分离特定下丘脑神经元用于激素、代谢和电生理调控研究

我们的研究范围是探讨代谢紊乱与下丘脑功能障碍之间的关系。我们致力于研究靶向的原代哺乳动物下丘脑神经元的生化与细胞机制，特别是表达瘦素受体的神经元。下丘脑是一个复杂的脑区，参与调控摄食、睡眠、动机以及代谢的维持。

这表明存在一个高度多样化的神经元群体。其中仅有少数细胞类型被深入研究，而大多数其他细胞类型仍需进一步探索，其细胞机制也有待进一步阐明。下丘脑神经元及其功能主要通过电生理学、化学遗传学和光遗传学进行研究。

这些技术对于理解动物行为和脑环路具有重要的信息价值。然而，目前对驱动这种行为的细胞和分子机制仍知之甚少。只有深入到细胞水平进行研究，才能弥补这些知识空白。

首先，使用本生灯对三支巴斯德移液管进行火焰抛光，使其尖端直径依次减小。接着，用70%乙醇对已处死的妊娠小鼠腹部进行消毒。从耻骨联合处沿中线切开腹腔，直至剑突位置。

现在将子宫角从腹腔中取出，并置于含有冰冷HBSS溶液的100毫米培养皿中。使用精细镊子从清洗过的子宫中取出并分离所有胚胎。迅速将取出的小鼠胚胎去头，并将头部放入盛有HBSS溶液的60毫米培养皿中。

用一对精细镊子插入眼腔以固定脑组织，再用另一对镊子剥离皮肤和颅骨，直至脑组织暴露。从颅骨中将脑组织连同嗅球一并取出，并将其翻转倒置。

观察腹侧的皮层和背侧的下丘脑。使用弯头镊子去除脑膜和血管层，直至脑组织呈现白色且清晰，然后将下丘脑区域与脑的其余部分分离。将下丘脑切成三到四个细小的组织块，并用移液器将组织块转移至15 mL离心管中。

接下来，向离心管中加入 6 毫升 HBSS。待组织沉淀并去除上清液后，加入酶混合液一。将离心管置于 37 摄氏度水浴中孵育 15 分钟，每 5 分钟振荡一次，以重新悬浮组织。

现在加入30 µL酶混合液二，使用大口径移液枪头通过上下吹打10次来解离组织。再经过10分钟孵育后，加入剩余的15 µL酶混合液二。使用两个直径逐渐减小的火焰抛光移液枪头，将组织吹打10次。

立即向离心管中加入10毫升含0.5% BSA的HBSS，然后在室温下以300 G离心10分钟。吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于1毫升含0.5% BSA的HBSS中。首先将分离得到的脑细胞悬液在300 G下离心8分钟。

将沉淀重悬于80微升含0.5% BSA的HBSS溶液中。加入20微升非神经元细胞生物素抗体混合液，进行孵育。用2毫升含0.5% BSA的HBSS洗涤细胞，然后将离心沉淀重悬于80微升含0.5% BSA的HBSS中。

现在加入 20 µL 抗生物素微珠，并用移液器充分混匀。冷孵育后，加入 0.5 mL HBSS/BSA 溶液。在用 0.5 mL 含 0.5% BSA 的 HBSS 溶液冲洗柱子之前，先安装好支架。

接下来，将一个15毫升离心管置于柱下，使0.5毫升细胞悬液通过柱体。用0.5毫升含0.5% BSA的HBSS溶液洗涤三次，以收集残留的神经元细胞。从磁铁上取下柱子，放入一个新的15毫升离心管中。

加入1毫升含0.5% BSA的HBSS，用移液器收集磁标记的非神经元细胞。细胞离心后，将细胞重悬于1毫升含0.5% BSA的HBSS溶液中。在明场显微镜下使用Neubauer计数板对细胞进行计数。

LepR阳性神经元在48小时后开始形成神经突。在体外培养第4天（DIV4），轴突延伸取得进展，而树突样结构开始出现。在体外培养第6天（DIV6），神经元已充分发育。

免疫荧光研究表明，未观察到胶质细胞或其他非神经元细胞。通过微管相关蛋白-2染色证实了细胞的神经元特性。在DIV10时，30%的LepR阳性细胞表达POMC。

在包含异质性下丘脑神经元群体的一般培养物中观察突触连接性和功能。首先将小鼠纯神经元细胞悬液在300 G条件下离心8分钟。轻柔吸除上清液，并将沉淀物重悬于80微升含0.5 BSA的HBSS溶液中。

加入特异性抗体后，将试管在4摄氏度下孵育10分钟。用HBSS/BSA溶液洗涤未结合的抗体，并进行离心。向重悬于HBSS/BSA中的沉淀物中加入20 µL抗生素和微珠。

将试管在4°C下孵育10分钟。然后，每10⁷个细胞加入0.5毫升含0.5% BSA的HBSS溶液。用0.5毫升含0.5% BSA的HBSS溶液冲洗柱子。

待滴液停止后，将一个15毫升离心管置于柱下，加入0.5毫升细胞悬液过柱。收集含有非特异性神经元细胞的流出液，然后用含0.5% BSA的HBSS溶液洗涤柱子三次，每次0.5毫升。随后，将柱子从磁铁上取下，放入一个新的15毫升离心管中。

加入1毫升含0.5% BSA的HBSS，用移液器冲出目标细胞。离心并吸除上清液后，将沉淀重悬于0.5毫升培养基中。在明场显微镜下使用Neubauer计数板对细胞进行计数。

将靶细胞作为阳性对照，非特异性细胞作为阴性对照，接种于已准备好的24孔板中。在37摄氏度下孵育12小时。LepR阳性神经元在48小时后开始形成神经突。

在DIV4时，轴突延伸已有所进展，而树突开始出现。在DIV6时，神经元已充分发育。免疫荧光研究表明，未观察到胶质细胞或其他非神经元细胞。

通过微管相关蛋白-2染色确认了细胞的神经元特性。在体外培养第10天（DIV 10），30%的LepR阳性细胞表达POMC。在包含异质性下丘脑神经元群体的普通培养物中，观察到突触连接性和功能性。