Name: 假型病毒作为通过中和测定监测针对 SARS-CoV-2 的体液免疫反应的分子工具 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-21T12:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: 了解利用假型病毒技术进行SARS-CoV-2中和抗体检测的方法。该方法采用三质粒系统在HEK 293T细胞中生产假病毒，为疫苗接种后体液免疫监测提供安全可靠的替代方案。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢医护人员志愿者的贡献。本项目由意大利大学与科研部（MUR）2023/2027 年卓越部门计划资助。AR 和 DZ 获得了 PRIN2022 项目（欧盟资金；NextGenerationEU）的支持

本方案已获得维罗纳大学伦理委员会批准，并遵循其指南（批准协议编号 1538）。已从参与研究的人类受试者获得知情书面同意。全血样本采集自正在接种抗 SARS-CoV-2 疫苗的医护人员（HCW）志愿者。这些样本采集于含有抗凝剂的塑料管中，用于后续血清的分离15。
以下所有操作均须在二级生物安全柜中进行，并在无菌条件下操作。病毒操作必须小心谨慎，所有废弃物必须用稀释的漂白剂溶液进行中和处理。本实验方案的总体流程见图1。
<img alt="SARS-CoV-2 假病毒感染实验示意图、细胞感染过程、数据分析结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65658/65658fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图 1：中和实验的图示。（A）假病毒（PV）制备，（B）假病毒滴定，以及（C）中和实验。所有操作均在二级生物安全柜中无菌条件下进行。在进行中和实验（C）之前，必须通过滴定步骤（B）标准化假病毒的感染活性水平。本图使用 BioRender 绘制。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65658/65658fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
1. SARS-CoV-2 假病毒的制备与感染性检测
<ol>
	<li>在6孔板（6WP）中接种5 × 105个HEK293T细胞，使用完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM，高糖，10%胎牛血清（FBS），1% L-谷氨酰胺，1%青霉素/链霉素），使细胞密度适合所用转染试剂的要求。若使用聚乙烯亚胺（PEI）进行转染（按制造商说明配制试剂），确保转染当天细胞密度达到40–60%。将细胞置于37 °C、5% CO2的加湿培养箱中培养。</li>
	<li>转染前，将用过的细胞培养基更换为不含抗生素的新鲜培养基（DMEM，高糖，10% FBS，1% L-谷氨酰胺），以提高转染效率。 
	注意：接种后第二天，HEK293T细胞即可进行转染。</li>
	<li>根据制造商说明，使用合适的转染试剂对贴壁生长的HEK293T细胞进行转染。若使用PEI，请配制两种混合液，并按以下步骤操作。
	<ol>
		<li>配制混合液A：在100 µL低血清培养基中加入500 ng pCMV-dR8.91包装质粒16、750 ng pCSFLW报告基因质粒16以及450 ng表达SARS-CoV-2刺突蛋白的质粒。</li>
		<li>配制混合液B：在100 µL低血清培养基中加入17.5 µL PEI（浓度：1 mg/mL）。</li>
		<li>将两种混合液在室温（RT）孵育5分钟。随后，将混合液B（含PEI）加入混合液A（含DNA）中，轻轻混匀。</li>
		<li>在室温下孵育20–30分钟，每隔3–4分钟轻弹管壁以促进混合。最后，将混合液加入HEK293T细胞中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>转染后16–20小时，更换为新鲜的完全DMEM培养基，在37 °C、5% CO2条件下继续培养，使转染细胞产生假病毒（PVs）。</li>
	<li>转染后72小时，收集含有假病毒的上清液。在室温下以1600 ×g离心7分钟，去除细胞碎片和死亡细胞，然后通过0.45 µm醋酸纤维素滤膜过滤。</li>
	<li>可选步骤：为提高最终假病毒滴度的产量，可进行多次转染，合并含有假病毒的培养上清，并使用浓缩管进行浓缩。</li>
	<li>可直接进行后续步骤（“假病毒滴定”，第2节），或将含假病毒的培养基分装至合适离心管中，于-80 °C保存备用。另准备一份400–500 µL的分装样品用于滴定。 
	注意：分装保存可避免反复冻融，确保不同实验间的可重复性。</li>
</ol>
2. PVs 滴定
<ol>
	<li>使用含有PV的新鲜培养基进行后续步骤，或解冻用于检测的分装样品（步骤1.7），以对新制备的病毒原液进行滴定。将同一PV原液分装后冷冻保存可确保实验的可重复性。</li>
	<li>向96孔板（96WP）中所有用于检测病毒原液的孔内加入50 µL完全DMEM（或与所用靶细胞系相容的完全培养基），每种样品设两个复孔，并保持A行为空白。向A行各孔加入100 µL PV原液。根据待测样品的数量，预留一列不加病毒作为“仅细胞”对照（图2）。</li>
	<li>用移液器将A行中的50 µL液体转移至B行，依次操作至G行，以获得原液的系列稀释。弃去最后一行多余的液体体积。</li>
	<li>去除旧培养基后，用DPBS 1x洗涤细胞两次，随后使用含1x胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）的Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS 1x）消化细胞使其脱落。将细胞重悬并调整密度至4 × 105 个细胞/mL。 
	注：本实验中，PV感染在易感细胞系HEK293T/ACE2上进行检测；该细胞系来源于HEK293T细胞，通过慢病毒载体转导使其表达ACE2受体。</li>
	<li>向每个孔中加入50 µL细胞悬液，确保每孔细胞数量为2 × 104 个。</li>
