Name: 基质辅助激光解吸/电离成像质谱分析用硬棕榈籽的制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T13:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: 学习MALDI成像质谱分析中硬棕榈籽样本制备方法，用于植物生物质表征研究。该技术可保持分析物原始分布，获得高质量信号与空间分辨率，助力热带生物多样性资源开发与新产物探索。

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本工作由塞拉皮尔海拉研究所（Serra-1708-15009）以及里约热内卢州卡洛斯·查加斯·菲略研究支持基金会（FAPERJ-JCNE-SEI-260003/004754/2021）资助。塞拉皮尔海拉研究所和国家科学技术发展委员会（CNPq）为 Felipe Lopes Brum 博士和 Gabriel R. Martins 博士提供了奖学金（机构能力建设计划/INT/MCTI）。研究生协调提升局（CAPES）为 Davi M. M. C. da Silva 先生提供了硕士奖学金，特此致谢。里约热内卢联邦大学生物分子质谱中心（CEMBIO-UFRJ）提供了 MALDI-IMS 分析服务，在此表示感谢；同时感谢 Alan Menezes do Nascimento 先生以及由 MCTI/SISNANO/INT-CENANO-CNPQ 项目资助编号为 442604/2019 的纳米技术材料与催化表征中心（CENANO-INT）提供的元素组成分析。

