工具板放回非二氧化碳培养箱中。接下来，使用多通道移液器将1000万个CD8 T细胞重悬于4.5毫升完全培养基中。在预处理过程中，每孔加入90微升细胞悬液，随后每孔再加入90微升指定的培养基。在培养板的边缘孔中加入180微升完全培养基，以防止蒸发。然后将含有CD8 T细胞的微孔板放入无二氧化碳培养箱中。将板适配器牢固地放置在传感器盒上。孵育后，使用板适配器将寡霉素、FCCP、鱼藤酮和抗霉素A分别加入相应的加样孔中。在开始检测前一小时，将微孔板放入无二氧化碳培养箱中。在加载微孔板前30分钟，打开软件并校准仪器分析仪。在软件系统中标记孔位并查看加样方案。校准过程中，将传感器 cartridge 装入仪器。通过软件运行检测。如需进行额外注射，请使用额外的注射 chamber 修改注射方案。将抗CD3和抗CD28加入传感器盒的A孔中。将寡霉素加入B孔，FCCP加入C孔，鱼藤酮和抗霉素A加入D孔。对于单独的抗CD3和抗CD28刺激，将20微升浓度为10微克/毫升的生物素化抗CD3移液至传感器盒的指定孔中。将20微升抗CD28和链霉亲和素移液至指定孔中。对于抗CD3或CD28刺激，将生物素标记的抗CD3、抗CD28和链霉亲和素各20微升混合后，用移液器加入指定孔中。对照孔中加入培养基。对于联合抗CD3和CD28刺激，按磁珠与细胞1:1的比例，将5微升抗CD3 CD28磁珠加入含有每孔200,000个细胞的指定孔中。准备仅含培养基的对照孔用于注射。调整每个通道中的抑制剂，以达到注射后的最终浓度。在将微孔板装入仪器前，确保注射方案已更新为相应时间点。将软件程序设置为运行急性TCR刺激实验，总时长为140分钟。修改实验方案，在加入寡霉素（Oligomycin）前包含10个时间点的测量。使用生物素标记的抗CD3和/或抗CD28抗体联合链霉亲和素，以及抗CD3和/或CD28磁珠进行急性TCR刺激，与仅含培养基的对照组相比，可显著提高氧消耗率和细胞外酸化率。抗CD3和CD28磁珠刺激所诱导的代谢反应与生物素标记的抗CD3和CD28注射相当，两者均表现出相似的氧消耗速率和细胞外酸化速率升高。

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科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

测量初始和效应 CD8 T 细胞的线粒体功能

细胞介导的淋巴细胞毒性（CML）实验可用于检测自身反应性应答，并在体外研究细胞死亡机制。然而，结合活细胞共聚焦显微镜成像技术与荧光染料，可更详细地研究细胞死亡的类型、动力学特征以及所涉及的信号通路。...

评估细胞毒性T淋巴细胞介导的β细胞死亡的方法

本视频演示了使用细胞外通量分析法评估脑血管内皮（CVE）细胞的线粒体功能。将CVE细胞接种于细胞外通量细胞培养板中。在将细胞外通量传感器装入生物分析仪前，需对其进行水合、加载及校准。随后将含有细胞的培养板装入仪器进行分析。...

评估脑血管内皮细胞中的线粒体功能

本方案描述了一种灵敏的基于细胞的细胞毒性检测方法。通过计数在效应CD8+ T细胞数量递增的情况下，存活的靶CD4+ T细胞频率的减少，该检测可直接评估抗原特异性CD8+...

基于细胞的流式细胞术检测细胞毒活性

本文介绍了一种通过免疫标记从啮齿类动物组织中分离的线粒体，并结合流式细胞术分析来检测和定量线粒体外膜蛋白的方法。该方法可进一步扩展用于评估线粒体亚群的功能特性。...

通过分离线粒体的流式细胞术对外膜蛋白进行免疫检测

本文介绍了一种用于定量活细胞中线粒体或溶酶体的强大方法。通过将特异性针对溶酶体或线粒体的荧光染料与荧光标记的表面标志物抗体相结合，利用多色流式细胞术，可在混合细胞群体（例如从组织样本中分离的原代细胞）中实现对这些细胞器的定量分析。...

基于多色流式细胞术的T细胞线粒体与溶酶体定量分析

本文介绍了一种基于流式细胞术的体内杀伤实验方法，可用于研究细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对模型肿瘤抗原应答中的免疫优势现象。我们提供了该精巧实验方法在机制研究和药物疗效评估中应用的示例。...

定制体内细胞毒性实验以研究肿瘤特异性CD8+ T细胞应答中的免疫显性

本文介绍了一种在体外培养的造血干细胞和T细胞中可靠测定线粒体质量与膜电位的方法。...

通过流式细胞术测定造血干细胞和T细胞中的线粒体质量与膜电位

代谢适应对T细胞至关重要，因其决定了T细胞的分化、存续及细胞毒性。本文介绍一种优化的用于监测线粒体呼吸的方案 离体 展示经细胞因子分化的原代人T细胞。...

细胞因子分化的原代人T细胞中线粒体呼吸的实时监测

本文描述了一种利用多孔板和自动免疫荧光成像技术，在细胞中研究线粒体DNA（mtDNA）代谢动态过程的方法，可用于检测和定量mtDNA的合成与分布。该方法可进一步用于研究各种抑制剂、细胞应激以及基因沉默对mtDNA代谢的影响。...

高通量成像法对线粒体DNA合成及分布的定量分析

本技术描述了一种有效的工作流程，利用基于荧光的活细胞成像方法，在HeLa细胞中对线粒体膜电位和超氧化物水平进行可视化及定量检测。...

基于荧光的活体成像法定量检测HeLa细胞线粒体膜电位和超氧水平

在生理相关底物浓度下研究免疫细胞线粒体生物能量学的方法有限。本文提供了一种详细方案，利用高分辨率荧光测氧法，检测人T细胞、单核细胞和外周血单个核细胞中线粒体膜电位对能量需求变化的响应。...

高分辨率荧光测氧法评估人免疫细胞线粒体膜电位的动态变化

了解如何使用Mito Stress Test技术测量初始和效应CD8 T细胞的线粒体功能与生物能量代谢。本方法通过实时分析T细胞受体信号，揭示溶血磷脂酸对T细胞代谢灵活性的调控机制，为免疫耐受研究提供重要实验手段。

测量初始和效应CD8 T细胞的线粒体功能

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