	<li>在37 °C、5% CO2条件下孵育48小时。</li>
	<li>孵育结束后，按照试剂盒说明书进行荧光素酶检测。向各孔加入100 µL荧光素酶检测试剂，室温避光孵育2分钟。将每孔内容物转移至黑色96孔板（需与所用酶标仪兼容），并在96孔板读数仪中读取发光值。 
	注：用于检测荧光素酶信号的发光仪将生成包含原始未处理数据的电子表格文件，用于后续分析（本例中为Excel文件）。病毒的感染性将以相对发光单位（RLU）表示（详见第4.1节）。</li>
</ol>
<img alt="SARS-CoV-2 PV 连续稀释示意图，96孔板设置，病毒感染研究，细胞培养。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65658/65658fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：用于PV滴定的96孔板代表性布局。 将固定体积的含PV上清液加入A行第1-11列，并进行连续稀释。最后一列留作“仅细胞”对照。本图使用BioRender绘制。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65658/65658fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
3. 中和实验
<ol>
	<li>将患者的血清在冰上解冻。通过在 56 °C 孵育 30 分钟以灭活血清样本。</li>
	<li>在 96 孔板中，向以下各孔中每孔加入 50 µL 新鲜的完全 DMEM 培养基（或与所用靶细胞系相容的完全培养基）：从 B 行（第 1–10 列）至 H 行（第 1–10 列）。在 A 行（第 1–10 列）每孔加入 95 µL 新鲜的完全 DMEM 培养基。在第 11 列和第 12 列的孔中分别加入 50 µL 和 100 µL 完全 DMEM 培养基。这些孔将分别作为感染对照（病毒对照，VC）和未感染对照（仅细胞，CC）（图 3）。</li>
	<li>在 A 行（第 1–10 列）每孔加入 5 µL 热灭活的血清/血浆样本。每个样本设两个复孔。使用多通道移液器混匀第一行中的样本，然后将含有血清的培养基从 A 行转移 50 µL 至 B 行。重复此操作直至最后一行（图 3）。弃去剩余的 50 µL。</li>
	<li>解冻所需数量的假病毒（PV）分装样品，并稀释至 ≥ 104 RLU/mL。使用多通道移液器向每孔（第 1 至第 11 列）加入 50 µL 含稀释后假病毒的培养基，使热灭活血清/血浆与病毒的终体积比为 1:1。在 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育 1 小时，使血清样本中的抗体与假病毒表面的 SARS-CoV-2 刺突蛋白结合。</li>
	<li>准备至少 5 mL 易感细胞（HEK293T/ACE2）悬液，细胞密度为 4 × 105 个细胞/mL。向每孔加入 50 µL 细胞悬液，并在 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育 48 小时。</li>
	<li>孵育结束后，按照制造商说明书进行荧光素酶检测读数，具体操作如步骤 2.7 所述。 
	注意：用于荧光素酶检测的发光仪将生成一个包含原始未处理数据的电子表格文件（本例中为 .xlsx 格式），用于后续分析（即荧光素酶检测文件）。</li>
</ol>
<img alt="用于ELISA实验中血清分析的连续稀释微孔板示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65658/65658fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：基于血清稀释的微孔板示意图。 鲜红色代表较高浓度的血清，亮蓝色列（第11列）代表感染细胞对照（VC，病毒对照），浅蓝色列（第12列）代表未感染细胞（CC，细胞对照）。本图使用BioRender绘制。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65658/65658fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
4. 滴定分析
<ol>
	<li>在荧光素酶检测文件中，将名称/标题分配给相应的样品。</li>
	<li>将RLU测量值乘以稀释倍数（从网格顶部到底部：20x、40x、80x、160x、320x、640x、1,280x、2,560x），得到RLU/mL。如果使用了不同的稀释倍数，请相应调整乘数。</li>
	<li>计算每种PV制备物的平均RLU/mL。</li>
</ol>
5. PVs 中和实验分析
<ol>
	<li>在荧光素酶检测的电子表格文件（本例中为 .xlsx 格式）中，为待测样品分配相应的标题。输入样品的稀释倍数（40倍、80倍、160倍、320倍、640倍、1,280倍、2,560倍、5,120倍）。计算稀释倍数的 Log10 值。</li>
	<li>计算未感染对照组和感染对照组的平均 RLU 值（图3，分别为第11列和第12列）。这些数值将在步骤5.5的归一化处理中使用。</li>
	<li>新建一个用于数据分析的文档。选择 X/Y 分析，将 X 设为 数值，Y 设为 在并列的子列中输入两份重复值。</li>
	<li>将 Log10（稀释倍数）值作为 X 数值输入，将样品的两份重复 RLU 值输入 Y 列。</li>
	<li>转到 分析 &gt; 归一化 &gt; 全选 当前工作表中的所有样品。在 0% 如何定义？ 和 100% 如何定义？ 中分别输入平均 VC 和 CC 值，然后点击 确定。</li>
	<li>在归一化后的数据表中，转到 分析 &gt; XY 分析 &gt; 非线性分析（曲线拟合）。选中所有样品后点击 确定。在 剂量-反应 - 抑制 类型中，选择 log(抑制剂) 对归一化响应 - 可变斜率。</li>
	<li>在 约束条件 下，将 HillSlope 更改为 必须小于 0。</li>
	<li>在 输出 选项中，勾选 生成汇总表和图表，然后点击 确定 以获得最终分析结果。补充文件1 中提供了包含分析模板的工作表。</li>
</ol>