Euterpe precatoria 种子由巴西亚马孙国家研究所（Manaus，巴西）慷慨提供，Euterpe edulis 种子由巴西Resende市的Silo - Arte e Latitude Rural在工业脱果肉过程后慷慨提供。种子在室温下保存于密封的塑料盒中。
1. 基质辅助激光解吸/电离成像质谱法（MALDI-IMS）
<ol>
	<li>种子切片方案
	<ol>
		<li>将每个物种的三粒种子置于去离子水中浸泡 24 小时。</li>
		<li>次日，开启冷冻切片机（见材料表），并使其温度降至 -20 °C。</li>
		<li>将吸水后的种子从水中取出，使用切片刀（见材料表）将种子切成两半。</li>
		<li>配制新鲜的温热（10%）明胶溶液（见材料表）。</li>
		<li>将半粒种子置于模具中，并用新配制的明胶填充，于 -80 °C 冷冻 2 小时，随后转移至冷冻切片机中。</li>
		<li>使用最佳切割温度包埋剂（OCT，见材料表）将包埋好的种子固定在冷冻切片机的样品台上，在冷冻切片机内静置 10 分钟，使 OCT 固化。</li>
		<li>在镀有氧化铟锡的载玻片（ITO 载玻片；见材料表）上贴附双面铜导电胶带（见材料表）。</li>
		<li>对每个物种制备厚度为 20 µm 的切片，并将其贴附于粘在 ITO 载玻片上的双面铜导电胶带上。 
		&#8203;注意：此时收集在载玻片上的切片可保存于 -80 °C 冰箱中；也可直接进行基质沉积。载玻片必须放入专用载玻片盒中，通入氮气（N2），并用封膜密封，以防止样品氧化（见材料表）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>基质沉积
	<ol>
		<li>将含有切片的载玻片放入真空干燥器中，直至其恢复至室温。</li>
		<li>使用修正液在每张载玻片的四个角做教学标记，然后使用平板扫描仪进行扫描，分辨率设置为4,800 ppi。</li>
		<li>使用分析天平称取 30 mg 的 2,5-二羟基苯甲酸（DHB；见材料表），并用 1 mL 甲醇:0.1% 三氟乙酸（TFA；材料表）的 1:1 溶液溶解 DHB。</li>
		<li>将 DHB 溶液注入 1 mL 玻璃注射器（见材料表）中，并将其安装至注射泵（见材料表），设置流速为 0.8 mL/h。</li>
		<li>使用 PEEK 管将注射器连接至常压化学电离（APCI）针头（见材料表）。</li>
		<li>将氮气（N2）连接至 APCI 针头，并设置流速为12.5 psi。</li>
		<li>将 APCI 针头固定在 xy 位移平台（见材料表）上，确保针头尖端距离载玻片表面4 cm。</li>
		<li>使用绘图软件（见材料表和补充图 1），设置 xy 位移平台按照预设模板运动，该模板由间距为 1 mm 的水平平行线组成。</li>
		<li>为完成基质沉积，等待 xy 位移平台重复该模板 20 次。 
		&#8203;注意：基质沉积必须在化学通风橱中进行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>成像采集
	<ol>
		<li>将载玻片放入质谱仪中（见材料表）。</li>
		<li>利用修正液标记，在参考软件中（见材料表）设定教学定位点。</li>
		<li>在软件中设置激光功率（60%）、激光聚焦（中等）、打孔次数（100）和极性（见材料表）。设置99% 数据压缩因子，并保存 FID 文件以供后续数据校准。保存该方法。</li>
		<li>使用质谱仪软件中的“添加多边形测量区域”工具划定待分析区域。编辑测量区域参数，选择上一步保存的方法，并将扫描步长设为 100 µm（补充图 S4A）。</li>
		<li>开始成像采集。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据分析
	<ol>
		<li>利用基质簇和已知污染物，在参考软件（见材料表）的校准物选项卡中创建质量列表（补充图 S4B）。
		<ol>
			<li>在参考软件中（见材料表）打开待校准数据。在校准选项卡中，导入已创建的质量列表，右键单击打开对话框，选择设置锁定质量选项（补充图 S4C）。</li>
			<li>选择高斯窗口模式，设置0.5 高斯展宽和3.5 线展宽。不勾选在线校准。选择模式（单峰）、阈值（1,000）和质量容差（5 ppm）。通过“处理”功能校准数据，并保存二维数据工具（补充图 S4C）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>校准完成后，将数据导出至 SCiLS Lab 或其他兼容软件，并设置所需m/z值的阈值（本研究选择范围：150 至 2,500）。 
		注意：根据文件大小或计算机性能，此过程可能需要一定时间。</li>
		<li>在总离子流（TIC）和均方根（RMS）之间选择一种归一化方法。 
		注意：本分析中选择了 TIC 方法。</li>
		<li>若已知待成像分析物，可分别绘制每个分析物对应的m/z值图像，并保存生成的图像及平均谱图。 
		注意：本研究中，选择钾加合物形式的己糖寡聚体对应的m/z值进行成像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 能量色散光谱法（EDS）
<ol>
	<li>种子切片实验方案
	<ol>
		<li>在切片机上获取一片薄的种子切片（参见 材料表).</li>
		<li>使用以下参数切割种子： 500 转/分钟切割速度，100 牛顿负载荷载，以及 15 HC 钻石切片刀 （参见 材料表). 
		注意：由于纤维需牢固粘附在连接于测角仪的精密虎钳上，因此必须手动从种子中去除纤维。使用前应清洁刀片，并切割一段种子，以防止在分析过程中引入不必要的矿物质。</li>
		<li>用压缩空气清理样品，以去除切割面上所有的颗粒残留（参见 材料表).</li>
		<li>将种子切片固定在碳双面导电胶带上（参见 材料表) 在支撑材料中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分析条件
	<ol>
		<li>将带有种子部分的支撑物放入配备能谱仪（EDS）的扫描电子显微镜（SEM）真空腔室中（参见 材料表).</li>
		<li>在型号显微镜上获取电子显微照片 20 kV 加速电压 和一个 光斑尺寸 的 4.0，使用 二次电子信号 （参见 材料表), 背散射电子 （固定在极片上的固态探测器）以及这两类信号的混合物（混合），构建人工着色的图像。</li>
		<li>对于EDS谱的采集，使用一台光谱仪（参见 材料表）结合上述扫描电镜（SEM）进行。能谱仪（EDS）图像采集的条件设置与扫描电镜相同。</li>
		<li>设置 倾斜角度，仰角，以及 方位角 在 0.0, 35.0，以及 0.0分别。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据采集
	<ol>
		<li>在种子切片上选取三个不同区域，以91倍放大倍数采集数据。</li>
		<li>在采集结束时或采集过程中识别谱图中的峰。使用 确认元件步骤 手动识别峰的按钮。</li>
		<li>将每个选定区域的采集时间设置为 60 秒。将处理时间设置为 5；参数适用于 1 至 6 的处理时间范围。 
		注意：信号元素的符号是恒定的，会相互叠加，而噪声是随机的且具有破坏性。处理时间越长，噪声越低。</li>
		<li>显示显著定量结果的默认设置为高于两个标准差（sigma）。将两个标准差设为零可减少不理想的结果。</li>
		<li>对各元素的强度进行归一化处理；这是软件中的一个标准化参数（参见 材料表).</li>
		<li>要分析数据，请将其导出为 DOC 文件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据分析
	<ol>
		<li>确保准确测量峰值强度，以进行定量元素分析。</li>
		<li>重叠峰需要进行解卷积以实现更好的峰分离；必要时扣除噪声背景。</li>
		<li>当无信号重叠时，可增加增益以放大信号并提高谱图质量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

