硬质油棕种子用于基质辅助激光解吸/电离成像质谱分析的制备

我们的研究重点是利用热带生物多样性中的植物生物质。为此，对这些材料进行充分表征至关重要，以便我们能够为其提供最高价值，并提出最佳的应用方向。在本研究中，我们采用基质辅助激光解吸电离成像质谱分析（MALDI成像质谱）作为表征技术，因为这是一种非常精确的方法，能够为我们提供生物组织的分子特异性成像。

通过这些结果，我们可以全面了解该植物生物质的主要成分及其空间定位，从而指导我们从该材料中开发新产品和新工艺。然而，要获得高质量的基质辅助激光解吸电离成像质谱分析结果，关键在于具备优良的样品制备方法，这正是本研究中所描述的重点内容。技术的进步为成像质谱分析带来了诸多挑战。

植物组织尤其具有复杂的挑战性，因其具有特化的器官。对于该技术而言，样品制备至关重要。如果样品制备不当，将无法检测到信号，或会出现伪影，从而导致结果不准确。

这些方案使我们能够制备耐切割的棕榈种子的薄切片，为组织分析的分子成像提供概念验证。因此，该技术为研究这些种子印迹中存在的寡糖提供了有价值的见解。我们希望该技术能为面临类似困难的研究人员提供帮助。

该技术可有助于研究其他坚硬种子或任何难以切成薄片的生物材料。例如，若需研究坚硬种子的发育和萌发过程，本方案可作为一种有效工具。实验开始时，将三粒 Euterpe precatoria 种子和三粒 Euterpe edulis 种子浸入去离子水中，浸泡 24 小时。

24小时后，打开冷冻切片机，使温度升至零下20摄氏度。将湿润的种子从水中取出，使用切片刀将其切成两半。配制新鲜温热的10%明胶溶液，将一半种子置于模具中，并用明胶溶液填充。

在将其放入冷冻切片机之前，于零下20摄氏度冷冻两小时。使用最佳切割温度化合物（OCT）将包埋的样本固定在冷冻切片机的支撑座上，并在冷冻切片机内放置10分钟，使OCT硬化。接下来，将铜制双面胶带粘附到镀有氧化铟锡的玻璃载片（ITO载片）上。

从每个物种制备20微米厚的切片，并将其放置在粘附于ITO玻璃载片的胶带上。进行基质沉积时，将含有切片的载片置于真空干燥器中，直至其达到室温。使用修正笔在每张载片的四个角上制作教学标记，然后使用台式扫描仪扫描载片。

使用分析天平称取30毫克DHB。然后，配制1毫升由等体积甲醇和0.1%三氟乙酸组成的溶液，并将称取的DHB溶解于该溶液中。用1毫升玻璃注射器吸取DHB溶液，并将其置于流速为0.8毫升/小时的注射泵上。

使用导管将注射器连接至大气压化学电离（APCI）探针，然后将氮气连接至探针。将流速设置为 12.5 PSI。将 APCI 探针固定在 XY 轴运动平台上。

确保APCI探针的尖端位于载玻片上方四厘米处。使用绘图软件设置XY移动平台以按照模板运动，并等待平台重复该模板20次。首先，将含有基质沉积种子切片的载玻片放入质谱仪中。

加载样品图像，并使用校正笔标记在参考软件上设置教学点。然后，设置99%的数据缩减因子，保存FID文件用于后续数据校准，并保存方法。使用质谱仪软件中的“添加多边形测量区域”工具划定待分析区域。

将光栅宽度设置为 100 微米。编辑测量区域参数以指定已保存的方法，并保存成像运行。然后，开始成像采集。

在“校准物”选项卡的软件中，利用矩阵簇和已知污染物创建质量列表。然后在“校准”选项卡中打开所创建的质量列表。右键单击以打开对话框，并选择“设置锁定质量”选项。

选择高斯窗口模式，高斯展宽设为0.5，线展宽设为3.5。不勾选在线校准。将模式设为单次，阈值设为1,000，质量容差设为5 ppm。

使用该流程校准数据，并保存二维序列数据集工具。校准后，将 mis 文件打开至兼容软件中，并将归一化方式从“无归一化”更改为 RMS 或 TIC。点击“编辑”选项卡，选择自动质量过滤。

在起始质量与结束质量处分别填入您感兴趣的质量范围的最小值与最大值（单位：道尔顿），然后点击“确定”图标。在过滤后生成的列表中，选择与您感兴趣的质量值（单位：道尔顿）相对应的高亮峰。调整百分比以更清晰地查看感兴趣的区域。

单击强度标尺和颜色图例图标。在图像区域单击并拖动鼠标以定位感兴趣区域。调整透明度百分比，使信号图像与扫描切片图像背景融合生成叠加图像。

如果待检测的分析物已知，则针对每种分析物绘制其对应的质荷比（M/Z）值分布图，并保存生成的图像及平均质谱图。此处展示了通过正离子模式基质辅助激光解吸电离成像质谱（MALDI-IMS）获得的Euterpe precatoria和Euterpe edulis种子组织的质谱结果。对E. precatoria种子进行的MALDI-IMS分析显示出代表己糖寡聚体加合物的峰，且在未向基质中添加盐类的情况下获得。

鉴定出六碳糖的二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体以及多达14个单元的寡聚体。在E. edulis种子组织中也获得了相同的结果。两种样品的箱线图显示了种子胚乳中每种六碳糖寡聚体的峰强度，展示了它们的分布情况，以及高聚合度寡聚体含量略高。