Assessing Serum Neutralization Against SARS-CoV-2 with Pseudotyped Viruses

<ol><li>Ozaki, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+technology+transfer+of+a+GCLP-compliant+HIV-1+neutralizing+antibody+assay+for+human+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">International technology transfer of a GCLP-compliant HIV-1 neutralizing antibody assay for human clinical trials.</a> Plos One. 7 (1), e30963(2012).</li>
<li>Pouget, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+liposomes+to+study+the+effect+of+Mycobacterium+tuberculosis+lipids+on+HIV-1+cis-+and+trans-infections%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Generation of liposomes to study the effect of Mycobacterium tuberculosis lipids on HIV-1 cis- and trans-infections.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1945(2021).</li>
<li>McKay, L. G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HCV+envelope+glycoprotein+down-modulates+NF-%CE%BAB+signalling+and+associates+with+stimulation+of+the+host+endoplasmic+reticulum+stress+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The HCV envelope glycoprotein down-modulates NF-κB signalling and associates with stimulation of the host endoplasmic reticulum stress pathway.</a> Frontiers in Immunology. 13, 831695(2022).</li>
<li>Xiang, Q., Li, L., Wu, J., Tian, M., Fu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+pseudovirus+system+in+the+development+of+vaccine%2C+antiviral-drugs%2C+and+neutralizing+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiological+Research%22%5BJournal%5D)">Application of pseudovirus system in the development of vaccine, antiviral-drugs, and neutralizing antibodies.</a> Microbiological Research. 258, 126993(2022).</li>
<li>Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+on+the+development+of+pseudoviruses+for+enveloped+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses.</a> Reviews in Medical Virology. 28, e1963(2018).</li>
<li>D'Apice, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+the+neutralizing+activity+against+SARS-CoV-2+Wuhan-Hu-1+strain+and+variants+of+concern%3A+Performance+evaluation+of+a+pseudovirus-based+neutralization+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of the neutralizing activity against SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 strain and variants of concern: Performance evaluation of a pseudovirus-based neutralization assay.</a> Frontiers in Immunology. 13, 981693(2022).</li>
<li>Falzarano, D., Groseth, A., Hoenen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+reporter-expressing+mononegaviruses%3A+current+challenges+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Development and application of reporter-expressing mononegaviruses: current challenges and perspectives.</a> Antiviral Research. 103, 78-87 (2014).</li>
<li>Gutierrez-Guerrero, A., Cosset, F. -L., Verhoeyen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vector+pseudotypes%3A+Precious+tools+to+improve+gene+modification+of+hematopoietic+cells+for+research+and+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vector pseudotypes: Precious tools to improve gene modification of hematopoietic cells for research and gene therapy.</a> Viruses. 12, 1016(2020).</li>
<li>Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiply+attenuated+lentiviral+vector+achieves+efficient+gene+delivery+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo.</a> Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).</li>
<li>Dull, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+third-generation+lentivirus+vector+with+a+conditional+packaging+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system.</a> Journal of Virology. 72 (11), 8463-8471 (1998).</li>
<li>Berkhout, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Fourth+generation+lentiviral+Vector%3A+Simplifying+genomic+gymnastics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">A Fourth generation lentiviral Vector: Simplifying genomic gymnastics.</a> Molecular Therapy. 25 (8), 1741-1743 (2017).</li>
<li>Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+a+pseudovirus-luciferase+assay+for+rapid+and+quantitative+detection+of+neutralizing+antibodies+against+Enterovirus+71%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of a pseudovirus-luciferase assay for rapid and quantitative detection of neutralizing antibodies against Enterovirus 71.</a> Plos One. 8 (6), e64116(2013).</li>