A Detailed Guide for Preparing Hard Palm Seeds for MALDI-IMS Analysis

<ol><li>Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging%3A+a+review+of+emerging+advancements+and+future+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging: a review of emerging advancements and future insights.</a> Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).</li>
<li>Heeren, R. M. A. MALDITechniques in Mass Spectrometry Imaging. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeeren%2C+RMA+%22Encyclopedia+of+Spectroscopy+and+Spectrometry%22">Encyclopedia of Spectroscopy and Spectrometry</a>. , Elsevier Ltd. (2017).</li>
<li>Shariatgorji, M., Svenningsson, P., Andrén, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging%2C+an+emerging+technology+in+neuropsychopharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging, an emerging technology in neuropsychopharmacology.</a> Neuropsychopharmacology. 39 (1), 34-49 (2014).</li>
<li>Zaima, N., Hayasaka, T., Goto-Inoue, N., Setou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry.</a> International Journal of Molecular Sciences. 11 (12), 5040-5055 (2010).</li>
<li>Qin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionisation+mass+spectrometry+imaging+%28MALDI-MSI%29+for+in+Situ+analysis+of+endogenous+molecules+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Recent advances in matrix-assisted laser desorption/ionisation mass spectrometry imaging (MALDI-MSI) for in Situ analysis of endogenous molecules in plants.</a> Phytochemical Analysis. 29 (4), 351-364 (2018).</li>
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<li>Dong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation+for+mass+spectrometry+imaging+of+plant+tissues%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Sample preparation for mass spectrometry imaging of plant tissues: a review.</a> Frontiers in Plant Science. 7, 60(2016).</li>
<li>Zhang, Y. X., Zhang, Y., Shi, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reliable+and+effective+sample+preparation+protocol+of+MALDI-TOF-MSI+for+lipids+imaging+analysis+in+hard+and+dry+cereals%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A reliable and effective sample preparation protocol of MALDI-TOF-MSI for lipids imaging analysis in hard and dry cereals.</a> Food Chemistry. 398, 133911(2023).</li>
<li>Brum, F. L., Martins, G. R., Mohana-Borges, R., da Silva, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acquisition+of+thin+sections+of+a%C3%A7a%C3%AD+%28Euterpe+oleracea+Mart.%29+seed+with+elevated+potassium+content+for+molecular+mapping+by+mass+spectrometry+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">The acquisition of thin sections of açaí (Euterpe oleracea Mart.) seed with elevated potassium content for molecular mapping by mass spectrometry imaging.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. , e9474(2023).</li>
<li>Martins, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+characterization%2C+antioxidant+and+antimicrobial+activities+of+a%C3%A7a%C3%AD+seed+%28Euterpe+oleracea+Mart.%29+extracts+containing+A-+and+B-type+procyanidins%5BTitle%5D)+AND+%22LWT%22%5BJournal%5D)">Chemical characterization, antioxidant and antimicrobial activities of açaí seed (Euterpe oleracea Mart.) extracts containing A- and B-type procyanidins.</a> LWT. 132, 109830(2020).</li>
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<li>Jorge, F. T. A., Silva, A. S. A., Brigagão, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A%C3%A7a%C3%AD+waste+valorization+via+mannose+and+polyphenols+production%3A+techno-economic+and+environmental+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Biomass+Conversion+and+Biorefinery%22%5BJournal%5D)">Açaí waste valorization via mannose and polyphenols production: techno-economic and environmental assessment.</a> Biomass Conversion and Biorefinery. , (2022).</li>
