基于免疫组织化学与数字图像分析的子宫内膜免疫细胞定量检测平台

目前，很难将分析结果稳定在一定范围内，也难以维持实验的质量控制。我们的研究可以从免疫学角度帮助子宫内膜敏感性异常的患者寻找生殖失败的原因。

子宫内膜中免疫细胞的局部比例可被稳定且重复地检测。我们的研究结果可能推动反复种植失败患者子宫内膜容受性评估的研究进展。首先，使用镊子将子宫内膜组织从福尔马林中转移至包埋纸上。

使用直尺测量子宫内膜组织的尺寸。随后将组织包裹在包埋纸上，并放入包埋盒中。将包埋盒转移至组织篮中以进行脱水。

为了脱水子宫内膜组织，将组织篮放入脱水仪的反应室中，并启动常规组织脱水程序。脱水完成后，打开脱水仪的反应室，取出组织篮。首先，选择一个与脱水后的子宫内膜标本大小相匹配的适当包埋模具。

加入70摄氏度加热的石蜡。立即将脱水的人子宫内膜组织放入模具中。使用镊子仔细调整组织，确保其位于中央位置。

现在将模具转移至冷却板上，当底部的石蜡凝固时，用镊子轻轻按压组织。将包埋盒置于模具上方，并在其顶部添加更多石蜡。然后将模具重新放回冷却板上。

待石蜡完全凝固后，从模具中取出蜡块及其附带的包埋盒。进行切片时，将蜡块安装到切片机的样品夹上。将刀片放入刀架中，并调节蜡块平面与刀片之间的角度。

现在将切片厚度调整为四微米。然后转动手动轮开始切片。从包埋块上切下薄片，以暴露合适的组织表面。

使用毛笔收集连续且完整的切片。获得足够数量的切片后，用镊子去除前端不合格的切片。用毛笔将切片转移至预热至 42 摄氏度的温水浴中。

当切片完全展平后，使用防脱片载玻片将其提起。随后，在65摄氏度的玻片烘箱中烘烤超过60分钟，然后取出。首先，将稀释后的抗体溶液转移至专用试剂瓶中。

将检测试剂盒插入全自动免疫组化染色仪的试剂仓中。然后，将带有切片子宫内膜组织的玻片放置在玻片架上，并用专用盖片覆盖。接着，将玻片架插入仪器的实验反应仓中。

当仪器自动识别试剂和玻片上的信息后，按下启动按钮以开始免疫组织化学染色。染色完成后，取出玻片架。将染色后的玻片放入玻片架中，用清水冲洗以去除残留的染料。

现在，将载玻片架放入自动封片机中，运行脱水和封片程序。待脱水和封片完成后，取出载玻片。首先，将带有免疫组织化学染色子宫内膜切片的载玻片放置在全景病理图像扫描仪的载玻片架上。

然后将载架放入仪器的玻片扫描室中以开始扫描。扫描完成后，启动图像分析软件并创建一个新文件夹。导入需要分析的图像。

为了构建组织分类器，需标记多种组织以及空白区域注释，以建立能够识别组织和空白区域的分类器。在标记注释过程中，使用实时调优功能观察软件的识别能力。为了构建分析算法，选择软件中的标准多重免疫组化（IHC）算法，并选择阴性和阳性像素，以设定细胞识别的颜色参数。

确定细胞核、细胞质和细胞膜的参数，直至找到图像的最佳参数。现在，设置阳性细胞识别阈值，并优化该阈值，直到获得合适的阈值。接下来，在算法中选择组织分类器。

检查其中的组织部分，根据组织类型识别细胞。选择分析区域，然后使用已建立的算法分析图像。分析完成后，手动检查组织识别、阴性识别和阳性识别的准确性。

如果图像识别不准确，请再次调整算法和参数阈值。运行图像分析直至成功，然后导出分析结果。

根据不同的子宫内膜免疫标志物的表达设置相应的分析参数。使用软件计算子宫内膜免疫细胞的比例。计算完成后，利用所得数值评估复发性流产患者子宫内膜中各类免疫细胞的水平。

根据各类免疫细胞对不同标志物的特异性表达，采用免疫组织化学染色法对它们进行染色。棕色染色代表阳性免疫细胞，蓝色代表细胞核。在复发性流产女性中观察到不同免疫细胞的表达。

CD56细胞似乎占主导地位，比例为16.76%，而CD1a和Foxp3细胞占免疫细胞群体的比例为0.11%至0.12%。