<li>Ferrara, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+lentiviral+vectors+pseudotyped+with+Influenza+B+hemagglutinins%3A+application+in+vaccine+immunogenicity%2C+mAb+potency%2C+and+sero-surveillance+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Development of lentiviral vectors pseudotyped with Influenza B hemagglutinins: application in vaccine immunogenicity, mAb potency, and sero-surveillance studies.</a> Frontiers in Immunology. 12, 661379(2021).</li>
<li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+cell-based+pseudovirus+entry+assay+to+identify+potential+viral+entry+inhibitors+and+neutralizing+antibodies+against+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Diseases%22%5BJournal%5D)">Development of cell-based pseudovirus entry assay to identify potential viral entry inhibitors and neutralizing antibodies against SARS-CoV-2.</a> Genes & Diseases. 7 (4), 551-557 (2020).</li>
<li>Dalle Carbonare, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serology+study+after+BTN162b2+vaccination+in+participants+previously+infected+with+SARS-CoV-2+in+two+different+waves+versus+na%C3%AFve%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Medicine%22%5BJournal%5D)">Serology study after BTN162b2 vaccination in participants previously infected with SARS-CoV-2 in two different waves versus naïve.</a> Communications Medicine. 1 (1), 38(2021).</li>
<li>Di Genova, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production%2C+titration%2C+neutralisation%2C+storage+and+lyophilisation+of+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+2+%28SARS-CoV-2%29+lentiviral+pseudotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Production, titration, neutralisation, storage and lyophilisation of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) lentiviral pseudotypes.</a> Bio-protocol. 11 (21), e4236(2021).</li>
<li>Chmielewska, A. M., Czarnota, A., Bieńkowska-Szewczyk, K., Grzyb, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+response+against+SARS-CoV-2+variants%3A+The+role+of+neutralization+assays%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Vaccines%22%5BJournal%5D)">Immune response against SARS-CoV-2 variants: The role of neutralization assays.</a> NPJ Vaccines. 6 (1), 1-8 (2021).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+optimization+of+a+sensitive+pseudovirus-based+assay+for+HIV-1+neutralizing+antibodies+detection+using+A3R5+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Vaccines+%26+Immunotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Development and optimization of a sensitive pseudovirus-based assay for HIV-1 neutralizing antibodies detection using A3R5 cells.</a> Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (1), 199-208 (2018).</li>
<li>Gauger, P. C., Vincent, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+virus+neutralization+assay+for+detection+and+quantitation+of+serum+neutralizing+antibodies+to+influenza+A+virus+in+swine%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Serum virus neutralization assay for detection and quantitation of serum neutralizing antibodies to influenza A virus in swine.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 2123, 321-333 (2020).</li>
<li>Miglietta, R., Pastori, C., Venuti, A., Ochsenbauer, C., Lopalco, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergy+in+monoclonal+antibody+neutralization+of+HIV-1+pseudoviruses+and+infectious+molecular+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Synergy in monoclonal antibody neutralization of HIV-1 pseudoviruses and infectious molecular clones.</a> Journal of Translational Medicine. 12 (1), 346(2014).</li>
<li>Chen, M., Zhang, X. -E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+applications+of+SARS-CoV-2+pseudoviruses%3A+A+mini+review%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Construction and applications of SARS-CoV-2 pseudoviruses: A mini review.</a> International Journal of Biological Sciences. 17 (6), 1574-1580 (2021).</li>
<li>Zipeto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+human+immunodeficiency+virus+neutralizing+antibodies+using+fusion+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Induction of human immunodeficiency virus neutralizing antibodies using fusion complexes.</a> Microbes and Infection. 8 (6), 1424-1433 (2006).</li>
<li>WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard. , https://covid19.who.int (2022).</li>
<li>Zhou, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pneumonia+outbreak+associated+with+a+new+coronavirus+of+probable+bat+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin.</a> Nature. 579 (7798), 270-273 (2020).</li>