<li>Carvalho, L. M. J., Esmerino, A. A., Carvalho, J. L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jussa%C3%AD+%28Euterpe+edulis%29%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Jussaí (Euterpe edulis): a review.</a> Food Science and Technology. 42, (2022).</li>
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<li>Wu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper+adhesive+tape+attached+to+the+reverse+side+of+a+non-conductive+glass+slide+to+achieve+protein+MALDI-imaging+in+FFPE-tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Copper adhesive tape attached to the reverse side of a non-conductive glass slide to achieve protein MALDI-imaging in FFPE-tissue sections.</a> Chemical Communications. 57 (82), 10707-10710 (2021).</li>
<li>Dufresne, M., Patterson, N. H., Norris, J. L., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+salt+doping+and+matrix+sublimation+for+high+spatial+resolution+MALDI+imaging+mass+spectrometry+of+neutral+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Combining salt doping and matrix sublimation for high spatial resolution MALDI imaging mass spectrometry of neutral lipids.</a> Analytical Chemistry. 91 (20), 12928-12934 (2019).</li>
<li>Aguiar, M. O., de Mendonça, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morfo-anatomia+da+semente+de+Euterpe+precatoria+Mart+%28Palmae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+Brasileira+de+Sementes%22%5BJournal%5D)">Morfo-anatomia da semente de Euterpe precatoria Mart (Palmae).</a> Revista Brasileira de Sementes. 25, 37-42 (2003).</li>
<li>Panza, V., Láinez, V., Maldonado, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seed+structure+and+histochemistry+in+the+palm+Euterpe+edulis%5BTitle%5D)+AND+%22Botanical+Journal+of+the+Linnean+Society%22%5BJournal%5D)">Seed structure and histochemistry in the palm Euterpe edulis.</a> Botanical Journal of the Linnean Society. 145 (4), 445-453 (2004).</li>
<li>Alves, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Provenient+residues+from+industrial+processing+of+a%C3%A7a%C3%AD+berries+%28Euterpe+precatoria+Mart%29%3A+nutritional+and+antinutritional+contents%2C+phenolic+profile%2C+and+pigments%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Provenient residues from industrial processing of açaí berries (Euterpe precatoria Mart): nutritional and antinutritional contents, phenolic profile, and pigments.</a> Food Science and Technology. 42, (2022).</li>
<li>Inada, K. O. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+the+chemical+composition+and+occurring+antioxidants+in+jabuticaba+%28Myrciaria+jaboticaba%29+and+jussara+%28Euterpe+edulis%29+fruits+and+their+fractions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+FunctionalFoods%22%5BJournal%5D)">Screening of the chemical composition and occurring antioxidants in jabuticaba (Myrciaria jaboticaba) and jussara (Euterpe edulis) fruits and their fractions.</a> Journal of FunctionalFoods. 17, 422-433 (2015).</li>
<li>Monteiro, A. F., Miguez, I. S., Silva, J. P. R. B., Silva, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+concentration+and+yield+production+of+mannose+from+a%C3%A7a%C3%AD+%28Euterpe+oleracea+Mart.%29+seeds+via+mannanase-catalyzed+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High concentration and yield production of mannose from açaí (Euterpe oleracea Mart.) seeds via mannanase-catalyzed hydrolysis.</a> Scientific Reports. 9 (1), 10939(2019).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

植物由具有特定生化功能的特化组织构成。因此，基质辅助激光解吸电离成像质谱（MALDI-IMS）的样品制备方案必须根据具有不同理化特性的各类植物组织进行设计，因为样品需保持其原始分析物的分布和丰度，以获得高质量的信号和空间分辨率8。
在进行MALDI-IMS分析之前，首要考虑的是正确采集和储存样品。然而，在植物中，样品制备方法通常因所分析的组织类型而异。例如，植物组织中的细胞壁木质化程度和含水量可能在切片过程中带来挑战，从而难以准确保持样品形态的真实再现7。
基质辅助激光解吸电离成像质谱（MALDI-IMS）分析可分为组织制备与切片、基质包被以及数据分析的工作流程。然而，成像结果的质量和真实性直接受到样本制备方法的影响，因此样本制备是一个至关重要的步骤。本研究中所采用的样本制备方法基于先前发表的关于 E. oleracea 成熟种子的实验方案10。为了验证该切片方案在其...

