测量初始和效应CD8 T细胞的线粒体功能

我们的实验室研究淋巴细胞的免疫耐受、免疫监视以及抗原受体信号传导。我们发现溶血磷脂酸通过降低效应细胞的代谢灵活性，破坏CD8 T细胞的细胞毒性，从而促进外周耐受。我们采用多种技术来检测CD8 T细胞中线粒体代谢及能量产能能力。

我们的实验室已证明溶血磷脂酸可调节CD8 T细胞的代谢适应性，可能是T细胞表型的重要决定因素。本文所述方案可实时评估T细胞受体信号转导的功能性代谢与生物能量学。首先，向工具板的每个孔中加入200微升蒸馏水。

将传感器 cartridge 置于工具板上方，确保传感器 cartridge 的两端浸入液体中，以实现充分水合。将带有传感器 cartridge 的工具板置于 37 摄氏度的无二氧化碳培养箱中，孵育至少 10 小时。随后，取一支 50 毫升锥形管，加入 50 毫升校准液，并进行孵育。

第二天，轻弹培养板以去除蒸馏水。用 200 微升校准液重新水化培养板。将传感器盒重新安装到工具板上方，并将工具板放回非二氧化碳培养箱中。

接下来，使用多通道移液器将1000万个CD8 T细胞重悬于4.5毫升完全培养基中。在预处理过程中，每孔加入90微升细胞悬液，随后每孔再加入90微升指定的培养基。在培养板的边缘孔中加入180微升完全培养基，以防止蒸发。

然后将含有CD8 T细胞的微孔板放入无二氧化碳培养箱中。将板适配器牢固地放置在传感器盒上。孵育后，使用板适配器将寡霉素、FCCP、鱼藤酮和抗霉素A分别加入相应的加样孔中。

在开始检测前一小时，将微孔板放入无二氧化碳培养箱中。在加载微孔板前30分钟，打开软件并校准仪器分析仪。在软件系统中标记孔位并查看加样方案。

校准过程中，将传感器 cartridge 装入仪器。通过软件运行检测。如需进行额外注射，请使用额外的注射 chamber 修改注射方案。

将抗CD3和抗CD28加入传感器盒的A孔中。将寡霉素加入B孔，FCCP加入C孔，鱼藤酮和抗霉素A加入D孔。对于单独的抗CD3和抗CD28刺激，将20微升浓度为10微克/毫升的生物素化抗CD3移液至传感器盒的指定孔中。将20微升抗CD28和链霉亲和素移液至指定孔中。

对于抗CD3或CD28刺激，将生物素标记的抗CD3、抗CD28和链霉亲和素各20微升混合后，用移液器加入指定孔中。对照孔中加入培养基。对于联合抗CD3和CD28刺激，按磁珠与细胞1:1的比例，将5微升抗CD3 CD28磁珠加入含有每孔200,000个细胞的指定孔中。

准备仅含培养基的对照孔用于注射。调整每个通道中的抑制剂，以达到注射后的最终浓度。在将微孔板装入仪器前，确保注射方案已更新为相应时间点。

将软件程序设置为运行急性TCR刺激实验，总时长为140分钟。修改实验方案，在加入寡霉素（Oligomycin）前包含10个时间点的测量。使用生物素标记的抗CD3和/或抗CD28抗体联合链霉亲和素，以及抗CD3和/或CD28磁珠进行急性TCR刺激，与仅含培养基的对照组相比，可显著提高氧消耗率和细胞外酸化率。

抗CD3和CD28磁珠刺激所诱导的代谢反应与生物素标记的抗CD3和CD28注射相当，两者均表现出相似的氧消耗速率和细胞外酸化速率升高。