<li>Chen, X., Huang, H., Ju, J., Sun, R., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+vaccination+on+the+COVID-19+pandemic+in+U.S.+states%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Impact of vaccination on the COVID-19 pandemic in U.S. states.</a> Scientific Reports. 12 (1), 1554(2022).</li>
<li>Stefani, C., Fantoni, T., Bissoli, M., Thomas, J., Ruggiero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+and+SARS-CoV-2+Co-Infection%3A+From+Population+Study+Evidence+to+In+Vitro+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Life%22%5BJournal%5D)">HIV and SARS-CoV-2 Co-Infection: From Population Study Evidence to In Vitro Studies.</a> Life. 12 (12), 2089(2022).</li>
<li>Watson, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+impact+of+the+first+year+of+COVID-19+vaccination%3A+a+mathematical+modelling+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Global impact of the first year of COVID-19 vaccination: a mathematical modelling study.</a> The Lancet Infectious Diseases. 22 (9), 1293-1302 (2022).</li>
<li>Cantoni, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+antibody+neutralisation+activity+against+SARS-CoV-2+variants+and+seasonal+human+coronaviruses+NL63%2C+HKU1%2C+and+229E+induced+by+three+different+COVID-19+vaccine+olatforms%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Analysis of antibody neutralisation activity against SARS-CoV-2 variants and seasonal human coronaviruses NL63, HKU1, and 229E induced by three different COVID-19 vaccine olatforms.</a> Vaccines. 11 (1), 58(2023).</li>
<li>Siracusano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+decay+of+antibody+response+and+VOC+sensitivity+in+na%C3%AFve+and+previously+infected+subjects+at+15+weeks+following+vaccination+with+BNT162b2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Different decay of antibody response and VOC sensitivity in naïve and previously infected subjects at 15 weeks following vaccination with BNT162b2.</a> Journal of Translational Medicine. 20 (1), 22(2022).</li>
<li>Ruggiero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+vaccination+elicits+unconventional+IgM+specific+responses+in+na%C3%AFve+and+previously+COVID-19-infected+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22eBioMedicine%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 vaccination elicits unconventional IgM specific responses in naïve and previously COVID-19-infected individuals.</a> eBioMedicine. 77, (2022).</li>
<li>Piubelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subjects+who+developed+SARS-CoV-2+specific+IgM+after+vaccination+show+a+longer+humoral+immunity+and+a+lower+frequency+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22eBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Subjects who developed SARS-CoV-2 specific IgM after vaccination show a longer humoral immunity and a lower frequency of infection.</a> eBioMedicine. 89, 104471(2023).</li>
<li>Zhang, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectivity+of+pseudotyped+SARS-CoV-2+variants+of+concern+in+different+human+cell+types+and+inhibitory+effects+of+recombinant+spike+protein+and+entry-related+cellular+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">Infectivity of pseudotyped SARS-CoV-2 variants of concern in different human cell types and inhibitory effects of recombinant spike protein and entry-related cellular factors.</a> Journal of Medical Virology. 95 (1), e28437(2023).</li>
<li>da Costa, K. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+A+%28N1-N9%29+and+Influenza+B+%28B%2FVictoria+and+B%2FYamagata%29+neuraminidase+pseudotypes+as+tools+for+pandemic+preparedness+and+improved+influenza+vaccine+design%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Influenza A (N1-N9) and Influenza B (B/Victoria and B/Yamagata) neuraminidase pseudotypes as tools for pandemic preparedness and improved influenza vaccine design.</a> Vaccines. 10 (9), 1520(2022).</li>
<li>Condor Capcha, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+SARS-CoV-2+spike+pseudotyped+virus+for+viral+entry+and+neutralization+assays%3A+a+1-week+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Generation of SARS-CoV-2 spike pseudotyped virus for viral entry and neutralization assays: a 1-week protocol.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 7, 618651(2021).</li>
<li>Diomede, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doxycycline+inhibition+of+a+pseudotyped+virus+transduction+does+not+translate+to+inhibition+of+SARS-CoV-2+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Doxycycline inhibition of a pseudotyped virus transduction does not translate to inhibition of SARS-CoV-2 infectivity.</a> Viruses. 13 (9), 1745(2021).</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。