基质辅助激光解吸/电离成像质谱法（MALDI-IMS）是一种强大的方法，可实现生物分子的二维定位，对可电离化合物进行非靶向分析，并确定其空间分布，尤其适用于生物样品1,2。二十多年来，该技术已实现对脂质、肽段、碳水化合物、蛋白质、其他代谢物以及合成分子（如治疗药物）的同时检测与鉴定3,4。MALDI-IMS 能够在无需提取、纯化、分离或使用标记与染色试剂的情况下，对组织样品表面进行化学分析。然而，要实现成功的分析，该技术中的一个关键步骤是样品制备，尤其是在植物组织中，由于适应环境而演化出结构复杂的多种特化器官，使得样品制备更具挑战性5。
由于植物组织固有的理化特性，在制备切片时需要采用经过优化的实验方案，以满足MALDI-IMS分析的要求，并保持组织的原始形态6,7。对于种子等非常规样品，已建立的实验方案8并不适用，因为这些组织具有坚硬的细胞壁和较低的含水量，容易导致切片破碎，进而引起化合物的移位9。
我们的研究团队已发表有关分子图谱的实验数据以及适用于巴西莓（açaí）MALDI-IMS分析的优化实验方案Euterpe oleracea （马蒂）种子10,11,12，这是在大量生产可租赁的巴西莓果浆过程中产生的副产品13开发一种用于 原位 对巴西莓种子中不同代谢物进行成像分析，有助于提出目前尚未在商业上开发的此类农业废弃物的潜在用途。然而，由于巴西莓种子具有较强的抗性，必须专门设计一种实验方案，以获得适用于基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI-IMS）分析的适当样品切片。
在此背景下，由于经济价值较高的巴西莓果肉具有类似的感官特性，这促使人们越来越多地商业化开发Euterpe属棕榈树的其他果实。目前已有两种新兴棕榈树果实被规模化工业生产，作为巴西莓的替代品14,15，分别为生长于亚马逊旱地的E. precatoria（称为亚马逊巴西莓）和典型分布于大西洋森林的E. edulis（称为胡萨拉莓）。然而，亚马逊巴西莓和胡萨拉莓的消费同样会产生大量耐性且不可食用的种子残留，这些种子迄今尚未被有效利用，其详细的化学成分也尚未得到研究。
因此，本文证明，先前设计的方案经过少量调整后，可用于通过基质辅助激光解吸电离成像质谱（MALDI-IMS）对E. precatoria和E. edulis种子进行分子图谱分析，表明该方法是一种强大的工具，可用于分析这些资源的组成成分，并有助于确定其潜在的生物技术应用价值。此外，本文提供的详细描述可帮助其他研究者解决在制备耐性材料用于MALDI-IMS分析过程中遇到的类似困难。

