野生型阻断PCR联合Sanger测序法检测低频体细胞突变

我们致力于研究癌症组织中的低频体细胞突变。本文介绍了基于Sanger测序的低频突变检测方法在血管免疫母细胞性淋巴瘤检测中的应用，为将该方法推广至其他疾病检测提供了依据。目前，已有的低频突变检测方法包括定量PCR、数字PCR和高通量测序（NGS）。

但目前尚无基于Sanger测序技术检测IGHV7-3低频突变的报道，该方法的检测下限通常仅为5%至20%，且由于技术局限性，基于Sanger测序的低频突变检测通常无法实现准确定量。我们的技术具有高灵敏度、低成本和强灵活性，是低频突变检测的理想选择。我们计划设计假基因引物以及多重GCR引物，以探索其在血液系统疾病中的应用。

首先，准备好组织样本制备和DNA提取所需的所有试剂。在微量离心管中加入约30毫克组织，随后加入500 µL脱蜡缓冲液和20 µL蛋白酶K溶液。将微量离心管涡旋振荡至少10秒，然后置于55 °C的干式恒温器中孵育90分钟。

孵育后，将包含液体和组织的样品转移至置于收集管中的离心柱中。在16,500 ×g条件下离心5分钟，使液体分离至收集管中。随后，将收集管中的液体转移至已标记的样品管中，并根据制造商说明书进行DNA提取。

测定提取的DNA的浓度和纯度。首先，从福尔马林固定石蜡包埋组织样本中提取DNA。然后，将引物干粉在5,400至8,400 ×g离心2至3分钟，并沿引物管壁加入适当体积的双蒸水。

向50微升野生型引物储备液中加入各5微升的正向引物和反向引物，以及40微升双蒸水。混匀两到三次后，涡旋振荡离心管并短暂离心。进行聚合酶链式反应（PCR）时，将所需的试剂分别加入各反应管中。

涡旋混匀，短暂离心。将PCR管放入PCR仪中进行扩增。设置热循环程序并运行。

然后，使用2%琼脂糖对PCR产物进行凝胶电泳，以检测目标片段是否被扩增。为了纯化PCR产物，将已升至室温的Purificase I和Purificase II短暂离心，并配制纯化反应混合液。将PCR管放入PCR仪中，按照预设的参数运行仪器。

首先，进行聚合酶链式反应（PCR），以扩增从组织提取的DNA中目标区域。将测序扩增酶预混液、缓冲液和重蒸水置于室温下平衡，随后立即离心收集。准备好测序用的反应管后，将PCR管放入预设好的PCR仪中进行扩增。

然后，从PCR仪中取出产物，将反应产物避光保存于冰箱中。充分涡旋振荡磁珠。向96孔板中加入10 µL磁珠和40 µL 80%乙醇，并用封板膜密封。

将96孔板置于涡旋振荡器上，振荡10秒，以充分悬浮并混匀磁珠。随后，用橡皮筋将板固定在水平摇床中，在最大转速下振荡三至五分钟。接下来，将PCR板置于磁力架上，确保其被牢固压紧。

将支架置于 4 摄氏度环境中静置吸附 3 分钟。待微珠完成吸附后，移除封口膜并倒出废液。用 40 微升 80% 乙醇将微珠清洗两次。

倒掉废液后，将板子放在吸水纸上，轻轻拍干。将带有磁力板的吸水纸放入离心机，短暂离心，转速为 120 ×g。去除酒精后，将板子置于 60 摄氏度的烘箱中加热三至五分钟，以彻底干燥磁珠。

接下来，向孔板中加入 40 µL 纯水，并用封口膜密封。在涡旋振荡器上振荡 3 至 5 秒，然后将孔板置于水平摇床上。固定好孔板，振荡 3 至 5 分钟，以溶解纯化的测序产物。

最后，将溶解的测序产物在180 g条件下离心，并将产物用于毛细管电泳进行基因组分析。该方法可检测已知的RHOA G17V突变以及上下游引物扩增区间内的其他低频突变。此外，该方法也成功检测并正确分析了另外两个基因IDH2和JAK1中的突变。