尽管使用野生型病毒可以模拟真实的感染过程，但慢病毒假病毒（lentiviral PVs）是一种更安全的选择，可用于研究与病毒进入和感染相关的机制，同时无需满足处理致病性病毒所需的严格安全要求4,20,21。假病毒由复制缺陷型的病毒核心组成，其外层包裹着作为研究对象的致病性病毒的表面包膜糖蛋白。
基于HIV-1的假病毒（PVs）是最广泛使用的平台之一，本实验方案中即采用该平台生产SARS-CoV-2假病毒颗粒。报告基因可根据假病毒的用途而有所不同；本方案中选用荧光素酶报告基因，可对所产假病毒的感染性提供简便、快速且灵敏的检测读数。

基于慢病毒的假病毒（PV）被广泛应用于研究抗HIV-1体液免疫反应22。在由SARS-CoV-2引起的近期CO...

假病毒（PVs）是微生物学中用于研究宿主-病毒以及病原体-病原体相互作用的分子工具1,2,3,4。PVs 包含一个内层部分，即保护病毒基因组的病毒核心，以及一个外层部分，即位于病毒表面决定其嗜性的包膜糖蛋白5。假病毒在靶细胞中不具备复制能力，因其不包含生成新病毒颗粒所需的全部遗传信息。这种独特的特性组合使 PVs 成为野生型病毒的一种安全替代方案。而野生型病毒具有高度致病性，不能在 BSL 2 实验室中用于分析6。
可通过报告基因监测假病毒（PVs）的感染性，该基因通常编码荧光蛋白（GFP、RFP、YFP）或产生化学发光产物的酶（荧光素酶）。该报告基因包含在用于假病毒生产的质粒之一中，并被整合至假病毒的基因组中7。
目前存在多种类型的假病毒（PV）核心，包括基于HIV-1基因组的慢病毒衍生颗粒。相较于其他载体平台，基于HIV-1的假病毒最大的优势在于其能够天然地整合到靶细胞的基因组中。8尽管HIV-1是一种高度传染性的病毒，也是导致艾滋病的病原体，但由于多年来对慢病毒载体进行了大量优化，这些载体在使用上是安全的。随着引入2nd-代慢病毒载体，其中病毒基因被剔除，但不影响转导能力9. 3rd 和 4th 多代技术改进通过将慢病毒基因组进一步拆分至不同的质粒中，提高了慢病毒载体操作的安全性10, 11最新一代的PVs通常用于生产慢病毒载体以进行基因治疗。
假病毒（PV）可用于研究病毒与宿主细胞之间的相互作用，涵盖病毒的产生和感染两个阶段。假病毒尤其常用于假病毒中和试验（PVNA）。PVNA已得到广泛验证，通过靶向假病毒包膜上的病毒糖蛋白，来评估血清或血浆的中和能力12,13。中和活性以50%抑制浓度（IC50）表示，定义为阻断50%病毒颗粒进入细胞所需的血清/血浆稀释度14。在本实验方案中，我们描述了一种PVNA的建立方法，用于检测在接受加强疫苗接种前后采集的血清中针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的抗体活性。

<table><tbody><tr><td>0.45 &amp;mu;m 滤膜</td><td>SARSTEDT</td><td>83 1826</td><td></td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>SARSTEDT</td><td>83 3920</td><td></td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>SARSTEDT</td><td>8,33,924</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 离心过滤装置</td><td>Merck</td><td>10403892</td><td></td></tr><tr><td>黑色不透光 96 孔微孔板</td><td>Perkin Elmer</td><td>60005270</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 培养基（Dulbecco 改良 Eagle 培养基）&amp;nbsp;</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>D6546 - 500ML</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（Dulbecco's PBS 1x）</td><td>AUROGENE</td><td>AU-L0615-500</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>AUROGENE</td><td>AU-S1810-500</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism 7 版本</td><td>graphpad dotmatics</td><td>NA</td><td>在稿件中，我们用“数据分析程序”替代该商品名</td></tr><tr><td>HEK293T 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T/ACE2 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>HEK293T 细胞通过慢病毒载体转导以过表达 ACE2。</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺&amp;nbsp;</td><td>AUROGENE</td><td>AU-X0550-100</td><td></td></tr><tr><td>酶标仪 - Victor3</td><td>Perkin Elmer</td><td>HH35000500</td><td>在稿件中，我们用“酶标仪&amp;nbsp;”替代该商品名&#039;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Opti-MEM 培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11058021</td><td>在稿件中，我们用“低血清培养基&#039;&amp;nbsp;”替代该商品名</td></tr><tr><td>p8.91 包装质粒</td><td>Di Genova 等，2021</td><td></td><td>由 Nigel Temperton 教授惠赠（参考文献 16）</td></tr><tr><td>pCSFLW 报告质粒</td><td>Di Genova 等，2021</td><td></td><td>由 Nigel Temperton 教授惠赠（参考文献 16）</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>AUROGENE</td><td>AU-L0022-100</td><td></td></tr><tr><td>支化聚乙烯亚胺（PEI）（25 kDa）</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>RRL.sin.cPPT.SFFV/Ace2.IRES-puro.WPRE（MT126）</td><td>Addgene</td><td>145839</td><td>该质粒用于构建 HEK293T/ACE2 细胞</td></tr><tr><td>表达 SARS-CoV-2 刺突蛋白的质粒</td><td>Addgene</td><td>pGBW-m4137382</td><td></td></tr><tr><td>Steadylite Plus 报告基因检测试剂盒</td><td>Perkin Elmer</td><td>6066759</td><td>在稿件中，我们用“荧光素酶读数试剂”替代该商品名</td></tr><tr><td>胰蛋白酶 EDTA 1x</td><td>AUROGENE</td><td>AU-L0949-100</td><td></td></tr></tbody></table>