<table><tbody><tr><td>1 mL 气密注射器型号 1001 TLL，PTFE 鲁尔锁</td><td>Hamilton Company</td><td>81320</td><td></td></tr><tr><td>2,5-二羟基苯甲酸</td><td>Sigma Aldrich Co, MO, USA</td><td>149357</td><td></td></tr><tr><td>APCI 针头</td><td>Bruker Daltonik, Bremen, 德国</td><td>602193</td><td></td></tr><tr><td>AxiDraw V3 xy 运动平台</td><td>Evil Mad Scientist, CA, 美国</td><td>2510</td><td></td></tr><tr><td>双面碳导电胶带</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Compass 数据分析软件&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>质谱列表生成</td></tr><tr><td>压缩空气</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>双面铜导电胶带</td><td>3M, 美国</td><td>1182-3/4&quot;X18YD</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机 CM 1860 UV</td><td>Leica&amp;nbsp; Biosystems, Nussloch, 德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>金刚石切片刀片 15 HC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Everhart-Thornley 检测器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlexImaging</td><td>Bruker Daltonik, Bremen, 德国</td><td></td><td>图像采集</td></tr><tr><td>FTMS 数据处理</td><td>Bruker Daltonik, Bremen, 德国</td><td></td><td>数据校准</td></tr><tr><td>牛皮明胶</td><td>Sigma Aldrich Co, MO, 美国</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>Leica 818 高剖面切片刀</td><td>Leica&amp;nbsp; Biosystems, Nussloch, 德国</td><td>0358 38926</td><td></td></tr><tr><td>氧化铟锡涂层玻璃载玻片</td><td>Bruker Daltonik, Bremen, 德国</td><td>8237001</td><td></td></tr><tr><td>Inkscape</td><td>Inkscape Project c/o Software Freedom Conservancy, NY, 美国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IsoMet 1000 精密切割机</td><td>Buehler, Illinois, 美国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>J.T.Baker</td><td>9093-03</td><td></td></tr><tr><td>超纯水（Milli-Q 水）</td><td></td><td></td><td>18.2 M&amp;Omega;.cm</td></tr><tr><td>油封真空泵</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>最佳切割温度包埋剂（Optimal Cutting Temperature Compound）</td><td>Fisher HealthCare, Texas, 美国</td><td>4585</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm &quot;M&quot; 密封膜</td><td>Amcor</td><td>HS234526B</td><td></td></tr><tr><td>Quanta 450 FEG</td><td>FEI Co, Hillsboro, OR, 美国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SCiLS Lab（多厂商支持）质谱软件&amp;nbsp;</td><td>Bruker Daltonik, Bremen, 德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>INCA Suite 4.14 V 软件</td><td>Oxford Instruments, Abingdon, 英国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solarix 7T</td><td>Bruker Daltonik, Bremen, 德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>注射泵</td><td>kdScientific, MA, 美国</td><td>78-9100K</td><td></td></tr><tr><td>三氟乙酸</td><td>Sigma Aldrich Co, MO, 美国</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>X-Max 能谱仪</td><td>Oxford Instruments, Abingdon, 英国</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

硬质油棕种子用于基质辅助激光解吸/电离成像质谱分析的制备

Preparation of Hard Palm Seeds for Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Imaging Mass Spectrometry Analysis

基质辅助激光解吸/电离成像质谱法（MALDI-IMS）可用于在原始环境中鉴定化合物。目前，MALDI-IMS 已广泛应用于临床分析。然而，该技术在植物组织中用于解析化学化合物生理信息方面仍具有广阔的应用前景。但是，由于 MALDI-IMS 需要制备薄切片（12–20 µm）以实现有效的数据采集和成功分析，因此从植物材料中制备特定样品可能具有挑战性。为此，我们此前已建立了一种样品制备方案，用于获得巴西莓棕榈（Euterpe oleracea）硬种子的薄切片，从而实现其分子分布的 MALDI-IMS 成像分析。
在此，我们证明所开发的方案适用于制备同属其他种子的样品。简言之，该方案基于将种子浸入去离子水中24小时，用明胶包埋样品，并在恒温冷冻切片机中进行切片。随后，在基质沉积过程中，将一个XY运动平台与电喷雾电离&#160;使用含0.1%三氟乙酸的1:1（v/v）2,5-二羟基苯甲酸（DHB）甲醇溶液（30 mg/mL）进行电喷雾电离（ESI）针尖喷雾。 E. precatoria 和 E. edulis 使用软件对种子数据进行处理，以绘制其代谢物图谱。
在样品切片中对己糖寡聚物进行了成像，以验证该方案对这些样品的适用性，因为已知这些种子含有大量甘露聚糖，即由己糖甘露糖组成的聚合物。结果鉴定出己糖寡聚物的峰，表现为[M + K]+加合物（Δ = 162 Da）。因此，先前为刺葵（E. oleracea）种子专门开发的样品制备方案，同样适用于另外两种坚硬棕榈种子的基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI-IMS）分析。简而言之，该方法可成为植物材料形态解剖学和生理学研究的有力工具，尤其适用于抗切割样品的研究。

所设计的方案实现了MALDI-IMS分析 E. precatoria 和 E. edulis 种子。因此，我们能够通过分子量和聚合度（DP）确认碳水化合物的部分结构。MALDI-IMS 分析提供的分子信息（图1 和 图2) 出现了代表[M+K]的峰+ 六碳糖寡聚物加合物（Δ = 162 Da），无需向基质中添加盐。六碳糖二聚体（m/z 381），三聚体（m/z 543），四聚体（m/z 705）、五聚体（pentamers）（m/z 867），六聚体（m/z 1029）以及最多达14个单元的寡聚体（m/z 2325）在两种种子组织中均被鉴定出。两个样本的箱线图（图3) 表示在种子胚乳中检测到的每种己糖寡糖的峰强度，展示了它们的分布情况以及高聚合度（DP）寡糖含量略...

本方案旨在详细阐述如何制备低含水量硬质种子样品切片，用于基质辅助激光解吸电离成像质谱（MALDI-IMS）分析，在保持分析物原始分布和丰度的同时，提供高质量的信号和空间分辨率。

基质辅助激光解吸/电离成像质谱法（MALDI-IMS）被用于在原始环境中鉴定化合物。

我们的研究重点是利用热带生物多样性中的植物生物质。为此，对这些材料进行充分表征至关重要，以便我们能够为其提供最高价值，并提出最佳的应用方向。在本研究中，我们采用基质辅助激光解吸电离成像质谱分析（MALDI成像质谱）作为表征技术，因为这是一种非常精确的方法，能够为我们提供生物组织的分子特异性成像。通过这些结果，我们可以全面了解该植物生物质的主要成分及其空间定位，从而指导我们从该材料中开发新产品和新工艺。然而，要获得高质量的基质辅助激光解吸电离成像质谱分析结果，关键在于具备优良的样品制备方法，这正是本研究中所描述的重点内容。技术的进步为成像质谱分析带来了诸多挑战。植物组织尤其具有复杂的挑战性，因其具有特化的器官。对于该技术而言，样品制备至关重要。如果样品制备不当，将无法检测到信号，或会出现伪影，从而导致结果不准确。这些方案使我们能够制备耐切割的棕榈种子的薄切片，为组织分析的分子成像提供概念验证。因此，该技术为研究这些种子印迹中存在的寡糖提供了有价值的见解。我们希望该技术能为面临类似困难的研究人员提供帮助。该技术可有助于研究其他坚硬种子或任何难以切成薄片的生物材料。例如，若需研究坚硬种子的发育和萌发过程，本方案可作为一种有效工具。实验开始时，将三粒 Euterpe precatoria 种子和三粒 Euterpe edulis 种子浸入去离子水中，浸泡 24 小时。24小时后，打开冷冻切片机，使温度升至零下20摄氏度。将湿润的种子从水中取出，使用切片刀将其切成两半。配制新鲜温热的10%明胶溶液，将一半种子置于模具中，并用明胶溶液填充。在将其放入冷冻切片机之前，于零下20摄氏度冷冻两小时。使用最佳切割温度化合物（OCT）将包埋的样本固定在冷冻切片机的支撑座上，并在冷冻切片机内放置10分钟，使OCT硬化。接下来，将铜制双面胶带粘附到镀有氧化铟锡的玻璃载片（ITO载片）上。从每个物种制备20微米厚的切片，并将其放置在粘附于ITO玻璃载片的胶带上。进行基质沉积时，将含有切片的载片置于真空干燥器中，直至其达到室温。使用修正笔在每张载片的四个角上制作教学标记，然后使用台式扫描仪扫描载片。使用分析天平称取30毫克DHB。然后，配制1毫升由等体积甲醇和0.1%三氟乙酸组成的溶液，并将称取的DHB溶解于该溶液中。用1毫升玻璃注射器吸取DHB溶液，并将其置于流速为0.8毫升/小时的注射泵上。使用导管将注射器连接至大气压化学电离（APCI）探针，然后将氮气连接至探针。将流速设置为 12.5 PSI。将 APCI 探针固定在 XY 轴运动平台上。确保APCI探针的尖端位于载玻片上方四厘米处。使用绘图软件设置XY移动平台以按照模板运动，并等待平台重复该模板20次。首先，将含有基质沉积种子切片的载玻片放入质谱仪中。加载样品图像，并使用校正笔标记在参考软件上设置教学点。然后，设置99%的数据缩减因子，保存FID文件用于后续数据校准，并保存方法。使用质谱仪软件中的“添加多边形测量区域”工具划定待分析区域。将光栅宽度设置为 100 微米。编辑测量区域参数以指定已保存的方法，并保存成像运行。然后，开始成像采集。在“校准物”选项卡的软件中，利用矩阵簇和已知污染物创建质量列表。然后在“校准”选项卡中打开所创建的质量列表。右键单击以打开对话框，并选择“设置锁定质量”选项。选择高斯窗口模式，高斯展宽设为0.5，线展宽设为3.5。不勾选在线校准。将模式设为单次，阈值设为1,000，质量容差设为5 ppm。使用该流程校准数据，并保存二维序列数据集工具。校准后，将 mis 文件打开至兼容软件中，并将归一化方式从“无归一化”更改为 RMS 或 TIC。点击“编辑”选项卡，选择自动质量过滤。在起始质量与结束质量处分别填入您感兴趣的质量范围的最小值与最大值（单位：道尔顿），然后点击“确定”图标。在过滤后生成的列表中，选择与您感兴趣的质量值（单位：道尔顿）相对应的高亮峰。调整百分比以更清晰地查看感兴趣的区域。单击强度标尺和颜色图例图标。在图像区域单击并拖动鼠标以定位感兴趣区域。调整透明度百分比，使信号图像与扫描切片图像背景融合生成叠加图像。如果待检测的分析物已知，则针对每种分析物绘制其对应的质荷比（M/Z）值分布图，并保存生成的图像及平均质谱图。此处展示了通过正离子模式基质辅助激光解吸电离成像质谱（MALDI-IMS）获得的Euterpe precatoria和Euterpe edulis种子组织的质谱结果。对E. precatoria种子进行的MALDI-IMS分析显示出代表己糖寡聚体加合物的峰，且在未向基质中添加盐类的情况下获得。鉴定出六碳糖的二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体以及多达14个单元的寡聚体。在E. edulis种子组织中也获得了相同的结果。两种样品的箱线图显示了种子胚乳中每种六碳糖寡聚体的峰强度，展示了它们的分布情况，以及高聚合度寡聚体含量略高。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