假病毒作为通过中和试验监测针对sars-cov-2体液免疫应答的分子工具

Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay

假病毒（PVs）是一种分子工具，除在基因治疗中用于递送目的基因这一较为人熟知的应用外，还可用于研究宿主与病毒之间的相互作用，并检测血清样本的中和能力。假病毒不具备复制能力，因为其病毒基因组被分割在不同的质粒中，且这些质粒不会被整合进假病毒颗粒中。这一安全且多功能的系统使得假病毒可在生物安全二级实验室中使用。本文介绍一种基于三种质粒的慢病毒假病毒通用制备方法：（1）携带报告基因的骨架质粒，用于监测感染过程；（2）包装质粒，携带生成假病毒所需的所有结构蛋白基因；（3）包膜表面糖蛋白表达质粒，决定病毒的嗜性并介导病毒进入宿主细胞。在本研究中，使用严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）刺突蛋白作为包膜糖蛋白，用于制备非复制型SARS-CoV-2假病毒慢病毒。
简而言之，采用标准方法将三种不同的质粒共转染至包装细胞（HEK293T）中。转染48小时后，收集含有假病毒（PVs）的上清液，过滤后储存于-80 °C。通过检测感染后48小时靶细胞系中报告基因（荧光素酶）的表达情况，来评估SARS-CoV-2假病毒的感染性。相对发光单位（RLUs）数值越高，表明感染/转导效率越高。此外，将具有感染性的假病毒加入系列稀释的血清样本中，以研究假病毒进入靶细胞过程中的中和作用，该过程通过RLU强度的降低来衡量：RLU值越低，代表中和活性越高。

本方案描述了SARS-CoV-2假病毒（PVs）的制备方法，以及将这些假病毒用于分析接种抗COVID-19疫苗个体血清/血浆中和活性的下游应用17。此外，本方案还可用于制备每种受关注的SARS-CoV-2变异株（VOC）的假病毒，以检测中和反应的演变情况。尽管本方案主要用于促进对COVID-19疫苗接种后体液免疫应答的研究，但也可经适当调整，用于便捷地检测不同血清/血浆对多种病毒的中和能力13,18,19。
图4A 显示了血清稀释倍数（Log(稀释倍数)）随相对光单位（RLU）信号增加而变化的情况。因此，样本稀释倍数越高，病毒进入被抑制的程度越低（图4A）。这一结果进一步以中和百分比的形式表示（<strong class="xfig...

假病毒（PVs）是一类复制缺陷型病毒颗粒，可用于在比操作真实病毒更安全的条件下研究宿主与病毒之间的相互作用。本文展示了一项详细方案，说明如何利用SARS-CoV-2假病毒检测新冠疫苗接种后患者血清的中和能力。

假病毒作为通过中和试验监测针对SARS-CoV-2体液免疫应答的分子工具

假病毒（PVs）是一种分子工具，可用于研究宿主与病毒之间的相互作用，并检测血清样本的中和能力，在……

假型病毒是可用于研究宿主与病毒相互作用以及检测血清样本中和活性的分子工具。在我们今天介绍的工作中，将展示一种基于三种质粒生产假型病毒的通用方法。在中和实验中，通常使用Y型病毒，但这类病毒具有高度致病性，无法在生物安全二级（BSL-2）实验室中操作，限制了该系统的大规模应用。假病毒技术相比活病毒更为安全，可用于研究病原体与宿主之间的相互作用，并检测抗体的中和活性。后续实验将利用假病毒技术，探究特定抗体在疫苗接种后维持免疫应答中的作用。首先，在6孔板中接种1毫升人胚胎肾293T细胞。加入2毫升完全DMEM培养基。第二天，更换为新鲜的无抗生素培养基，以准备细胞进行转染。为了转染贴壁细胞，首先准备混合液A：将质粒DNA加入100微升Opti-MEM培养基中。接下来，向100微升Opti-MEM中加入17.5微升聚乙烯亚胺。混合A和B组分的内容物，然后进行孵育。孵育期间，每隔三到四分钟轻轻振荡试管以增强混合效果。将混合物的全部体积加入含有 HEK 293T 细胞的培养板中。转染后 16 至 20 小时，更换为新鲜的完全 DMEM 培养基。将培养板置于 37°C、5% CO₂ 条件下孵育，以产生假型病毒。转染72小时后，将上清液收集至收集管中。在室温下以1600 G离心7分钟。随后通过0.45微米的醋酸纤维素滤膜过滤上清液。在96孔板的各孔中加入50微升完全DMEM培养基。A行各孔留空。在A行各孔中加入100微升假病毒原液。随后用移液器将A行各孔中的50微升溶液转移至B行。重复此操作至G行，以获得系列稀释液。从培养有易感性 HEK 293T ACE2 细胞的培养板中移除耗尽的培养基，并用 4 毫升 DPBS 洗涤细胞。随后用 1 毫升含胰蛋白酶-EDTA 的 DPBS 盐溶液消化细胞使其脱离。然后将 50 微升易感细胞悬液加入含有假型病毒的每孔中。将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育48小时。向每孔加入100微升荧光素酶试剂。孵育结束后，将每孔内容物转移至黑色96孔板，然后使用酶标仪读取结果。在96孔板中，向B至H行的第一至第十列每孔加入50微升新鲜的完全DMEM培养基。向A行对应孔中加入95微升新鲜的完全DMEM培养基。向第11列各孔加入50微升完全DMEM培养基，向第12列各孔加入100微升DMEM培养基。用移液器向A行各孔加入5微升热灭活的血清样本。使用多通道移液器混匀第一行样本，然后将含血清的培养基从A行转移50微升至B行，依次转移至H行。向第1至第11列的每个孔中加入50微升含稀释假病毒的培养基。将该板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育1小时。将易感的 HEK 293T ACE2 细胞重悬于 5 毫升培养基中。每孔加入 50 微升细胞悬液，孵育后进行荧光素酶检测。血清稀释度越低，病毒进入细胞的程度越低。这通过中和作用百分比的增加得到证实。