基质辅助激光解吸/电离成像质谱分析用硬棕榈籽的制备

精确质量测定是蛋白质研究过程中的重要步骤。基质辅助激光解吸/电离（MALDI）质谱（MS）可用于此类测定，其主要优势在于对盐类、去污剂和污染物具有良好的耐受性。本文展示了一种利用MALDI-MS分析分子量大于100...

基质辅助激光解吸/电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱法分析完整蛋白质（分子量大于100 kDa）

此前已有报道称，二蒽醇（DT；1,8-二羟基-9,10-二氢蒽-9-酮）可作为小分子组织成像的基质辅助激光解吸电离（MALDI）基质；本文提供了在超高清分辨率四极杆-傅里叶变换离子回旋共振（quadrupole-FTICR）仪器上，采用正离子模式MALDI-MS技术，利用DT对组织切片表面内源性脂质进行MALDI成像的实验方案 。...

使用二蒽醇作为基质在傅里叶变换离子回旋共振质谱仪上进行基质辅助激光解吸/电离成像

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三维细胞培养模型质谱成像的样品制备策略

通过结合中红外激光解吸与电喷雾后电离技术，开发了一种在常压下运行的质谱成像（MSI）离子源。采用外源性冰基质作为吸能介质，以促进组织相关物质的共振解吸。本文提供了对新生小鼠整体进行红外基质辅助激光解吸电喷雾电离质谱成像（IR-MALDESI...

基于红外基质辅助激光解吸电喷雾电离（IR-MALDESI）的全身体质谱成像

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通过基质辅助激光解吸电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱法表征合成聚合物

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利用基质辅助激光解吸/电离成像质谱法可视化人脑中的淀粉样蛋白β沉积

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