pseudotyped-viruses-as-molecular-tool-to-monitor-humoral-immune

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

假型病毒作为通过中和测定监测针对 SARS-CoV-2 的体液免疫反应的分子工具

来源：Kelly Da Costa1, Diego Cantoni1,2, Martin Mayora-Neto1, Tobia Fantoni1,3, Nigel...

评估功能性SARS-CoV-2中和抗体

本方案介绍了一种快速且有效的检测方法，通过评估恢复期血清样本抑制携带刺突糖蛋白的增强型绿色荧光蛋白标记的水疱性口炎病毒假病毒入侵的能力，来测定针对SARS-CoV-2刺突蛋白的中和抗体水平。...

利用高通量荧光成像检测SARS-CoV-2中和抗体的假病毒侵染

本方案描述了一种新型杂合阿尔法病毒-SARS-CoV-2假病毒（Ha-CoV-2）的应用，该平台可用于快速定量SARS-CoV-2变异株的感染性及其对中和抗体的敏感性。...

Ha-CoV-2假病毒在SARS-CoV-2变异株及中和抗体快速定量中的应用

本文介绍了利用荧光素酶报告系统制备SARS-CoV-2假病毒颗粒的方法及其在筛选病毒进入抑制剂中的应用。本方案以两种不同的进入抑制剂为例进行演示：重组人ACE2-Fc融合蛋白和小分子化合物阿比多尔。...

使用基于MLV的假病毒鉴定SARS-CoV-2进入抑制剂作为潜在抗病毒药物的实验方案

利用酶联免疫斑点试验可实现对特发性疾病中适应性免疫的微生物靶标进行鉴定。...

酶联免疫斑点试验（ELISPOT）：针对微生物抗原的Th-1型细胞免疫反应的定量分析

Tregs 是免疫系统的强效抑制细胞。由于缺乏定义 Tregs 的特异性表面标志物，因此对 Tregs 的定义主要基于其功能。本文描述了一种优化的 体外...

人类 体外 抑制作为识别免疫失衡早期状态的筛选工具

我们描述了一种定性检测方法，用于监测由细菌介导的竞争现象 铜绿假单胞菌 VI型分泌系统（T6SS）。该实验依赖于携带特定质粒的大肠杆菌（Escherichia coli）靶细胞的存活/杀伤情况...

一种用于监测T6SS介导的细菌竞争的可视化检测方法

我们介绍一种快速的基于分子检测的甲型与乙型流感病毒检测方法。该流感检测方法采用针对流感病毒特异性引物的等温扩增技术，结合分子信标探针进行靶标检测，可在15分钟内分别检测出甲型和乙型流感病毒。该甲型与乙型流感病毒检测方法操作简便，实验人员所需操作时间极少。...

快速分子检测与区分甲型和乙型流感病毒

定量微量中和试验的优化

该调理吞噬杀伤试验用于比较吞噬性免疫细胞在不同处理和/或条件下对细菌的应答及杀伤能力。传统上，该试验作为评估针对细菌产生的抗体作为调理素时其效应功能的金 标准。...

评估针对细菌病原体免疫应答的调理吞噬杀伤试验

了解利用假型病毒技术进行SARS-CoV-2中和抗体检测的方法。该方法采用三质粒系统在HEK 293T细胞中生产假病毒，为疫苗接种后体液免疫监测提供安全可靠的替代方案。

假病毒作为通过中和试验监测针对SARS-CoV-2体液免疫应答的分子工具

探索更多视频